Method Article

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

DOI:

10.3791/50410

⸱

April 9th, 2013

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2División de Estudios de Posgrado e Investigación, Facultad de Odontología, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Department of Immunology, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעינים בודדים

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי. תאים אלה הם ראשונים שמופיעים באתרים של דלקת וזיהום, ובכך להפוך את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים. נויטרופילים בעלי פונקציות מיקרוביאלית חשובות כגון phagocytosis, שחרורו של אנזימי ממוסס, וייצור של מיני חמצן תגובתי. בנוסף לפונקציות בטחוניות החשובות אלה, נויטרופילים לבצע משימות אחרות בתגובה לזיהום, כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. ציטוקינים לגייס לויקוציטים האחר המסייעים לנקות את הזיהום, ועיכוב של אפופטוזיס מאפשר נויטרופילים לחיות זמן רב יותר באתר של זיהום. פונקציות אלה מוסדרות ברמה של שעתוק. עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות תעתיק מוסדר בתאים אלו לא ניתנים לביצוע בשיטות קונבנציונליות גן כתב מאז אין אפיםטכניקות cient עבור transfection נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד נויטרופילים טהורים מדם היקפי אנושי, לעורר תאים אלו עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה. השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור NF-κB וElk 1-גורמים גרעיניים בגרעינים מנויטרופילים וסוגי תאים אחרים. לכן, שיטה זו מייצגת אפשרות לניתוח הפעלה של גורמי שעתוק בגרעינים בודדים מתוך מגוון של סוגי תאים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי 1. במהלך נויטרופילים דלקת והזיהום הם התאים הראשונים שמופיעים באתר המושפע שם הם משמשים כקו ההגנה הראשון 2. נויטרופילים יש מספר מנגנונים מיקרוביאלית 3 כולל phagocytosis, ייצור של מיני חמצן תגובתי, שחרורו של אנזימי ממוסס ידי degranulation, וייצור של ציטוקינים מעודדים דלקת 4.5. הנויטרופילים הם תאים קצרי חיים שמקבלים מופעלים במהירות דרך איתות מהקולטנים בתא שטח שונים. למרות נויטרופילים כבר נחשבים תאים סופניים עקב חייו הקצרים שלהם ובגלל שהם עוברים אפופטוזיס אלא אם הופעל במהלך התהליך הדלקתי 6, עכשיו זה ברור שהם יכולים גם לשנות פ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד של נויטרופילים (PMN) מדם אדם

  1. השתמש כ 20 מיליליטר דם אדם בפרין (10 U / ml) כנוגד קרישה. דם נאסף ממתנדבים בריאים במבוגרי venopuncture. כל הניסויים נעשו במסגרת אישור ועדת ביואתיקה במכון Biomédicas Investigaciones דה - UNAM.
  2. שים 2 מ"ל של 6% dextran T500 ב PBS לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של דם. מערבב על ידי היפוך הצינורית פעמים או שלוש ולתת לו לשבת במשך 45 דקות על מנת לאפשר לשקיעת דם.
  3. בצינור טרי 15 מיליליטר חרוטי צנ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת הטיהור המתוארת כאן בדרך כלל מספק נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (איור 1 א). PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. יש לנו מגורה PMN דרך קולטנים וintegrins FC (1B איור). ברגע מגורה, PMN הם lysed וגרעינים מבודדים עם תשואות גבוהות. אז גרעיני immunolabeled לפקטור גרעיני מסוים, כגון גורם κB הגרעיני (NF-κB), עם נוגדנים ספציפיים (1B איור).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת הטיהור המתוארת כאן מאפשרת בידוד של נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (הערכה על ידי תצפית מיקרוסקופית), בזמן קצר. לפעמים הנויטרופילים יכולים להיות מזוהמים על ידי אריתרוציטים אם האחרון לא lysed לחלוטין. זה בדרך כלל אינו משפיע על הטכניקה, שכן בקלות ניתן להבחין אריתרוציטים וPMN כאוכלוסיות תאים שונות על ידי cytometry זרימה. PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. למעשה, PMN יכול גם להיות מגורה על ידי אמצעים ת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לננסי מורה לקבלת הסיוע הטכני שלה.

עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר 48573-M ו168098 מConsejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, מקסיקו, ועל ידי מענקי IN212308 וIN205311-2 מDireccion הגנרל דה Asuntos דל האישי Academico, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו, מקסיקו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ריאגנטים
הפרין PiSA (מקסיקו)
Dextran T500Pharmacosmos A/S (הולבק, דנמרק)T1-Dextran T500
Ficoll-PaquePharmacia17-0320-01
נתרן כלורי SigmaS7653
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמאS9638
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמאS9390
אלבומין בסרום בקר (BSA)SigmaA2153Cohn Fraction V
HEPESSigmaH3375
אשלגן כלוריSigmaP9541
מגנזיום כלוריד נטול מים M8266
DL- דיתיותרייטול (DTT) SigmaD9163
טריפן כחול (0.4% תמיסה)SigmaT8154
ParaformaldehydeSigmaP6148
Triton X-100 SigmaX100
סרום בקר עוברי (FBS)GIBCO10437-028
נוגדן חד-שבטי IV.3Medarex (אננדייל, ניו ג'רזי)025-1נוגדן חד-שבטי ספציפי לאדם (CD32)
3G8Medarex (אננדייל, ניו ג'רזי)028-2נוגדן חד-שבטי ספציפי לאדם (CD16)
TS2/16המכון לחקר הסרטן ע"ש דנה פרבר (בוסטון, מסצ'וסטס)נתרם על ידי ד"ר מרטין המלרנוגדן ספציפי לאדם β 1 אינטגרין (CD29)
נוגדן חד שבטי IB4אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקונתרם על ידי ד"ר אריק ג'יי בראוןאנטי-&&β ספציפי לאדם; 2 אינטגרין (CD18)
F(ab')2 עיזים נגד עכבר IgG Cappel (אורורה, אוהיו)55468
מצומד FITC F(ab')2 עיזים נגד עכברIgG Cappel (אורורה, אוהיו)55522
מצומד FITC-F(ab')2 עיזים נגד ארנבIgG Cappel (אורורה, אוהיו)55665
Anti-NF-κ B p50סנטה קרוז ביוטכנולוגיה (סנטה קרוז, קליפורניה)sc-114נוגדן רב-שבטי ארנב
אנטי-NF-κ B p65Santa Cruz Biotechnology (סנטה קרוז, קליפורניה)sc-109נוגדן פוליקלונלי ארנב
<חזק>ציוד15 מ"ל צינור צנטריפוגה קורנינג 430791 50 מ"ל צנטריפוגה קורנינג 430291 צנטריפוגה, Sorvall Tabletop Dupont Instruments RT 6000D pH-meter
קורנינג340
פיפטמן פיפטה P-20גילסוןF123600
פיפטמן פיפטה P-200גילסוןF123601
פיפטמן פיפטה P-1000גילסוןF123602
המוציטומטרפישר סיינטיפיק0267110
מיקרוסקופניקוןאקליפס E600
מיקרוסקופ הפוךניקוןTMS
אמבט מים חממהפישר סיינטיפיק2IS-M
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף5414C
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף5418
זרימה ציטומטרבקטון דיקינסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי)FACScalibur

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neutrophil IsolationFlow CytometryNuclear Factor DetectionNF kappa B AnalysisHuman Peripheral BloodDextran SedimentationDensity Gradient CentrifugationNuclei ImmunolabelingTranscription Factor ActivationCell Stimulation

Related Articles