מאמר שיטה

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

19.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50388

⸱

2 ביולי 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Dental Sciences, Hebrew University - Hadassah Medical Center, 2Department of Periodontology, Hebrew University - Hadassah Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר טכניקה יעילה לבודד ולעבד את רקמות חניכיים מחלל הפה בעכבר על מנת לייצר תרבות מתא בודד. תאי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש נוסף לניתוח cytometry זרימה ומחקרים מולקולריים.

תקציר

פיתחנו טכניקה לבודד בדיוק ולעבד את רקמת חניכיים עכברית עבור cytometry הזרימה ומחקרים מולקולריים. החניכיים היא רקמה ייחודית וחשובה ללמוד מנגנוני חיסון משום שהוא מעורב בתגובה החיסונית נגד מארח biofilm פה שעלול לגרום למחל חניכיים. יתר על כן, קרבתה של החניכיים לרקמת עצם מכתשיים מאפשרת גם לימוד שיפוץ עצם בתנאים דלקתיים. השיטה שלנו מניבה כמות גדולה של תאי מערכת חיסון, המאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירות אפילו כגון תאים לנגרהנס ותאי T רגולטוריים כפי שהוכחנו בעבר 1. עכברים המעסיקים ללמוד תגובות חיסוניות מקומיות מעורבות באיבוד עצם מכתשיים במחל חניכיים הוא יתרון בגלל הזמינות של כלים אימונולוגיים וניסיוני שונים. עם זאת, בשל גודלם הקטן והגישה נוחה יחסית לחניכיים העכבריות, מחקרים רבים נמנעו מבחינה של thiרקמה קריטית של. השיטה המתוארת בעבודה זו יכולה להקל על ניתוח חניכיים, אשר תהיה בתקווה להגדיל ממעיט על מערכת החיסון האוראלית ותפקידה במחל חניכיים.

מבוא

חניכיים היא רקמות רכות המקיפות את החלק הצווארי של השיניים ומכסה את תהליך מכתשיים (איור 1). החניכיים היא סוג של רירית לעיסה שניתן להפריד עוד יותר לתוך אפיתל הרירי ורקמת חיבור (הידוע גם בsubmucosa או propria lamina). המבנה האנטומי של החניכיים ושיניים סמוכות מאפשר לחיידקים לחיות ולפתח פלאק (biofilm) שכל הזמן מאתגר את המערכת החיסונית המקומית. כתוצאה מכך, מתפתחת תגובה דלקתית בחניכיים, אשר בנסיבות מסוימות הופכת להיות הרסני - מצב שמכונה מחלות חניכיים 2. בעיקרון, ניתן לחלק את פתולוגיות חניכיים המושרה פלאק לדלקת חניכיים וחניכיים. דלקת חניכיים מייצגת מצב הפיך של תגובה דלקתית המקומית שמוגבלת לחניכיים. חניכיים, ומצד שני, היא תהליך הרסני בלתי הפיך שבו מנגנון הקובץ המצורף (עצם מכתשיים, חניכייםרצועה, cementum וחניכיים) הוא נהרס 3.

החניכיים הוצעה לשרת אתרים גם מפעיל ואינדוקטיבי כמו במחל חניכיים 4. מחקרים בבני אדם הראו כי בתגובה לרובד שיניים, תאי מפעיל חיסוניים ומולקולות דינמי הסתננו או היציאה החניכיים 5-7. פעילות זו הוצגה לשחק תפקיד מרכזי בהרס חניכיים 8,9. אילו נתונים שנוצרו על ידי אותם מחקרים סיפק מידע בעל ערך רב לגבי התהליך הפתולוגי הזה, עבודה עם רקמות אדם בעל מגבלות אתיות, טכנית וניסיון גדולים. הפיתוח של מודלים ניסויים אפשרו experimentations סיבה ותוצאה באמצעות העסקת עכברים הטרנסגניים וin vivo התערבויות 10. כתוצאה מכך, הידע שלנו על המנגנונים המעורבים במחלת חניכיים גדל במידה ניכרת במהלך שני העשורים האחרונים. למרות זאת, בשל המורכבות של מחלות חניכיים, ישדיון מתמשך לגבי אופי התגובה חיסונית מקומית להקל הרס רקמות. יש גם חוסר בהבנה שלנו על התפקוד של תאי מערכת חיסון מרכזיים בחניכיים במהלך מחלות חניכיים. זה חיוני ובכך ללמוד אירועים פתולוגיים דלקתיים המתרחשים ברקמת היעד של המחלה, החניכיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

להכין מראש:

  • PBS + 2% FCS
  • PBS + 2% FCS עם 2 מ"ג / מ"ל ​​של collagenase סוג II ומ"ג / 1 מ"ל של DNAse סוג I (1 מ"ל לדגימה)
  • מכשירי ניתוח מעוקרים
  • פתרון 0.5 M EDTA

1. טכניקת כריתת חניכיים עליונה

  1. להרדים עכברים באמצעות הדרכת IACUC אושר.
  2. חותכים את שני הצדדים של חלל הפה, כולל את הלחיים והלסת התחתון Ramus עם מספריים ישרים חדים / קהים.
  3. משוך כלפי מטה את הלסת התחתונה.
  4. חותכים את הרקמות הרכות וקשות במ"מ 1 קו דמיוני מאחורי טוחנות שלישים עם מספריים רגילים. לכוון את המספריים בניצב למישור של עצם החך (איור 2 א, קווים כחולים).
  5. לחתוך את הרקמות הרכות וקשות 2 מ"מ מאחורי החותכות (איור 2 א, קווים כחולים).
  6. משוך כלפי מטה את החלק הקדמי של הפה. חלל האף ניתן לצפות לאחר שלב זה.
  7. מניחים את המספרייםבמקביל לחיך, לשים להב אחד לתוך חלל האף, להב השני צריך לחתוך בפרוזדור. לחתוך עד החתך האחורי (איור 2 א, קווים ירוקים). חזור על פעולה זו משני צידי הלסת העליונה. בסוף הלסת העליונה מנותקת משאר הגולגולת (איור 2).
  8. הסר את הלסת העליונה, לחתוך אותו באמצע התפר (איור 2, קו מקווקו שחור) ולחתוך את רקמת החך של כל אחד, חמי לסת עליונה עד שמגיע לעצם מכתשיים.
  9. מקלפים את רקמות חניכיים (הן חמי-maxillae) מהגבול הקדמי שלהם עם Adson מלקחיים (ללא שיניים).
  10. הנח את החניכיים נכרתה בצלחת עם PBS + 2% FCS.

2. חניכיים עיבוד

  1. שים חניכיים נכרתה בצלחת תרבית רקמה (35 x 10 מ"מ) עם 1 מיליליטר PBS + 2% FCS, 2 מ"ג / מ"ל ​​של collagenase סוג II ומ"ג / 1 מ"ל של DNAse סוג I.
  2. ברר היטב את הרקמה עם ° להב כירורגי סטרילי 15 N.
  3. Transfer הרקמה מהצלחת למבחנת חרוטי 15 מ"ל.
  4. לשטוף את תאי רקמה / שנותרו על הצלחת עם 1 מיליליטר PBS + 2% FCS והעברה לאותה מבחנה.
  5. דגירה באינקובטור שייקר עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד (המלצה: מחמם את החממה).
  6. הוסף 20 μl של EDTA 0.5 M ו דגירה במשך עוד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד.
  7. מלא את המבחנה עד 12 מ"ל עם PBS + 2% FCS ו צנטריפוגות ב 4 ° C, XG 400 במשך 8 דקות (המלצה: לפני צינת צנטריפוגות).
  8. הסרת תאי supernatant ו resuspend עם 2 מ"ל PBS + 2% FCS.
  9. לסנן את המדגם עם 70 מיקרומטר תא מסננת ולשמור לזרום.
  10. צנטריפוגות ב 4 ° C, 320 XG במשך 5 דקות.
  11. הסרת תאי supernatant ו resuspend עם + 2% PBS μl 300 FCS.
  12. ספירת התאים (x 10 5 תאים כ 5-10 צפויים מלסת עליונה יחידה).

3. נוגדן תאי ו תאיצביעה לניתוח cytometry זרימה

מומלץ לעבוד בתוך מכסה המנוע, עם אורות כבויים. זה קריטי כדי לשמור על התאים בסביבה קרה מתמיד, כמו גם את כל החומרים דרושים.

  1. כתם תאים כנגד מולקולות תאית על ידי הוספת 0.2-0.5 מיקרוגרם של כל נוגדן שנבחר לכל 1 x 10 6 תאים בנפח כולל של 100 μl.
  2. בקצרה מערבולת.
  3. דגירה הצינורות במשך 15 דקות בחושך ב 4 ° C.
  4. שטוף תאים עם 2 מ"ל PBS + 2% FCS.
  5. צנטריפוגות ב 4 ° C, 320 XG במשך 5 דקות.
  6. לשאוב תאי supernatant ו resuspend ידי הוספה, טיפה חכמה, 500 BD הקר μl Cytoperm / Cytofix תוך vortexing.
  7. דגירה הצינורות עבור 40 דקות ב 4 ° C בחושך.
  8. בקצרה מערבולת.
  9. לשטוף את התאים פעמיים עם פר 1 מ"ל קר BD / לשטוף מאגר ספין על XG 800 במשך 7 דקות ב 4 ° C.
  10. לשאוב supernatant למעט 300 μl.
  11. כתם תאי intracellularly ידיהוספת 1 ​​מיקרוגרם של כל נוגדן שנבחר לכל 1 x 10 6 תאים בנפח כולל של 100 μl.
  12. בקצרה מערבולת.
  13. דגירה במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
  14. לשטוף את התאים פעמיים עם פר 1 מ"ל קר BD / לשטוף מאגר ספין על XG 800 במשך 7 דקות ב 4 ° C.
  15. לשאוב תאי supernatant ו resuspend ידי הוספת 300 הצפת פרם / לשטוף BD קר μl.
  16. בקצרה מערבולת.
  17. מעבירים את ההשעיה תוך סינון לצינורות FACS.
  18. שמור את הצינורות בסביבה חשוכה וקרה עד לניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דוגמאות לניתוח cytometry זרימה בתאי חניכיים מוצגות. תאי חניכיים אספו מ2 עכברים לרוץ בcytometer הזרימה השנייה LSR ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. איור 3 א הפגין חלוקת תאי חניכיים מעכברים נאיביים בפיזור צד (SSC) לעומת פיזור עלילה קדימה (FSC). אסטרטגית gating לזהות (i) לימפוציטים (II) / מונוציטים ותאים דנדריטיים (iii) גרנולוציטים מצויינים. לשם השוואה, אנו מציגים גם עלילת FACS ממחישה תאי חניכיים מטוהרים מפ gingivalis נגוע עכברים 21 ימים לאחר gavage האוראלי בהגדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רקמות חניכיימיים לסת עליונות המתקבלות מעכבר אחת מספיקות לניתוח תת אוכלוסיות של לימפוציטים מסוג B וT, כמו גם היכולת שלהם להביע את המולקולות תאיות ו תאית כפי שתארנו בעבר 1. יחד עם זאת, אם אוכלוסיות תאים נדירות הן בעלי העניין (לדוגמא DCs), מומלץ לרקמות בריכת מ 2-3 עכברים. שים לב, אם עדיף, אפשר לקלף שתי רקמות החיך וחניכיים ולאחר מכן לבלו החניכיים (שינוי של צעד 1.8-1.9). זה צריך להיות גם ציינו שיכולות להיות שנאסף mandibular חניכיים, כמו גם, עדיין, הבידוד שלו הוא מורכב יותר ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש מחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (מס '1418-1411) לאהה ו( מס' 1933/12) לAW, הקרן גרמנית לחוקרים צעירים (GIF הצעיר) לאהה, ואני ד"ר . קרן תרומות מחקר Cabakoff בבית הספר לרפואת שיניים לאהה וAW-אוניברסיטת הדסה עברית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז סוג IIוורת'ינגטון ביוכימיה קורפCLS-2
DNAse ISIGMADN25-1G
EDTASIGMAE6758-100G
PBSSIGMAD8537
סרום בקר עוברי תעשיות ביולוגיות04-121-1
מסנן מונע ואקוםבחום סילון BiofilFPE-204-500
5 מ"ל פוליסטירן עגול-תחתון צינורBD Falcon352052
מסננת תאים 70 μ mSPL Lifesciences93070
צלחת תרבית רקמות 35× 10 מ"מNUNC153066
BD ציטופיקס / ציטופרםBD554714
נוגדן CD11c נגד עכברBiolegend117305שיבוט N418
נגד עכבר CD45.2 נוגדןBiolegend109819Clone 104
נוגדן CD4 נגד עכברBiolegend100413Clone GK1.5
נוגדן CD8a נגד עכברBiolegend100733Clone 53-6.7
נוגדן CD3 נגד עכברBiolegend100214Clone 17A2
נוגדן CD326 (Ep-CAM)Biolegend118219Clone G8.8
נוגדן נגד עכבר CD207 (לנגרין)ImgenexDDX0362DClone 929F3.01
נגד עכבר I-Ad (MHC-II) antobodyBiolegend115010Clone 39-10-8
LSR II ציטומטר זרימהBD Biosciences
FlowJo תוכנה v 7.6.5כוכב
מומת נוגדן עץ

מקורות

  1. Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
  2. Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
  3. Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
  4. Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
  5. Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
  6. Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
  7. Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
  8. Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
  9. Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
  10. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים