בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

סיכום

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים ריאגנטים, ג elegans עושה אורגניזם מודל אידיאלי עבור In vivo הדמיה עצבית תוך שימוש בטכניקות פשוטות יחסית, בעלות נמוכה. כאן אנו מתארים הדמית נוירון בודדה בתוך בעלי חיים מבוגרים ללא פגע באמצעות אינדיקטורים סיד ניאון מקודד גנטי.

תקציר

נמטודות התולעת ג elegans הוא אורגניזם מודל אידיאלי להדמיה פשוטה יחסית, בעלות נמוכה עצבית בגוף חי. גופו הקטן השקוף ופשוט, מערכת עצבים היטב מאופיינת מאפשר זיהוי והדמית קרינה של כל נוירון בתוך החיים השלמים. טכניקות קיבוע פשוטות עם השפעה מינימאלית על הפיסיולוגיה של בעלי החיים מאפשרות שיקוף מורחב זמן לשגות. הפיתוח של fluorophores הרגיש סיד הגנטי מקודד כגון ¹ Cameleon וGCaMP ² לאפשר בתחום הדמית vivo של סיד עצבי הנוגע גם פיזיולוגיה של תא ופעילות עצבית. זנים מהונדסים רבים מבטאים fluorophores אלה בתאי עצב ספציפיים הם זמינים או ניתן לבנות תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים הליכים מפורטים למדידת דינמיקת הסידן בתוך תא עצב יחיד בגוף החי הוא באמצעות GCaMP וCameleon. אנו דנים ביתרונות וdisadvantגילים גם כן שיטות שונות של הכנת מדגם (קיבוע בעלי חיים) וניתוח תמונה. לבסוף, אנו מציגים תוצאות משני ניסויים: 1) שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של נוירון ספציפי לשדה חשמלי חיצוני ו2) שימוש בCameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית של סיד נוירון לניזק ליזר טראומטי. שיטות הדמית סידן כגון אלה נמצאים בשימוש נרחב בג elegans והורחב למדידות בבעלי חיים שנעו בחופשיות, נוירונים מרובים בו זמנית והשוואה על פני רקע גנטי. ג elegans מציג מערכת חזקה וגמישה להדמיה עצבית vivo עם יתרונות על פני מערכות מודל אחרות בפשטות ועלות טכניות.

מבוא

כאן אנו מציגים שיטות מעשיות לתחום הדמית vivo סיד בג הנוירונים elegans. הפיתוח של fluorophores סיד רגיש המקודד גנטי עם יחס גבוה בין אות לרעש גורם ג elegans מערכת יעילה יחסית פשוטה ועלות למדידת נוירופיזיולוגיה ופעילות. ההדמיה שלנו נעשתה באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי באמצעות דימות פלואורסצנטי שדה הרחב של fluorophores הזמין בדרך כלל. אנו מציגים כמה טכניקות המעסיקות fluorophores שונה ותכשירים שונים לדוגמה, דנים בנקודתי החוזק והחולשה של כל אחד. נתונים שהוצגו אז משני ניסויים לדוגמה. משאב נוסף מצוין בטכניקות המתוארות כאן ניתן למצוא בWormBook, "הדמיה את הפעילות של תאי עצב ושרירים" על ידי ר 'קר, (http://www.wormbook.org ^3).

שני סוגים עיקריים של genetiכתבי סיד ניאון מקודדים קאלי משמשים בדרך כלל בג elegans: GCaMP ערוץ אחד וCameleon סריג מבוסס. אנו מתארים שיטות ולהראות דוגמאות לנתונים שנוצרו על ידי כל אחד.

GCaMP מבוסס על חלבון שונה גרין פלורסנט (GFP), כי הוא רגיש לריכוז הסיד שמסביב. המטרה זו מושגת על ידי שילוב של GFP וcalmodulin חלבון זיקת סידן הגבוה, באופן שמחייב של סידן על ידי calmodulin מביא מולקולת GFP לאישור ניאון יעיל ^2. את הפיתוחים האחרונים בfluorophores אלה יוצרים גודל אות יוצא דופן עם גידול של עד 500% בעוצמת קרינה על פני טווח פיסיולוגי של רמות הסידן וקינטיקה במהירות סבירה של זמן ~ 95 אלפיות עלייה ודעיכה ~ 650 אלפית ^4. על פני תקופות זמן קצרות יחסית (דקות), האותות הגדולים האלה יכולים לאפשר להדמיה ברזולוציה נמוכה יותר (גדלה נמוכה יותר), וניתנו מחונך initמדידת קו הבסיס IAL, שוללת את הצורך הבסיסי רציפות או מדידות השוואתיות.

Cameleon יש את היתרון של להיות fluorophore סריג מבוסס שמייצר מדידת ratiometric השוואה שני ערוצים או אורכי גל ¹ עצמאיים. זה מורכב משני fluorophores הנפרד (חלבוני ניאון וצהוב ציאן פולט, וYFP CFP) מקושר על ידי חלבון calmodulin. המתחם מואר באור כחול (440 ננומטר) שמרגש CFP. עקידת הסיד מביאה את fluorophores ביחד קרוב, הגדלת העברת אנרגית תהודת פלואורסצנטי (סריג) מCFP (תורם) לYFP (acceptor) וגורם לפליטת CFP (480 ננומטר) כדי להקטין וYFP הפליטה (535 ננומטר) כדי להגדיל . רמות סידן יחסיות נמדדות כיחס בין עוצמת YFP / CFP. קינטיקה Cameleon היא איטיות יותר מזה של GCaMP, נמדד בגוף חי יש זמן עלייה של ~ 1 שניות וזמן דעיכה של ~ 3 שניות ^5. עם זאת,היחס של אותות הפוכים נעים מגדיל את גודל האות ומפצה על מספר החפצים אפשריים עקב שינויים בריכוז fluorophore, תנועה או להיסחף פוקוס וההלבנה.

כתבי ניאון מקודד גנטי לשלול הרבה של הכנת המדגם הנדרש עם בדיקות מנוהלות exogenously וג גוף שקוף קטן elegans מאפשר הדמיה תוך שימוש בבעלי החיים בשלמות פלואורסצנטי שדה הרחב פשוט. האתגר הטכני העיקרי בהכנת מדגם לכן, כדי לשתק את החיות בשלום. ישנן מספר טכניקות שונות נפוצים כל אחד עם יתרונות וחסרונות. שימוש תרופתי לשתק את בעלי החיים הוא קל לביצוע ומאפשר הרכבה של חיות מרובות בהכנה אחד (Levamisole, אגוניסט כולינרגית שגורם לרקמת שריר לתפוס הוא בדרך כלל בשימוש ^6). ג elegans גם יכול להיות משותק מבחינה פיזית על ידי הרכבתםעל נוקשה 10% agarose ^{7, 8.} השפעה זו מצמצמת בפיזיולוגית בעלי חיים, מאפשרת הדמיה לטווח ארוך (שעות) והתאוששות של בעלי חיים רבים, אבל הוא יותר קשה מבחינה טכנית. שתי הטכניקות האלה להגביל את הגישה פיזית לבעלי החיים (שהם תחת תלוש כיסוי) ולכן יכולים לשמש רק עם גירויים ניסיוניים מסוימים (כמו אור, טמפרטורת שדה, חשמלי או ניזק ליזר). לגירויים שבו גישה פיזית נדרשת, כגון מגע או ממשל של כימיקלים, מחקרים רבים דבוקים בהצלחה ג elegans במקום (באמצעות דבק כיתת וטרינרית) ^9. זה יותר מאתגר מבחינה טכנית, הוא תכשיר בהמה אחת ולא מאפשר התאוששות של בעלי חיים. לבסוף, מכשירי microfluidic רבים להיות מועסקים כי פיזי לרסן ג elegans, שימור פיזיולוגית בעלי חיים, המאפשר חשיפה למרבית סוגי גירויים (תלוי בעיצוב המכשיר) ויכול לאפשר חליפין והתאוששות מהירים של בעלי החיים ^{10, 11. עם זאת מיקרופלואידיקה דורשת כישורים טכניים נוספים ויכולות בעיצוב, ייצור ויישום. בפעילות וגירוי חיות משותקות תגובה כלל ניתן למדוד בחושי וinterneurons. פעילות של תאי עצב מוטורי דורשת טכניקות מתוחכמות יותר עבור הדמיה בחיות נעות. כאן אנחנו נציג שיטות מפורטות המעסיקות את שתי טכניקות הפשוטות ביותר של השבתה וקיבוע עם agarose הנוקשה תרופתיות.}

השיטות שהוצגו כאן יכולות לשמש למדידת פעילות עצבית ופיזיולוגיה של תא בג elegans. אנחנו נותנים דוגמה לכל אחד: שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של ASJ נוירון לשדה חשמלי חיצוני, ובאמצעות Cameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית לסיד ניזק ליזר של תא עצב. דוגמאות אלו מראות את היתרונות וחסרונות של שני סוגים של fluorophores ולהמחיש מה אפשרי עם המערכת.

פרוטוקול

1. התקנה אופטית

1. השתמש במיקרוסקופ מתחם רגיל עם יכולות הדמיה epifluorescence. אנו משתמשים במיקרוסקופ ניקון אקליפס TI-U הפוך עם פנס HG Intensilight.
2. לתמונה הטובה ביותר ואיכות אות להשתמש הגדלה גבוהה, אובייקטיבי צמצם מספרי גבוהה. אנחנו בדרך כלל משתמשים בניקון אובייקטיבי X60 1.4 NA שמן טבילה. במקרים מסוימים ניתן להשתמש בהגדלה נמוכה (X40, X20) בהתאם לרמת ביטוי של fluorophore ועוצמת אות.
3. השתמש ברגישות גבוהה המקוררת CCD מצלמה, כגון מצלמה יידור קלרה כדי למקסם את רגישות תמונה ולמזער את רעשי רקע.
4. לfluorophores צבע אחד להשתמש במסנן פלואורסצנטי מיקרוסקופ הרגיל להגדיר מיועד לאורך גל המסוים של fluorophore. לGCaMP להשתמש סטנדרטי GFP מסנן מוגדר מותאם לעירור ב488 ננומטר ופליטה ב 525 ננומטר. אין שינויים אופטיים נוספים נדרשים.
5. לfluorophores ratiometric, כגון Cameleon, להשתמש במערכת הדמיה כפולה כך שתמונות זהות יכולות להיות שנתפסו בו זמנית בשני אורכי גל שונים. המטרה זו מושגת על ידי הקרנת התמונות הכפולות Side-by-הלוואי על המצלמה. התקנה פשוטה כדי להשיג את זה, תוך שימוש ברכיבים אופטיים בסיסיים על קרש חיתוך כיתה אופטית, מודגמת באיור 1. זה מורכב מ:
   1. מסנן מיקרוסקופ להגדיר עם 440 ± 20 ננומטר ומסנן עירור 455 ננומטר ארוך לעבור מראה Dichroic.
   2. מסכת תמונה הונחה במטוס התמונה הראשונית מייד מחוץ למיקרוסקופ הדמית נמל (שבו חיישן CCD המצלמה הייתי יושב בדרך כלל). זה מגביל את שדה הראייה כך שזה יהיה למלא רק חצי מחיישן המצלמה. הצבת מסכה זו בתוצאות הראשונות תמונת המטוס בגבולות תמונה חדות וללא חפיפה, כאשר שני תמונותיהם מוקרנות Side-by-צד.
   3. עדשת הממסר הראשונה שנקבעה אורך מוקד אחד במרחק לאהוא מטוס תמונה ראשוני כזו כי זה collimates האור.
   4. מראה Dichroic שמפצל את האור לשני אורכי הגל הנפרדים ההדמיה או ערוצים המשקפים צבע אחד (> 515 ננומטר, צהוב) תוך העברה האחרת (<515 ננומטר, ציאן).
   5. מסנני פליטה (מסנני להקה עוקפת) המגבילים את האור מועבר בהמשך לאורכי הגל הספציפיים ההדמיה (ציאן ב485 ± 40 ננומטר וצהוב ב535 ± 30 ננומטר),
   6. עדשות 2 הממסר (אחד לכל ערוץ) שהונחו במסלולי קרנות כאלה שזה להתמקד במשהו את האור לתמונת מטוס שני במצלמת CCD.
   7. זוג מראות ומראה שנייה Dichroic מכוון מסלולי קרנות כאלה ששני תמונות recombined וצפוי Side-by-צד על חיישן CCD המצלמה. האיור 4A מראה דוגמה של תמונה הנוצרת.
6. מערך אופטי ראשוני: התחל התקנה ויישור של אופטיקה עם ניגודיות גבוהה ולדמייןדואר באמצעות תאורת שדה רחב אור מועבר (sharpie שחור נמתח בשקופית מיקרוסקופ עובד היטב) עדשה והגדלה נמוכה. להביא את התמונה להתמקד דרך oculars מיקרוסקופ ולאחר מכן עבר לנמל מיקרוסקופ כדי לשמש. עם תאורת אור גבוהה להציג את התמונה על כרטיס מדד במישור המוקד הראשוני (כמה סנטימטרים מחוץ לנמל מיקרוסקופ). מניח את עדשת ממסר 1 (ג) בדרך הקורה כזה שזה מרחק מיקוד אחת ממישור המוקד הראשוני וcollimates האור בזמן לא להסיט את נתיב הקרן (כלומר הוא מרוכז בדיוק במסלול הקרן). מניח את המסיכה במישור המוקד הראשון, שהותאם ללהגביל את מחצית שדה הראיה ולייצר דיירת חדה בתמונה. מקם את המראות ומסננים (D, E, G) כאלה שדרך הקרן נותרת מקבילה למשטח השולחן ורצה בשני נתיבים מקבילים Side-by-לוואי, כפי שמוצגת בתרשים 1B. מרכז עדשות 2 הממסר (F) במסלולי הקרנות שלהם ולהעביר אותם הלוך ושוב לאורך השבילים כדי להביא את התמונות להתמקדות בכרטיס אינדקס הציב היו חיישן CCD המצלמה יהיה. אם נעשה בצורה נכונה את שתי תמונות צריכות להיות parfocal עם oculars מיקרוסקופ ונמלים אחרים מצלמה. לבסוף למקם את המצלמה במיקום ולכוונן את היישור.
7. יישור פיין כוונון אופטי: השתמש בתמונה הכפולה שנצפתה על ידי מצלמת CCD לכוונן יישור האופטי. השתמש בתמונת ניגודיות גבוהה ולהתחיל עם גדלה נמוכה יותר, מעבר להגדלה גבוהה ליישור סופי. מקם את התמונה המשודרת (ציאן ערוץ בתרשים 1B) לכיסוי מחצית מהשטח של המצלמה על ידי הזזת המצלמה בעמדה X וי 'הבבואה (ערוץ צהוב בתרשים 1B) כדי לכסות את החצי השני של התחום להציג באמצעות התאמת שתי המראות האחרונות (G) בדרך לאלומה. לייעל להתמקד על ידי הזזת עדשת הממסר השנייה לכל ערוץ הלוך ושוב לאורך דרך הקורה. אם שמאלללא שינוי ההתקנה האופטית צריכה להיות יציבה ורק דורשת הסתגלות לכוונן נדירה.

2. לדוגמא הכנה ואיסוף נתונים.

1. רכישה מבטאות חי fluorophore רגיש הסידן בנוירון ריבית מCaenorhabditis גנטיקת המרכז (CGC) או מקורות אחרים. בעלי חיים מהונדסים לחלופין ניתן לבנות באמצעות התקן ג טכניקות elegans. ביטוי תא בודד לא הכרחי (ולעתים לא רצוי אם נוירונים מרובים הם להיחקר, ראה ¹²⁾ עוד תמונות ומדידות ממספר תאים ניתן להפריד בקלות. אם transgene fluorophore אינו משתלב בגנום, שינוי משמעותי בביטוי יכול להתרחש מחיה לחיה. במקרה זה, preselecting חיות עם רמות ביטוי גבוהות יותר באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון מגדיל את יחס אות לרעש ומשפר את המדידות. רמות ביטוי fluorophore לביתד כדי להיות מספיק כדי להיות צלם בקלות עם המצלמה תחת הפרמטרים לרכישה נדרשים על ידי הניסוי.
2. הפוך את רפידות agarose נדרשות לטכניקת הקיבוע הרצוי (ראה 2.3 להלן) על ידי לחיצה על טיפה קטנה של agarose המותך בין שתי שקופיות זכוכית במרווחים על ידי שתי חתיכות של קלטת מעבדה. במידת צורך, רפידות agarose ניתן להעביר תלוש כיסוי זכוכית לפני שעלה לבעלי החיים. ראה איור 2.
3. לשתק ג elegans להדמיה באמצעות אחת מהשיטות הבאות:
   1. השבתה תרופתית: הוסף Levamisole 0.05% לרפידות agarose 2% (לערבב אותו לתוך agarose המותך לפני ביצוע הרפידות ב2.2). פיק חיות 5-10 על המשטח ולכסות עם פתק כיסוי. החל כמויות קטנות של תערובת שעווה חמה (50% שעוות פרפין ו50% וזלין) לפינות להחליק הכיסוי להחזיק אותו בתפקיד. אפשר דקות 5-10 לLevamisole ייכנס לתוקף והחיות לבecome לחלוטין עדיין.
   2. Immobilization הנוקשה agarose: ג elegans יכול להיות משותק פיזי באמצעות רפידות נוקשות 10% agarose ו0.05 חלקיקי פוליסטירן בקוטר מיקרומטר. הפוך 10% agarose רפידות (10% agarose בחיץ NGM לפי משקל) כמו ב2.2. הוסף ~ 3 μl של פתרון חרוז (1:10 הקלקר microspheres לNGM לפי נפח) לחלק העליון של הכרית. במהירות, לקחת 5-10 ג elegans לתוך הברכה של פתרון חרוז על המשטח ולכסות בעדינות עם פתק כיסוי. השתמש שעווה מותכת להחיל את הפינות של תלוש הכיסוי להחזיק אותו בעמדה. (לפרטים נוספים על טכניקה זו רואה ⁷ כמו גם מאמר קודם של יופיטר ⁸⁾
   3. הדבקה: ג elegans יכול להיות מודבק במקום שימוש בכמויות קטנות של דבק כיתת וטרינרית מוחל על צד אחד של בעלי החיים.
   4. התקני microfluidic: מכשירי microfluidic רבים תוכננו פיזי להחזיק ג elegans במקום להדמיה.
4. הנח את השקף המוכן במיקרוסקופ ולהתמקד בנוירון הרצוי. זה בדרך כלל קל ביותר כדי למצוא את ג elegans באמצעות תאורת שדה בהירה והגדלה נמוכה. אז מעבר להגדלה גבוהה ודימות פלואורסצנטי למצוא ולהתמקד בנוירון הספציפי.
5. גירוי: אם תגובה עצבית לגירוי מסוים היא רצויה (שדה אור, חשמלי, התעוררו אצל רמזים וחוש ריח, וכו 'טמפרטורה), מנגנון התמריצים חייב להיות מתוכנן להתקנת המיקרוסקופ, כך שזה יכול להינתן לבעלי החיים ב הכנת מדגם תוך הדמיה.
6. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת CCD מיקרוסקופ. זמני חשיפה ורמת אור עירור יהיו תלויים באות הבסיסית ורמת ביטוי של fluorophore, עם אותות חלשים הדורשים זמני חשיפה ארוכות יותר עם רזולוצית הזמן concordantly פחות. אנחנו בדרך כלל להשתמש ~ 300 פעמי חשיפת msec.
7. לרכוש תמונות בנפרד או כtiלשגות סרט. בגלל ג הנוירונים elegans בדרך כלל להציג דינמיקת הפעלה איטית (כלומר הם חסרי פוטנציאל פעולה מבוסס נתרן), שיעורי מסגרת איטיים יחסית של ~ 1 שניות הם לעתים קרובות מספיק כדי למדוד את דינמיקת נוירון. שיעורי רכישה עד ~ 90 פריימים לשניים היו בשימוש אם כי אלה עשויים להיות מוגבלים על ידי זמן האינטגרציה ההכרחי לפלואורסצנטי החלש. סרטים בודדים של נוירון בודד יכולים בקלות להרחיב במשך כמה דקות (5-10 דקות ~) או יותר, אם הכנת הקיבוע יציבה וקצב הפריימים איטי יחסית.

3. ניתוח נתונים

1. ישנן מספר החבילות שונות ניאון הדמית תוכנה זמינות עם יכולות ניתוח דינמיות וratiometric כוללים ImageJ ואלמנטי ש"ח. אנו משתמשים בתכנית מותאמת אישית MATLAB פשוטה המודדת את אות הניאון הממוצעת מעל אזור שנבחר מתוך אינטרס.
2. לתמונות בודדות (או סרטי זמן לשגות שנותרומושלם עדיין) בחר אזור של עניין (ROI) בתוך נוירון ההדמיה ואזור סמוך נפרד למדידת הרקע. לתמונות ratiometric בחר ROI דומה ואזורי רקע לכל אחת מהתמונות הכפולות.
3. תנועה קלה של נוירון ההדמיה בתוך סרט זמן לשגות דורשת ניתוח נוסף כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה בכל מסגרת, שניתן להשיג באמצעות תוכניות מעקב אובייקטים רבות באופן אוטומטי. התכנית שלנו מציגה תמונה דחוסה של כל התמונות בסרט שמן הגבול גס (הכולל את האובייקט של אינטרסים בכל המסגרות) נבחר באופן ידני ואזור רקע עצמאי נבחרו. למסגרת הראשונה, החזר על השקעה הוא נבחר באופן ידני מתוך אזור הגבול. עבור כל מסגרת שלאחר מכן, התכנית בוחרת את הפיקסלים הבהירים מתוך אזור הגבול כדי לייצר החזר על השקעה של הגודל הנכון (אותו מספר פיקסלים כמו ROI המסגרת הראשונה הידני כלומר). עבור תמונות שבי object של אינטרסים הוא מספיק בהיר אז הרקע מסביב באזור הגבול בפרוטוקול זה בוחר ROI סביר לכל מסגרת.
4. אות הניאון, F, לכל מסגרת, מחושבת כממוצע עוצמת פיקסל בROI מינוס העצימות הממוצעות באזור הרקע. ערכי Ratiometric מחושבים כיחס בין שני האותות _(רקע YFP-YFP) / _(רקע CFP-CFP) -0.65. הגורם של 0.65 מפצה על לדמם דרכו של ערוץ CFP לתוך תעלת YFP, אשר תהיה תלוי בfluorophores כמו גם להגדיר מסנן מסוים בשימוש (ערך זה הוא בדרך כלל ~ 0.6 עבור setups Cameleon).
5. רמת הסידן ביחס לכל מסגרת מחושבת כאחוז השינוי בעוצמת מנורמלת לערך בסיסי ראשוני נמדד מהפריים הראשון (או סדרה של מסגרות): ΔF / F = (F (t)-F _o) / F _o, כאשר F (t) הוא את הקרינה בזמן t ו F _oהוא הערך הבסיסי ראשוני.
6. ROI בחירת גוף התא מייצר את האותות החזקים ביותר החזקים ביותר, אבל אפשר גם לבחור ולמדוד אותות מהחזר השקעה לאורך התהליכים העצביים.

4. פתרון בעיות

1. הלבנה: חשיפה לאור עירור יכול לגרום להלבנה של fluorophore ומתאפיין בירידה מתמדת באות שתלויה ברמות חשיפה. מדידות Ratiometric לעזור כדי לפצות על זה. עם זאת הלבנה סלקטיבית של אורך גל 1 עדיין יכול להתרחש (בדרך כלל bleaches CFP מהר אז YFP). אם הלבנה מתרחשת לצמצם את רמת חשיפה לאור על ידי צמצום זמני חשיפה ו / או עצימות עירור (עם מסנני צפיפות ניטראליים במסלול התאורה). אם יש צורך, אפשר לפצות על ידי הפעלת הלבנת משפטים מבוימים (עם אותה חשיפת העירור אבל שום גירוי עצבי) וכימות של קבוע הזמן של דעיכת אות.
2. Immobilization: לניתוח התמונה הפשוטה שתואר כאן זה קריטי משרידי בעל חיים יחסית עדיין לאורך כל תקופת הקלטת ג. elegans מגיב לחשיפה לאור וגירויים ניסיוניים, הופך אותם הסיכוי טוב ביותר לעבור בזמן ההקלטה. תנועה קלה יכולה להציג את הרעש משמעותי למדידה במיוחד כאשר מדידה מתהליכי האקסון. ניתוח Ratiometric מסייע להפחית השפעות אלו במידה מסוימת ומדידות מגוף התא הם חזקים יותר. ביצוע וחידוד של נהלי Immobilization זהיר יגרמו לחלוטין עדיין חיות.
3. בחירת רקע: בחירה זהירה של אזור רקע הכרחית לניתוח תמונה מוצלחת. אזורי רקע צריכים להיות סביר ואחידים כהים אז הנוירון ההדמיה. את חייב להסיר מספיק כדי להימנע מאור מפוזר (ולכן טנדר אות) מתא עצב ההדמיה. אנחנו מוצאים את אזור אחיד 20-50 מיקרומטר מROI עובד היטב ברוב המקרים.
4. אופטיקה Ratiometric: יישור נכון של אופטיקה ההדמיה הוא קריטי ליצירת תמונה כפולה ברורה. קבצים מצורפים מיקרוסקופ מסחריים להדמית ratiometric זמינים. טכניקת אלטרנטיבה היא להעסיק הדמיה רציפה מהירה באמצעות גלגל סינון מהיר במהירות כדי לעבור בין אורכי גל פליטה בעת הקלטת תמונות נפרדות עבור כל אחד.
5. ניתוח Ratiometric: הניתוח שתואר כאן הוא טכניקה פשוטה יחסית שיוצרת אותות חזקים מכוח בממוצע על החזר על השקעה. זה דורש אובייקט מוכר כבהיר כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה. עוד הניתוח ratiometric מתוחכם ניתן על ידי יישור בדיוק ומיפוי תמונות כאלה שיחס הניאון יכול להיות מחושב על ידי פיקסל פיקסל הכפולים.

תוצאות

כאן אנו מציגים תוצאות משני ניסויים נפרדים. 1 מעסיק GCaMP למדוד את התגובה של תא עצב תחושתי ספציפי לגירוי חיצוני מוגדר, נותן דוגמה טובה כיצד ניתן להשתמש בו לכתבי סיד ניאון אופטי כדי לעקוב אחר פעילות עצבית בג השלם elegans. 2 מעסיקים Cameleon למדוד סיד החולף התאי מופעל בתוך תא עצב בתגובה לניזק ליזר מסוים, ובכך ממחיש כיצד פיזיולוגית סידן ניתן למדוד בתוך תא בודד בגוף חי. כדי להתמקד בהיבטים הטכניים של כל מדידת תוצאות ניסוי בודדות שהוצגו ונדונו בהרחבה. לעתים קרו...

דיון

אינדיקטורים סיד מקודד גנטי כבר נוצלו באופן נרחב בג elegans נוירוביולוגיה. קבוצות רבות שהעסיקו הטכניקות הללו כדי ללמוד תגובה של תאי עצב התחושתי העיקרי לגירויים חיצוניים כפי שמודגם כאן בתגובת ASJ לשדה חשמלי. דוגמאות בולטות כוללות תחושת המגע מכאני, כימיקלים מסוימים, טמפרטורה ושדה חשמלי ^{12, 16-19.} פעילות של interneuron ותאי שריר יש גם פיקוח גם בתגובה לגירויים ושולטים בהתנהגות של בעלי חיים. רבים ממחקרים אלה דחפו את הטכניקות הללו צעד אחד קדימה באמצעות זיהוי תמונה וטכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Eclipse Ti-U מיקרוסקופ הפוך	ניקון
Intensilight HG תאורה	ניקון	C-HGFI	מקור אור פלואורסצנטי
CFI Plan Apo VC 60X שמן	ניקון
שולחן אופטי או לוח לחם אופטי 3'X3' אופטי	מעבדות		תוראם לא נעשה שימוש בשולחן אופטי לוח לחם אופטי על ספסל מעבדה מוצק > אמור להספיק.
מצלמת אינטרליין קלרה	אנדור טכנולוגיה		מצלמת CCD ברגישות גבוהה
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	סט מסנני GFP להדמיה מסנן GCaMP
440 +/- 10 ננומטר	Chroma	D440/20x EX	למראה דיכרואית של קמליון
> 455 ננומטר מעברים ארוכים	Chroma	455DCLP BS	מיקרוסקופ דיכרואי לקמלאון הדמיה
מראה דיכרואית > 515 ננומטר מעברים ארוכים	Chroma	515DCLP BS	מראה דיכרואית לקמלאון מסנן הדמיה
535 +/- 15 ננומטר	Chroma	D535/30m EM	YFP מסנן פליטה
480 +/- 20 ננומטר	Chroma	D485/40m EM	CFP מסנן פליטה
עדשה, 200 מ"מ, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	עדשת ממסר לאופטיקה FRET (3)
מראה פס רחב כסף	Thor Labs	ME2S-P01	אופטיקה FRET (2)
מאגר
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% על , ננו-חלקיקי פוליסטירן בקוטר 50 ננומטר	עבור C. elegans immobilization
זן טרנסגני, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	זן PS6388
טרנסגני, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	זן CG1B

מסנן עירור NGM