Method Article

ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal

DOI:

10.3791/50375

⸱

August 14th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היפרדות רשתית (RD) מתארת ​​הפרדה של רשתית נוירו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית). הרשתית היא חיונית לתפקוד תקין של התאים העצב הרגישים לאור, photoreceptors. ניתוק של הרשתית מהרשתית יוצר פער פיזי, כי הוא מלא בנוזל חוץ תאי. RD יוזם תופעות לוואי תאיות ומולקולרית המשפיעות גם נוירו הרשתית והרשתית מאז חילופי פיסיולוגי של יונים ומטבוליטים הוא מוטרדים קשה. התוצאה עבור חזון קשורה לתקופת הניתוק מאז reapposition מהיר של תוצאות שתי הרקמות בשיקום הראייה 1. הטיפול בRD הוא אך ורק ניתוחי. הסרת ג'ל זגוגית (Vitrectomy) ואחריו הסרת חלק החיוני שאינו של הרשתית באזור המרוחק לטובת היפרדות רשתית. דגימות רשתית הסיר הם מיל nullius (שום דבר) וכתוצאה מכך בדרך כלל מושלך.כדי לשחזר RNA מן הדגימות כירורגית אלה, פיתחנו את כתב עת ההליך המאפשר לרנ"א שימור במהלך ההעברה מהבלוק כירורגית למעבדה. אנחנו גם טופל פרוטוקול לטהר הרנ"א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח ביטוי גנים הגלובלי. האיכות של RNA קבלה תוקף גם על ידי RT-PCR וניתוח microarray. ניתוח של הנתונים מראה מעורבות בו זמנית של דלקת וניוון photoreceptor במהלך RD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הטיפולית העיקרית בהיפרדות רשתית (RD) היא למצוא דרך להגביל את נזק photoreceptor תא ודלקת רשתית כתוצאה מההפרדה של קולטניים אור מתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית. במהלך RD, תאי הרשתית מופעלים, להעביר, dedifferentiate, ומתרבים על פני השטח של הרשתית המנותקת, הפעלת כוחות התכווצות שהובילו לסיבוכים. ניתוח transcriptomics של RD הוא דרך לזהות גני המטרה עם ביטוי שונה בעקבות RD ומולקולות טיפוליות עתידיות ומכאן שיכולים לשפר את התוצאה סופית חזותית בשילוב עם ניתוח. העובדה ידועה הוא חומצה ריבונוקלאית (RNA) אינה יציבה כפי שהיא חומצת deoxyribonucleic (DNA), האחרון בשימוש נרחב למחקרים גנטיים, יציבותו התירה הרצף של הגנום הניאנדרטלי מדגימות כפליאונטו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כתב עת: נוהל לשחזר את הדגימות מהבלוק כירורגי

במעבדה

  1. קבל חוזה יבוא מחברת ספנות מפורשת.
  2. מלא 10 (או 25) צורות משלוח עם כתובת הדואר של המעבדה מצביעה על איש הקשר במעבדה (מספר טלפון וכתובת דואר האלקטרוני).
  3. הכן 10 (או 25) צורות דוגמאות ממוספרות מ -1 עד 10 (או 25). צורות אלה כוללות חללים ייעודיים להודיע ​​על זיהוי אלמוני) של החולה, ב) מועד הניתוח וג) שום הערות נוספות המנתח רוצים ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך ז'ורנל (איור 1) מאפשר לנו לשחזר את הדגימות של רשתית מהגוש כירורגית למטוהרי RNA, ולנתח את transcriptome של היפרדות רשתית. תוצאות היפרדות רשתית בupregulation של chemotactic גן מונוציטים MCP1 CCL2, ובירידה בביטוי של מוט photoreceptor transducing הגן GNAT1, קצר הגל החרוט Opsin OPN1SW, וCRX homeogene (איור 2). האינדוקציה של CCL2 היא כתוצאה מדלקת 9, תוך ההפחתה במקביל של GNAT1, OPN1SW וCRX היא .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של הליך להתאוששות רקמה מהגוש כירורגית כבר חיוני לניתוח transcriptome של היפרדות רשתית. אחד צריך לשים לב כי סוג זה של ניתוח הוא התאמן בחירום ושיש לי ההפעלה רופאי העיניים קצת זמן כדי להשתתף בתכנית מחקר ביולוגית כאשר הם פועלים. retinectomy זה מבוצע גם stochastically בכל שירות, כך שהדרך קלה יותר להגיע למספרים סטטיסטיים היא לעבוד עם רשת. ברשת כזו, סטנדרטיזציה של אוסף הרקמות חיונית להצלחה של הניתוח הביולוגי. על ידי מתן חומר, קל מאוד לשימוש והוראות מדויקות, שניתן לאחסן בטמפרטורת ח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים סשה רייכמן ודומיניק Santiard-רון על עזרתם בעריכת פרוטוקול טיהור רנ"א.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צנטריפוגהבקמן קולטראוונטי J-E
רוטורבקמן קולטרJS-5.3
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרLE 80K
רוטורבקמן קולטרSW41
ספק כוחBioradPac 3000
PolytronTMKinematicaPT 2100מסופק עם PT-DA 2105:2
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל אגרוזBioradMiniGel Cell GT
מערכת הדמיה BioradGelDoc-It Imager
5 מ"ל צינור פוליאתילן סטריליגריינר115261
צינור צנטריפוגה פוליאלומר סטרילי בקמן קולטר331372
ריאגנטים כימייםסיגמאדרגת ביולוגיה מולקולרית (מוצרים ללא RNase ו-DNase)
פתרון ניקוי VWRRBS
שבב MicroarrayAffymetrixHuman U133 פלוס 2 מערך

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal DetachmentRNA PurificationCesium Chloride UltracentrifugationTranscriptomic AnalysisJouRNAl ProcedureHuman Retinal SpecimensInflammation MarkersPhotoreceptor DegenerationGene Expression AnalysisGel Electrophoresis

Related Articles