קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

סיכום

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

תקציר

חלק גדול מהרכיבה על האופניים מזינים ועיבוד פחמן בסביבה טבעית מתרחש באמצעות הפעילות של אנזימים תאיים שפורסמו על ידי מיקרואורגניזמים. לכן, מדידה של הפעילות של אנזימים תאיים אלה יכול לתת תובנות השיעורים של תהליכים ברמת מערכת אקולוגית, כגון פירוק חומר אורגני או חנקן וזרחן מינרליזציה. מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות סביבתיות בדרך כלל כרוכים חושפים את הדגימות למצעי colorimetric או fluorometric מלאכותיים ומעקב אחר השיעור של הידרוליזה מצע. כאן אנו מתארים שיטות microplate המבוסס על נהלים אלה המאפשרים הניתוח של מספר הגדול של דגימות תוך פרק זמן קצר. דוגמאות מותרת להגיב במצעים מלאכותיים תוך 96 גם microplates או גם עמוקים בלוקים microplate, ופעילות אנזים נקבעה לאחר מכן על ידי קליטה הקרינה או של המוצר הסופי וכתוצאה מכך באמצעות ריד microplate טיפוסיr או fluorometer. נהלי תפוקה גבוהה כגון להקל לא רק השוואות בין אתרים או מערכות אקולוגיות במרחב נפרדים, אלא גם להפחית באופן משמעותי את העלות של מבחני אלה על ידי צמצום כמויות מגיב הכוללות הנדרשות לדגימה.

מבוא

מיקרואורגניזמים כגון חיידקים ופטריות להשיג חומרים מזינים ופחמן מתרכובות אורגניות מורכבות באמצעות הייצור של אנזימים תאיים. אנזימים אלה בדרך כלל hydrolyze פולימרים ליחידות משנה קטנה יותר שאפשר לקחת אל תוך התא. לכן, ברמה אקולוגית, אנזימים תאיים של חיידקים אלו אחראים לחלק גדול ממינרליזציה התזונתית ופירוק חומר אורגני המתרחש בסביבות טבעיות. אנזימים כגון cellobiohydrolase (CBH) וβ-glucosidase חשובים לפירוק תאית ועבודה ביחד כדי לזרז הידרוליזה של תאית לגלוקוז ^1,2, המספקת מצע פחמן לניצול לספיגה והטמעה של חיידקים. Phosphatase האנזים משחרר מסיסי קבוצות אורגניות פוספט מזרחנים אורגניים, במהות mineralizing פוספט והופך אותו זמין לשימוש על ידי רוב האורגניזמים ^3. אנזימים אחרים, כגון N-acetylglucosaminidase (Nagase), הם importanלא בשפלת כיטין והוא יכול לעשות את שני פחמן וחנקן זמין לרכישת חיידקים ^4.

אחד מההליכים עבור assay של פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות טבעיות הוא השימוש בp-nitrophenyl המלאכותי מצעים (NP עמ ') מקושרים, גישה שפותחה במקור כדי לזהות פעילות phosphatase אדמת ^5. גישה זו מסתמכת על זיהוי של מוצר בצבע תום, p-nitrophenol, המשתחרר כאשר המצע מלאכותי הידרוליזה על ידי האנזים המתאים. P-nitrophenol ניתן לכמת בהמשך colorimetrically ידי מדידת הספיגה שלה בסביבות 400-410 ננומטר. שיטה זו מאז הוחל לזהות אנזימים אחרים כגון Nagase ^6, וכבר נעשה שימוש במחקרים שונים מסתכלת על פעילות אנזים תאית של חיידקים בקרקעות ומשקעים ^7-9.

גישה חלופית שהייתה originally פותח כדי להעריך את פעילות glucosidase תאית בסביבות מימית ^10,11 עושה שימוש 4 methylumbelliferone-(MUB) מצעים מקושרים. המוצר הסופי שפורסם (4-methylumbelliferone) הוא ניאון מאוד וניתן לאתר באמצעות fluorometer עם הגדרת עירור / פליטה סביב 360/460 ננומטר. מגוון מצעים מלאכותיים MUB צמודים זמין, המאפשר מדידת fluorometric של הפעילות של אנזימים לפחות כמו רבים (למשל β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase) כפי שניתן assayed באמצעות הליך colorimetric NP-מצע p. אנזימים אחרים חיידקים תאיים, כגון aminopeptidase לאוצין החלבון משפיל, יכולים להיות assayed fluorometrically באמצעות 7-אמינו-4-methylcoumarin (COU) מצעים מקושרים. שני MUB ומצעי COU צמודים היו בשימוש כדי לקבוע פעילות אנזים בדגימות יבשתית ומימיות שונות ^12,13.

בעוד שהמחקרים קודמים descrmicroplate fluorometric או colorimetric ibed גישות כדי לקבוע פעילות אנזים תאית ^14, יש צורך בהצגה ברורה של איך לנהל מבחני כאלה. כאן אנו מדגימים נהלים לביצוע טכניקות microplate תפוקה גבוהות לניתוח פעילות אנזים תאי בקרקעות ומשקעים בגישת מצעים צמודים NP p colorimetric ובמים הטבעיים באמצעות טכניקת מצעי MUB צמודת הניאון. אנו מתמקדים במדידה של הפעילות של β-glucosidase, Nagase, וphosphatase כיכולים להיות קשורים אנזימים אלה לפחמן, חנקן, זרחן ורכיבה על אופניים, בהתאמה. עם זאת, ניתן ליישם הנהלים שתוארו כאן כדי המדידה של אנזימים תאיים אחרים באמצעות מצעים מלאכותיים שונים.

פרוטוקול

ניתוח Colorimetric של תאית אנזים פעילות בקרקעות ומשקעים

1. הכנת התשתית ופתרונות הצפת לניתוח Colorimetric של אנזים פעילות

1. H להכין 50 מ"מ אצטט חיץ (pH 5.0-5.5) על ידי ערבוב חומצת 50 מיליליטר 0.1 M אצטית (2.87 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית ב500 מיליליטר מים), 150 מיליליטר 0.1 נתרן אצטט M, ו200 מיליליטר מזוקק ₂ O. התאם ל-pH 5.0-5.5 עם 0.1 M חומצה אצטית במידת צורך.
2. הכן פתרון של הידרוקסיד 1 M נתרן (NaOH) במזוקקי H ₂ O.
3. הכן את פתרונות מצע צמוד NP p ב50 מ"מ חיץ אצטט. לassay phosphatase להכין NP-פוספט עמ '5 מ"מ ב50 מ"מ אצטט חיץ; לassay β-glucosidase להכין NP-β-glucopyranoside עמ' 5 מ"מ; לassay Nagase להכין 2 מ"מ PNP-β-N-acetylglucosaminide. הכן את כל הפתרונות במצע 15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. ניתן לאחסן את הפתרונות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות.

2. קביעת תקן להמרה ספיגת לריכוז NP p

1. הכן את הפתרונות סטנדרטיים של p-nitrophenol ב50 מ"מ חיץ אצטט. ריכוזים צריכים לנוע .025-1 מ"מ.
2. העברה שלושה משכפל של כל ריכוז 100 μl לmicroplate 96, גם ברור. הוסף 10 μl 1 M NaOH ו190 μl מזוקק H ₂ O היטב כל אחד.
3. שיא הספיגה ב 410 ננומטר באמצעות קורא microplate.
4. ריכוזי כפל בעקומת הסטנדרט ידי 0.3 לקבל NP p μmoles ל300 μl עוצמת תגובה. עלילה עקומה של הספיגה לעומת μmole של NP p. שיפוע העקום משמש כמקדם ההמרה (C) שיתייחס לספיגת μmole של NP עמ 'בכל תגובת אנזים.

3. ניצוח Assay האנזים

1. עבור קרקע, להכין את התרחיף של כל דגימה להיות assayed בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי בconcentration של כ 1 גר '/ מיליליטר ^-1 באמצעות 50 מ"מ חיץ אצטט. למשקעים, להוסיף מספיק חיץ אצטט לעשות slurry קלות pipettable. נפח תרחיף צורך המדויק ישתנה בהתאם למספר האנזימים assayed, אבל מינימום של 5 מיליליטר מומלץ. ורטקס כל slurry עד שכל הגושים של אדמה או משקעים התפזרו ולב הנפח הסופי.
2. Re-מערבולת כל slurry ו פיפטה מייד 150 μl לכל אחד משש בארות בגוש 96 היטב deepwell (איור 1). חשוב מערבולת ביסודיות ולעתים קרובות על מנת לשמור על חלקיקי קרקע בהשעיה. להשאיר לפחות שתי בארות לכל בלוק ריקים כדי לשמש שליטת מצע. הערה: קליפ סוף הטיפים פיפטה עם מספריים לפני pipetting כslurries אדמה נוטה לסתום טיפים. הכן את בלוק 96 היטב אחד לכל אנזים להיות assayed.
3. יוצקים כ 5 מיליליטר של חיץ אצטט לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של החיץ לליטרAST שתי בארות של כל דגימה (אלה יהיו פקדי חיץ מדגם) ושתי בארות שליטת מצע (איור 1)
4. יוצקים כ 10 מיליליטר של פתרון NP-מצע p המתאים למאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים להוסיף 150 μl של פתרון המצע לארבע הבארות הראשונות של כל דגימה ושתי בארות שליטת מצע (איור 1). שים לב לזמן כתגובה מתחילה ברגע שפתרון המצע הוא הוסיף.
5. דגירה צלחות ב RT (22 מעלות צלזיוס) במשך 0.5-4 שעה. זמן דגירה מדויק משתנה בהתאם לרמת פעילות בדגימות והאנזים להיות assayed. עבור רוב הקרקעות ומשקעים, phosphatase וβ-glucosidase דורשים פעמים דגירה של 0.5-1.5 שעה, ואילו Nagase ואנזימים אחרים דורשים פעמים דגירה של> 2 שעות.
6. בעוד מבחני דוגרים להכין 96 היטב ברור microplates לקרוא הספיגה. הכן microplate אחד עבור כל בלוק deepwell (כלומר עבור כל דוארnzyme assayed). פיפטה 10 μl 1 M NaOH ו190 μl של מים מזוקקים לתוך באר כל microplate. הערה: NaOH מאט את התגובה האנזימטית ומעלה את רמת החומציות אשר משפרת את הצבע של NP p שוחרר במהלך התגובה.
7. לאחר דגירה, צנטריפוגות בלוקים 96 היטב ב2,000-5,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חלקיקי קרקע.
8. השתמש פיפטה רבה לסגת 100 μl מכל באר, להיות זהיר, כדי למנוע את הכדור, ולהעביר אותו למתאים גם בmicroplate 96, גם ברור שהוכן.
9. הפעל את קורא microplate ולהגדיר כל תוכנה נחוצה. שיא הספיגה ב 410 ננומטר. אם הספיגה טובה במיוחד היא מעל לגבול גילוי ליניארי של קורא הצלחת, לדלל היטב כי 01:01 עם מים ומחדש מידה. אם הספיגה היא עדיין גבוהה מדי, assay יש לחזור עם זמן דגירה קצר יותר.

4. קביעת יבש ההמונית של דוגמאות

1. פיפטה 1 מיליליטר של כל sampl תרחיף דואר לתוך מחבת אלומיניום preweighed.
2. יבש בתנור ייבוש 75 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ולשקול. הפחת את המשקל של את המחבת מהערך הזה כדי להשיג את המסה היבשה של אדמה או משקעים ב 1 מיליליטר של התרחיף. תכפיל בפקטור של 0.15 כדי לקבוע את המסה היבשה של מדגם בμl 150 מתווסף גם כל בassay האנזים.

5. חישוב פעילות אנזים ליבש המוני של קרקע או משקעים

1. חישוב הספיגה סופית של כל דגימה על ידי הפחתת ספיגת שליטת מדגם מספיגת assay המדגם. אם יש לי פקדי מצע גבוהה הספיגה (בערך> 0.060) אחר כך להפחית אותם גם.
2. חישוב פעילות אנזים במסה יבשה μmoles גרם ^-1 שעה ^-1 מהמשוואה:

פעילות אנזים = הספיגה סופית / (מסת x C מדגם x זמן דגירה יבשה)

ניתוח של פלורסנט התאי אנזים פעילות בטבע ווטרס

פתרונות TLE "> 1. הכנת המצע, רגיל, והצפה לניתוח fluorometric של אנזים פעילות

1. הכן 200 מיקרומטר פתרונות של מצעי MUB צמודים (למשל 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB פוספט, 4-MUB-N-אצטיל-β-D-glucosaminide) על ידי המסת המצע המתאים בסטרילי (autoclaved) מזוקק H ₂ O ב15 מיליליטר סטרילי או 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. לעטוף את הצינורות בנייר אלומיניום, כדי להוציא לאור ולאחסן במקרר לפני השימוש. מצעים צריכים להיות יציבים במשך שבוע לפחות 1 אם מאוחסנים בדרך זו.
2. הכן סטנדרטי MUB על ידי ביצוע פתרון מניות של 100 מיקרומטר 4-methylumbelliferone בסטרילי H מזוקק ₂ O. חנות בקירור בענבר או בקבוק עטוף בנייר אלומיניום. מייד לפני השימוש, לדלל את פתרון 100 המניה מיקרומטר ידי 1/10 לסטרילי H ₂ O כדי להפוך את פתרון עבודה של 10 מיקרומטר עבור מבחני אנזים.
3. הכן פתרון מניות של 100 חיץ ביקרבונט מ"מ על ידי המסת 8.4 גרם של NaHCO <תת> 3 לתוך 1 LH ₂ O ומעוקר. לדלל פתרון מניות זה 1/20 לסטרילי H ₂ O לפי צורך כדי להפוך את פתרון עבודה של 5 מ"מ עבור מבחני אנזים.

2. דגימות מים ארגון על 96, גם השחורה Microplate

1. לארגן microplate לכל אנזים בעקבות הדוגמא שמוצגת באיור 2. שים לב שמאפשר שכפול נאות, סטנדרטים, ופקדים, הליך זה יכול assay את פעילותו של אנזים בודד לתקופה של עד תשע דגימות מים על microplate השחור 96 היטב אחד.
2. יוצקים כ 5 מיליליטר של המדגם הראשון לתוך מאגר פיפטה ולהשתמש pipettor 8 ערוצים לpipette200 μl לכל הבארות בטור 1 של microplate (ים). מחק טיפים פיפטה משומשים וחזור לפי צורך עבור כל דגימת מים כדי למלא עמודי 1-9.

3. הגדרה לדוגמא, תקן, להרוות, ובקרת תשתית

1. הגדרת בקרות לחשבון עבור דגימות, סטנדרטיותים, מצע ומרווה באותו microplate השחור כמו הדגימות (איור 2).
2. פקדים לדוגמא מכילים מים מדגם חיץ ביקרבונט, ואינם משמשים בחישובי הפעילות אבל ידגימו קריאת עקביות לאורך כל תקופת הניסוי. הפקדים להרוות מורכבים ממי מדגם וכמות סטנדרטית של תג הניאון ומשמשים למדידה העקיפה של הקרינה במים לדוגמא. מצע ופקדים סטנדרטיים מורכבים מחיץ או צמוד מצע או תג הניאון הסטנדרטי, בהתאמה, וסודה לשתייה.
3. יוצקים כ 5 מיליליטר של 5 מ"מ חיץ ביקרבונט למאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl של חיץ לתוך בארות microplate 1 עד 9 בשורות D ו-E ליצירת שני לשכפל בארות מדגם פקדים לדגימה. הטיפים פיפטה השינוי לאחר מכן להעביר 200 μl של חיץ ביקרבונט לבארות 10 דרך 12 בשורות וה '
4. להפחית תאורה מפוזרת על ידי עמעום או כיבוי lights כתקן הניאון הוא רגיש לאור.
5. יוצקים כ 5 מיליליטר של 10 מיקרומטר 4 methylumbelliferone-לתוך מאגר פיפטה נקי. פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה H, ולתוך בארות 1 עד 9 לתוך שורות G ו F כדי ליצור שלושה משכפל של בקרות להרוות לדגימה ופקדים סטנדרטיים הכלליים. כך או למקם microplate בחושך או לכסות עם מכסה אטום כדי להפחית השפלה אור MUB.
6. הפעל את fluorometer והגדרה כל תוכנה נחוצה כדי להיות מוכן לקריאה לפני הוספת המצע. שים לב: כמה נורות fluorometer עשויות לדרוש זמן חימום של 3 דקות או יותר.
7. יוצקים כ 5 מיליליטר של המצע המתאים MUB הצמוד (למשל 4-MUB פוספט) לתוך מאגר פיפטה נקי. השתמש pipettor 12 ערוצי פיפטה 50 μl לתוך בארות microplate 1 עד 12 בשורה, ולתוך בארות 1 עד 9 בשורות B ו-C כדי ליצור שלושה מבחני לשכפל עבור כל דגימה ושלושה פקדי מצע. Immediately המשך לשלב 4.1, הקרינה הקלטה.

4. הקרינה הקלטה

1. קראו את הקרינה הראשונית מייד לאחר בנוסף מצע לmicroplate. אחרי שקראתי את הקרינה, דגירה microplate ב RT (22 מעלות צלזיוס) או בחושך או מכוסה במכסה אטומה כדי להפחית השפלה אור MUB.
2. זמן הדגירה הנדרש כדי למדוד את פעילות האנזים הפוטנציאלית המרבית בדגימת מים יהיה תלוי בריכוז האנזים בתוך המדגם. מכיוון שזו אינה ידועה לפני assay הושלם, microplate יצטרך לקרוא בצעדי זמן מרובים. בדרך כלל, קריאה במרווחים של 10-15 דקות במשך 1 שעות מקובלת לאנזימים רבים, אם כי דגימות עם פעילות גבוהה מאוד על אנזימים מסוימים עשויות להגיע לשיא לפני 10 דקות.
3. המשך קריאת הקרינה בmicroplate במרווחי הזמן המיועד שלך במשך שעה לפחות 1. הקפד לשמור מכוסה microplate או בחושך בין הקריאהs.

5. חישוב פעילות האנזים לנפח מים

1. עבור כל דגימה בכל מרווח זמן לחשב את: אומר הקרינה מדגם ראשונית (בארות D ו-E), הקרינה הממוצעת הסופית המדגם (בארות AC), הקרינה הממוצעת סטנדרטית (בארות H10-11), ומתכוונים להרוות את הקרינה שליטה (הבארות FG).
2. לכל מרווח זמן, לחשב פעילות אנזים בשעת nmoles ^-1 מיליליטר ^-1 מהמשוואה:

פעילות אנזים = (כלומר הקרינה מדגם - כלומר הקרינה מדגם ראשונית) / ((x אומר הקרינה / 0.5 mol הסטנדרטי) (מתכוון להרוות את הקרינה שליטה / אומר x הקרינה הסטנדרטי) (0.2 מיליליטר) x (פעם בשעה))

3. בדוק את ערכי הפעילות מחושבים לכל שלב זמן. קבע פעילות פוטנציאל סופית מהצעד הזמן עם הפעילות הגבוהה ביותר. אם ערכי פעילות ימשיכו לעלות ולאחר מכן צעדי מועד מאוחר יותר ייתכן שיידרשו, אם ערכי פעילות ליפול througהאוט במהלך הריצה, ולאחר מכן להפעיל שוב עם צעדי זמן קצרים יותר. הפעילות האחרונה היא בnmoles של מצע נצרך שעה ^-1 מיליליטר ^-1 אך ניתן לשנותם עד כדי להביע כμmoles שעה ^-1 L ^-1.

תוצאות

קרקעות ומשקעים ימיים יש בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזים תאית כתוצאה מקהילות המצורפות חיידקים (biofilms) גובר על פני השטח של חלקיקים. איור 3 מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל של חלקיקים המתקבלים מהמשקעים של כשליש המשטח זרם כדי שבצפון מיסיסיפי, ארה"ב. מחקר קודם הראה כי קהילות חיידקים על חלקיקי משקעים מהזרם הזה ניתן להפריד לשלוש קבוצות מובחנות המבוססות על ניתוח מולקולרי של מבנה הקהילה שלהם: אלה ב0.063 חלקיקי מ"מ, אלה על 0.125, 0.25, ו0.5 מ"מ ח...

דיון

קביעת הפעילות של מגוון רחב של אנזימים תאיים של חיידקים בקרקעות ומשקעים יכולות לספק תובנות שימושיות לשיעורים של מינרליזציה התזונתית ועיבוד חומר אורגני ^17. עם זאת, קרקעות יכולות להשתנות ברמות הלחות שלהם, ולכן חשוב לבצע סטנדרטיזציה של פעילות למשקל יבש אדמה. זה דורש צעד נוסף ייבוש (בדרך כלל של שני ימים) מעבר פשוט מדידת פעילות אנזים. לפיכך, בניגוד למבחנים של פעילות אנזים בדגימות מים המספקות ליד תוצאות מיידיים, מבחני אמינים של פעילות אנזים באדמה ומשקעים לקחת כמה ימים. עבור חל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים וחומרים
חומצה			ספקים שונים
נתרן אצטט			ספקים שונים
נתרן הידרוקסיד			ספקים שונים
p-ניטרופנול	פישר	BP612-1	חלופות זמינות
p-ניטרופניל (pNP)-פוספט	סיגמא	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-
pNP-β-N-acetyl glucosaminide	Sigma	N9376	p מצע NP
96 בארות מיקרו-פלטות	פישר	12-563-301	חלופות זמינות
96 בארות עמוקות בארות	בלוקים Costar	3958	חלופות זמינות
מחבתות			ספקים שונים
צינורות			ספקים שונים
		צנטריפוגה סטריליים 50 מ"ל	ספקים שונים
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-פוספט	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetyl glucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
נתרן ביקרבונט			ספקים שונים
שחור 96-באר מיקרופלייט	Costar	3792
מאגר			ספקים
<חזק>ציוד
צנטריפוגה	Eppendorf	5810R
צנטריפוגה רוטור	Eppendorf	A-4-81	עבור מיקרופלטות/בלוקים
עמוקיםקורא Microplate	BioTek	Synergy HT	Alternates זמין
פלואורומטר Microplate	BioTek	FLx 800	חלופות זמין
פיפטור			ספקים שונים