במאמר זה, אנו מציגים שיטה לניתוח microvessels גידול in vivo באמצעות videomicroscopy הקרינה משופרת ניגודיות דינמי. שני פרמטרים כמותיים נרכשו: צפיפות תפקודית נימים המשקפת את כלי הדם של הגידול, וזליגת מדד המשקפת את הדליפות של קיר אנדותל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy
במאמר זה
סיכום
תקציר
confocal הקרינה בתחום ההדמיה vivo fibered עם צרור סיבים אופטי משתמשת באותו העיקרון כמו מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי. זה יכול לרגש את הניאון באלמנטים באתרו דרך הסיבים אופטיים, ולאחר מכן להקליט חלק מהפוטונים הנפלטים, דרך אותו הסיבים אופטיים. מקור האור הוא לייזר ששולח אור המרגש באמצעות אלמנט בתוך צרור הסיבים וכמו סריקות על המדגם, משחזר פיקסל תמונה בפיקסל. כסריקה זו מהירה מאוד, על ידי שילוב עם תוכנת עיבוד תמונה ייעודית, ניתן לקבל תמונות בזמן אמת עם תדר של 12 מסגרות / sec.
פיתחנו טכניקה לאפיון מורפולוגיה נימים ותפקוד כמותית, באמצעות מכשיר videomicroscopy הקרינה confocal. השלב הראשון בניסוי שלנו היה לרשום 5 סרטי שניות בארבעה הרביעים של הגידול כדי להמחיש את רשת הנימים. כל הסרטים עובדו באמצעות תוכנה (אניmageCell, מאונה קיאה טכנולוגיה, פריז צרפת) שמבצעת פילוח אוטומטי של כלי סביב קוטר בחר (10 מיקרומטר במקרה שלנו). לפיכך, אנו יכולים לכמת את "הצפיפות תפקודית נימים", שהוא היחס בין שטח הכלי המוחלט והשטח הכולל של התמונה. פרמטר זה היה סמן הפונדקאי לצפיפות כלי הדם, נמדד בדרך כלל תוך שימוש בכלים לפתולוגיה.
הצעד השני היה להקליט סרטים של הגידול מעל 20 דקות לכמת דליפת חומר ניגוד macromolecular של דרך קיר הנימים לתוך interstitium. על ידי מדידת היחס בין עוצמת אות בinterstitium על זה בכלי, "זליגת מדד 'הושגה, הפועלת כסמן הפונדקאי לחדירות נימים.
מבוא
אנגיוגנזה היא תהליך מורכב 1 המערב את היווצרותם של כלי דם חדשים מכלי קיימים מראש. שינויים פתולוגיים בזרימת דם לרקמות, מורכבים מarterioles, נימים, וvenules, הם מעורבים במגוון רחב של מחלות כגון סרטן, דלקת, או סוכרת. לכן זה חיוני כדי לפתח שיטות להערכת מבנה דם קטן ותפקוד כמותית. הדמיה מאפשרת המחקר של microvessels באופן שאינו או מייקר פולשנית, בזמן אמת וin vivo, וצעדים חוזרים ונשנים לאורך זמן באותה החיה 2.
נכון לעכשיו, הדמיה דינמית משופר לעומת זאת, (DCE) 3 משמשת בדרך כלל כדי להעריך את זרימת דם לרקמות. הדמיה משופרת ניגודיות דינמי היא טכניקה העוקבת לאורך זמן biodistribution של נותב מוזרק לווריד. מרכישה זו, ניתן לחלץ פרמטרים כמותיים המשקפים כלי דם לרקמות. הדמיה DCEכבר משמש לרוב עם CT, MRI או אולטראסאונד. עם זאת, שיטות ההדמיה הללו אינן מאפשרות צפייה ישירה של microvessels, שכן ברזולוציה שלהם, אלא בשימוש במכשירי ניסוי ספציפיים, לרוב נשארת מקרוסקופית.
במאמר זה, אנו מציעים ללמוד את כלי הדם של גידול בקנה המידה המיקרוסקופית וin vivo באמצעות דימות אופטי משופר ניגודיות דינמי, עם videomicroscopy confocal fibered. אנו משמשים חומר ניגוד macromolecular (FITC-dextran) אשר נשאר אך ורק בתוך כלי או דליפות דרך מחסום האנדותל לתוך interstitium, על פי המשקל המולקולרי שלו ואת המאפיינים של האנדותל של הרקמה למדו 4. זו אפשרה המחקר של שני מבנה הדם הקטן, על ידי כראוי מגדיר כלי, וחדירות נימים, על ידי הדלפה והצבירה בinterstitium.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חומר הניגוד
- לFITC-dextran 70 kDa, חומר המוזרק הוא 500 מ"ג / קילוגרם (10 מ"ג FITC-dextran בדילול מלא ב0.1 מיליליטר של תמיסת מלח לעכבר במשקל 20 ז).
- הסוכן לא צריך להיות חשוף יותר מדי זמן לאור. כדי להימנע מהלבנה, מומלץ לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום.
2. הרדמה
- עכברים מורדמים בזריקת intraperitoneal של תערובת של 1:4 של xylazine (Rompun 2%, באייר, Puteaux, צרפת) וקטמין (קטמין 500, Virbac, Carros, צרפת), בהתאמה 66 מ"ג / קילוגרם ו264 מ"ג / קילוגרם לעכבר 20 גרם.
3. הכנת האיבר של עניין
- גלחנו את העכברים במיקום של עניין (למשל, מעל גידול תת עורי). שיער בעלי החיים הוא לעתים קרובות אוטומטי ניאון כאשר לבן. כאשר שחור, היא סופגת את אור.
- העור מול האיבר להיות צילם היה חרות. חשוב לחכות עד המחורבןגרם הפסיק לפני הזרקת חומר הניגוד, אחר זה ידלוף בדם ולזהם את התמונה.
4. רכישה
- חומר הניגוד שהוזרק או דרך וריד הצוואר או וריד הזנב. אין או אות קצת רקע יש באיבר שנצפה בהיעדר חומר ניגוד ניאון של.
- החללית הייתה להציב מול האיבר להיות צילם. במחקר שלנו, זה היה הגידול.
- הלייזר היה מופעל כדי להאיר את הגידול ולראות את הקרינה בנימי הדם.
- הגידול שנחקר באופן ידני על ידי הזזת החללית בתנועה איטית מאוד בעת ההקלטה כדי להמחיש את רשת הנימים. זה חשוב לשמור על יד יציבה, וטכניקה זו דורשת ניסיון מועט. במחקר שלנו, צעד ראשון זה אפשר כימות של צפיפות נימים פונקציונלית.
- הצעד השני היה הרכישה הדינמית לאורך זמן. במחקר זה, אנו משמשים 70 kDa FITC-dextran. אין זליגת ביניים ברוב האיברים נורמלים אבל יש בגידולים. לרכוש תמונות מאותו המיקום לאורך זמן (כמו במקרה שלנו), חשוב להגדיר את מערכת כדי לשמור את החללית על השטח של עניין. הדבר נעשה על ידי שימוש בתמיכה בעבודת יד כדי להחזיק את החללית, ועל ידי הצבת קצת ג'ל אולטרסאונד על הקצה של החללית. לפני ההקלטה, זמן הוקדש כדי לייצב את החללית הציבה במגע עם הגידול. ברגע שהמצב היה מאובטח, הייתה תנועה מינימאלית רק בשל נשימותיו של העכבר. הלייזר היה מופעל כדי להקליט 3 תמונות בכל 30 שניות ל20 דקות כדי לזהות הנוכחות של דליפת נימים. זה היה כבוי בין כל הקלטה כדי להפחית הלבנת חומר ניגוד.
- בניסוי שלנו, עכברים הוקרבו בסוף ההליך לניתוח היסטולוגית של גידולים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בנתונים שנאספו, אנחנו יכולים לנתח כמותית פרמטרים שונים המשקפים את זרימת דם.
למדנו בvivo רשת כלי הדם ההיקפי של גידול במעי הגס שהושתל בעכברי BALB-c באמצעות מערכת fibered confocal videomicroscopy הקרינה (Cellvizio, Maunakea טכנולוגיה, פריז, צרפת 2), לאחר הזרקת חומר ניגוד ניאון macromolecular של ההעמסה isothiocyanate-dextran ( FITC-dextran) עם משקל מולקולרי של 70 kDa (סיגמא אולדריץ, סנט קוונ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר מייקרו מחזורי גידול הפך להיות חיוני בהבנת הפתופיזיולוגיה של צמיחת גידול, הפצה ותגובה לטיפול 1. הדמיה אופטית היא אחת הטכניקות שיכולים לשמש כדי לבחון את נימי הדם באמצעות חומר ניגוד ניאון ולכמת (צפיפות פונקציונלית נימי) מורפולוגיים ופרמטרים תפקודיים (זליגת מדד).
יש ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי ששמשנו במחקר זה גם יתרונות ומגבלות. אחד יתרונות הוא יכולת לבחור את גודל חומר הניגוד בשימוש של. כאן, עם 70-kD...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אינסולין serynge Myjector 1 מ"ל 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן 70 kDa | סיגמא-אולדריץ' | 01619HH | 100 מ"ג/מ"ל מדולל במי מלח |
| מיקרוסקופיה קונפוקלית סיבים | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| ערכת כיול וניקוי עבור LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | חנות LSU-488 | ב-4 מעלות; C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| תוכנת פסיפס | MaunaKea Technologies | ||
| תוכנה לזיהוי כלי שיט | MaunaKea Technologies |
מקורות
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
