מאמר שיטה

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

DOI:

10.3791/50389

⸱

6 במאי 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוכרתי עכבר nonobese (NOD) באופן ספונטני מתפתח סוכרת אוטואימונית לאחר 12 שבועות של גיל והוא מודל החיה נחקר רב ביותר מסוג אנושי סוכרת 1 (T1D). מחקרי תא העברה בעכברי נמען מוקרנים קבעו כי תאי T הם מרכזי בפתוגנזה T1D במודל זה. במסמך זה אנו מתארים שיטה פשוטה למהירות לגרום T1D ידי העברת מאמצת של מטוהרים, מסוג CD4 + T תאים ראשוניים מעכברי NOD טרום סוכרת מהונדסים לקולט איון הספציפי לתא T (TCR) BDC2.5 לעכברים נמען NOD.SCID. יתרונותיו העיקריים של טכניקה זו הם שבידוד והעברת מאמצת של תאי T diabetogenic יכולה להסתיים בתוך באותו היום, קרינה מהמקבלים אינה נדרשת, ושכיחות גבוהה של T1D הוא הושרה בתוך 2 שבועות לאחר העברת תאי T. כך, מחקרים של הפתוגנזה והתערבויות טיפוליות בT1D יכולים להמשיך בקצב מהיר יותר מאשר עם שיטות המסתמכות על אוכלוסיות תאי T הטרוגניים או שיבוטיםנגזר מעכברי NOD סוכרתיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכבר NOD מפתחת סוכרת אוטואימונית באופן ספונטני וכבר בשימוש נרחב כמודל חיה ל1,2 T1D האנושי. פתוגנזה של T1D בעכברי NOD מאופיינת בחדירה, החל משעת 3-4 שבועות של גיל, של איי הלבלב לנגרהנס על ידי תאי דנדריטים ומקרופגים, ואחריו T ותאי B. שלב זה של הלא הרסני פרי insulitis מוביל להרס איטי, הדרגתי של תאי β בלבלב, ייצור אינסולין, וכתוצאה מהסוכרת גלויה על ידי 4-6 חודשים של גיל 3. העברת splenocytes 4,5, מסוג CD4 + 6,7 או CD8 + 8,9 תאי T מעכברי NOD סוכרתיים הוכחו לתווך סוכרת בעכברי NOD חיסון, מצביע על כך שתאי T איון-reactive לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה T1D. בהתאם לתנאי הניסוי, פיתחה סוכרת בעכברי נמען לאט, במשך מספר שבועות במחקרים אלה. באופן דומה, שיבוטים תא T שונים, שהופקו על ידי זמן רב ויקרהculturing של תאי T diabetogenic, דווח לתווך סוכרת מספר שבועות לאחר העברה לעכברים נמען 7,10. עם הזמינות של עכברים הטרנסגניים לבטא TCRs נגזר מסוג CD4-או שיבוטים תא T diabetogenic CD8 מוגבלים, מספר מעבדות שלאחר מכן הראה כי תאי T טחול מעכברים כאלה היו מסוגלים להעביר את הסוכרת לנמענים 11-13. באופן ספציפי, BDC2.5 עכברי NOD הם מהונדס לBDC2.5 TCR, שהוא ספציפי לchromogranin, חלבון בתאים בטא בלבלב 14-16. העברת בשלם או מופרדים תאי טחול בלתי פעילים מBDC2.5 עכברי גלוי סוכרת או סוכרת prediabetic הועברו לעכברים NOD ילוד או immunodeficient ביעילות משתנה 11,17-19 מבחנה המופעל או.

אנו מתארים שיטה פשוטה שמנצלת מסוג CD4 + T מהונדס מטוהרים תאים מעכברי BDC2.5 טרום סוכרת לגרום T1D בעכברי נמען ביעילות וconsiste גבוהיםncy. מספר גדול של CD4 נאיבי, איון אנטיגן ספציפי + T תאים מבודדים מעכברים אלה על ידי מיון תא הקרינה המופעל (FACS) לסוג CD4 + CD62L + T תאים המבטאים את השרשרת המהונדס TCR Vβ4. מטוהרים תאי T מהונדסים מועברים לאחר מכן ללא הפעלה לעכברים NOD.SCID, אשר חוסר T תפקודי ותאי B ו-הם insulitis וסוכרת חופשי 20. את עכברי הנמען מנוטרים לריכוזים גבוהים של גלוקוז בשתן מעידים T1D, אשר מתפתח במהירות תוך שבועיים לאחר העברת תאי T.

בניגוד לשיטות אחרות שיעביר תאי T diabetogenic עם ספציפיות הטרוגניים, הפרוטוקול שלנו משתמש FACS-ממוין CD4 + תאי T שכמעט אך ורק מבטאים את BDC2.5 TCR diabetogenic. בשל ההומוגניות שלהם, רק מספר קטן של תאי T שהועברו (~ 1x10 6 תאים / עכבר) נדרשים לפיתוח T1D מהיר בתוך 2 שבועות ב 100% פגיעה. יתרון נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא שirradiation של עכברי נמען אינו הכרחית כפי שהיא לכמה שיטות אחרות. הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא שהיא אינה מאפשרת חקירת התרומה של CD4 ו CD8 תת תאי T או תאי T CD8 במיוחד בסוכרת.

הפרוטוקול המתואר יהיה שימושי לחקר התפתחות T1D מהיר, בתיווכו של נאיבי, מסוג CD4 + monospecific תאי T, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות להתערב בביות של תאי ה איון אנטיגן ספציפיים לאיבר המטרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד של תאי T מטחול ובלוטות לימפה של עכברים BDC2.5

  1. השתמש BDC2.5 נקבות עכברים טרום סוכרת 6 בן שבוע כתורמים של CD4 + T תאי diabetogenic. עכברים צריכים להיות חופשיים, כפי שנקבעו על ידי סוכרת מדידת גלוקוז בשתן (ראה להלן).
  2. להרדים כל עכבר באמצעות חנק CO 2 ולהסיר את בלוטות הלימפה בטחול, בבית השחי וזרוע בתנאים סטריליים. כדי להסיר את הטחול, יש להשרות את הפרווה עם 70% אתנול, ואז לחתוך ולחזור בו עור. הטחול יהיה גלוי כאיבר אדום כהה בצדו השמאלי של העכבר. ביצוע חתך 1 אינץ' בצפק באמצעות מספריים הקטנים ולתפוס בעדינות את הטחול במרכז עם פינצטה קטנה. לקצץ בזהירות את רקמות חיבור ושומן מצורף ככל האפשר ולהסיר את הטחול.
  3. לאסוף את הטחולים ובלוטות לימפה ב10 מ"ל בינוני של Dulbecco's-Modified הנשר (DMEM) בצינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
  4. הכן את השעיה תא בודדת באמצעות הסוף הדואר של בוכנת מזרק 10 מ"ל סטרילי ללחוץ את האיברים הלימפה בעדינות דרך מסננות 70 מיקרומטר תא (אחד טחול למסננת ו4-6 בלוטות הלימפה במסננת) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.

במהלך התהליך, יש לשטוף את כל מסננת עם 1 מ"ל DMEM מספר פעמים על מנת למקסם את ההתאוששות של תאים מהמסננת.

  1. להעביר את התאים שנאספו מצינור חרוטי 50 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטי ב300-400 XG במשך 7 דקות ב RT.
  2. לlyse תאי דם אדומים, לבטל את supernatant, מחדש להשעות את התאים ב5 מיליליטר אמוניום-כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (pH 7.2), ודגירת ההשעיה ACK התאים ב RT למשך 5 דקות.
  3. הוסף 10 מ"ל של DMEM להשעית ACK-תא וצנטריפוגות הצינור כאמור לעיל. שטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מ"ל DMEM.

2. מיון תא הקרינה המופעל מסוג CD4 + T Diabetogenic תאים מהעכברים BDC2.5

  1. תאים מחדש להשעות ב5 מ"ל FACS שלTaining חיץ ולספור את מספר תאי קיימא (באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב וhemocytometer) על ידי הרחקת trypan הכחולה צבע.
  2. שימוש בחיץ FACS, להתאים את עוצמת קול ההשעיה תא 5 x 10 7 תאים / מ"ל. הסר ~ 1 x 10 6 תאים לכל שליטה מכתים (1 מס 3 כתמי כתם, בודדים). כתם המדגם עבור CD4 המהונדס שאינם מופעל + תאי T מסוג CD4 עם אנטי (APC), אנטי TCR Vβ4 (FITC) ונוגדנים נגד CD62L (PE) חד שבטיים (מב) בצינור 15 מ"ל. לבצע מכתים תא באמצעות ריכוזי מב שהוצעו על ידי היצרן עבור 20-30 דקות ב 4 ° C בחושך.
  3. שטוף את פקדי כתם בודדים מדגם ועם חיץ FACS ב> 3X נפח התגובה מכתים. צנטריפוגה צינור ב300-400 XG, להסיר את supernatant, מחדש להשעות את התאים בFACS חיץ (1-2 x 10 7 תאים / מ"ל למיון והמדגם 300 μl עבור פקדי כתם יחידים) ולאחסן על קרח עד למחרת צעד.
  4. להעביר את דגימת התא דרך מיקרומטר תא 35צינור כובע מסננת כדי להסיר גושי תאים. מיין את דוגמאות לסוג CD4 + TCR Vβ4 + + CD62L תאים בסדרן תא עם מפעיל מיומן. לאסוף את התאים הממוינים ל3 מ"ל DMEM בצינור 15 מ"ל. לאפשר 2.5-3 שעות, כולל התקנה, כדי למיין 1.5 x 10 8 תאים (מספר המשוער של תאים המתקבלים מ3 עכברים תורמים) בשיעור סוג של 2 x 10 4 אירועים / שני בסך הכל. מצפה ~ 2.5 x 10 6 CD4 מהונדס שאינם מופעל + T תאים לכל עכבר לאחר מיון תא.
  5. רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף המיון וצנטריפוגות ל7 דקות ב 300-400 x גרם. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים (2 x 10 6 תאים / מ"ל) בסטרילי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + חינם) להעברת תא T המאמצת.

3. העברת מאמצת של CD4 + T Diabetogenic תאים מעכברים BDC2.5

  1. באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט מד ½ 18-1, בעדינות מחדש להשעות את הסוג CD4 +-FACS מטוהרתאי T ולטעון את מזרק 1 מ"ל. כהכנה להזרקה, להחליף 18-1 ½ מחט מד עם 27 ½ מחט מד.
  2. לחשוף 6-8 עכברי נמען NOD.SCID נשיים בן שבוע למנורת חימום עד שהם מפגינים טיפוח התנהגות.
  3. לרסן עכברי נמען בעוצר ולנגב הזנב שלהם עם 70% (V / V) אתנול לחיטוי אזור ההזרקה.
  4. הזרק 1-2 x 10 תאים ממוינים / עכבר 6 FACS (בעד 500 PBS μl) לאחד מורידי הזנב לרוחב.

אל תדחף את הבוכנה. אם המחט ממוקמת כראוי בווריד, ההזרקה תתקיים כמעט ללא התנגדות.

4. ניטור עכברים נמען ליפרגליקמיה וT1D

  1. החל מחמישה ימים לאחר ההעברה לתא T, עכברי נמען NOD.SCID מנוטרים יומיים לרמת סוכר גבוה בשתן באמצעות רצועות מגיב (באייר Diastix) על פי הוראות היצרן. עכברים עם שתי ברציפות אוריןקריאות סוכר E> 250 מ"ג / ד"ל נחשבות סוכרתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות שלנו מראות את הבידוד של תאים מהונדסים המבטאים BDC2.5 CD62L, שהוא קריטי לתאי T לבית לאיברים משניים הלימפה, כגון בלוטות לימפה בלבלב. הממצאים שלנו עוד יותר להפגין את היכולת חזקה של אוכלוסיית תאי T monospecific זה כדי להעביר במהירות וביעילות T1D לעכברים נמען NOD.SCID.

בידוד של CD4 + T תאי diabetogenic מBDC2.5 עכברים מוצג באיור 2. כ 5 10 x 7 תאים מטחול ובלוטות לימפה ונקווה התקבלו לכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכול להיגרם T1D בעכברי נמען ביעילות משתנה על ידי העברת מאמצת של תאים שלמים טחול או תת תאי T מעכברי NOD סוכרתיים או עכברים מהונדסים לTCRs נגזר משיבוטי תא T diabetogenic. אנו מדווחים בזאת שיטה לשחזור כדי לגרום T1D בעכברי נמען בתוך שבועיים ב -100% שכיחות ידי העברת CD62L + BDC2.5 CD4 מהונדס FACS המטוהר + T תאים לעכברים NOD.SCID.

יתרונות ספציפיים של מודל העברת תא T BDC2.5 מתואר כאן כוללים האינדוקציה זמן הקצר מאוד של T...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העכברים שוכנו בפן סטייט קולג' למתקן נטול הפתוגן ספציפי רפואה (SPF) בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדיים פן סטייט והשתמש בועדה.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בני הזוג. רוברט בונו וניל כריסטנסן על הערות מועילות.

עבודה זו נתמכה על ידי מכללת פנסילבניה סטייט של קרנות רפואה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BDC 2.5 TCR עכברי NOD טרנסגניים (NOD. Cg-Tg (TCR ואלפא; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
הנהון. עכברי SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
צינורות חרוטיים 15 מ"לFalcon352095
50 מ"ל צינורות חרוטייםFalcon352070
פינצטה כירורגית
מספריים
מספריים
70 μ מסנני תאים mפישר סיינטיפיק22363548
35 μ m צינורות מכסה מסננת תאיםBD Biosciences352235
חוצץ0.15 מ' NH<תת>4Cl, 1 מ"מ KHCO<תת>3, 0.1 מ"מ Na2EDTA, pH 7.2 בנוזל נדן dH2O
BD FACSFlowTMBD Biosciences342003
מאגרצביעה FACSPBS, 0.2 מ"מ EDTA, 0.5% BSA/FCS,
ניגודיות פאזה
המוציטומטר
כחול
טריפן אנטי-CD4 (APC) mAbBiolegend1005616שיבוט RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365שיבוט KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciencesשיבוט 553151MEL-14
סדרן תאיםBD Biosciencesלמשל BD FACSAria III
מנורת
מסנן
1 מ"לBecton Dickinson309602
18-1½ מחטי מד (סטריליות)בקטון דיקינסון305196
27½ מחטי מד (סטריליות)בקטון דיקינסון305109
סטריליתזוג קטן סטריליזוג גדול סטרילי אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) נוזל נדן מיקרוסקופ מעוקר מסנן חוםעכבר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
  2. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
  3. Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
  4. Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
  5. Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
  6. Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
  7. Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
  8. Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
  9. Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
  10. Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
  11. Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
  12. Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
  13. Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
  14. Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
  15. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  16. Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
  17. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
  18. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
  19. Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
  20. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
  21. Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
  22. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
  23. Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
  24. Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TT CD4NOD SCIDBDC2 5

מאמרים קשורים