הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

17.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50425

⸱

14 בנובמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי ומפורט לצביעה חיסונית כפולה בחלקי רקמת מערכת העצבים המרכזית של חולדה (CNS) ובלוטות הלימפה ההיקפית (LN) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

תקציר

אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספק מאוד להדמית חלבון מסוימת, אמינה ואטרקטיבית. אחוזי הצלחה ופרשנות של תיוג ססגוני מבוסס IHC הוא מאתגר, במיוחד כאשר נעשו שימוש להערכת גומלין בין חלבוני היעד בתוך הרקמה עם תכולת שומן גבוהה, כגון מערכת העצבים המרכזית (CNS).

הפרוטוקול שלנו מייצג עידון של טכניקת immunolabeling תקן המותאמת במיוחד עבור זיהוי של שני חלבונים המבניים מסיסים בחולדה CNS ובלוטות לימפה היקפיות (LN) מושפעות neuroinflammation. עם זאת, עם או בלי שינויים נוספים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש סבירה לגילוי מטרות חלבון נלווים אחרות, אפילו באיברים ומינים אחרים מאשר כאן מוצגים.

מבוא

למרות ניצול של תפוקה גבוהה מתקדמת וניתוחים שבוצעו על methylome, transcriptome או אפילו ברמה proteome, immunostaining נותר תקן הזהב לגילוי חלבון ישירות במדגם רקמות, תרבית תאים או למרוח התא. מדגים את דפוס לוקליזציה / הפצה, אימונוהיסטוכימיה (IHC) עשויה להעריך יחסי יחסי גומלין הטופוגרפי של חלבוני היעד, ואף מצביעה פעילויות הביולוגיות שלהם. לכן, IHC מנוצל נרחב למטרות קליניות ומחקר, למשל, לאבחון, טיפול הערכות, חקר מנגנוני מחלה, שינויים פונקציונליים phenotypical במודלים של בעלי חיים, וכו '

שעיקרן היסטולוגיה, פתולוגיה, ביוכימיה ואימונולוגיה, IHC התקדמה באופן משמעותי מאז שנת 1941, כאשר fluorescently שכותרתו נוגדנים שימשו בפעם הראשונה לזהות אנטיגנים דלקת ריאות בתוך הרקמה הנגוע 1. Visualization של מוצרים ורכיבים הסלולר על ידי IHC מבוסס על הכריכה של נוגדנים (ABS) כדי אנטיגן הספציפי שלהם (Ag). חוץ מזה באמצעות נוגדנים מתויג fluorophore, תגובות חיסוניות יכול גם להיות דמיינו באמצעות אנזימים כמו phosphatase peroxidase 2,3 או אלקליין 4. יתר על כן, נוגדנים זהב-tagged קולואידים 5 משמשים לאיתור אינטראקציה אנטיגן-נוגדן ספציפי על ידי שני אור במיקרוסקופ אלקטרונים, בעוד תוויות רדיואקטיביים הם דמיינו ידי autoradiography.

Immunoreaction Ag-Ab ניתן לאתר באמצעות שיטות ישירות ועקיפות. השיטה הישירה היא למעשה לקל ולפשוט יותר, כפי שהיא עושה שימוש שכותרתו ישירות העיקרי Abs 6. עם זאת, בשל חוסר משמעותי של רגישות, שיטות עקיפות הם העדיפו את אלה הישירים. שני שלבי נהלי זיהוי עקיפים דורשים ללא תווית Abs העיקרי, כמו הראשון, ומסומן Abs משני המכוון נגד Abs העיקרי, כמו השכבה השנייה 7.הגברה האות יכולה להיות מושגת על ידי מעורבים נוספים, Ab שלישוני מצמידים אנזים (השיטה העקיפה שלושה שלבים) הנקשרת Ab משנית. בדרך כלל שיטות זיהוי עקיף בהם נעשה שימוש הם ביוטין avidin ו peroxidase-antiperoxidase (PAP). לחלופין, phosphatase phosphatase-antialkaline אלקליין (APAAP) מורכב יכול לשמש במקום שיטת PAP. יש לציין, phosphatase אלקליין (AP) שיטות להיראות אפילו יותר רגיש מאשר שיטות אימונו-4. שיטת avidin ביוטין המורכבת (ABC) משתמשת Ab משני biotinylated בשילוב עם-avidin ביוטין המסווג המורכב (LAB), או שכותרתו ביוטין-streptavidin מורכב (לוח). רגישות זיהוי ניתן להגדיל עוד יותר על ידי מעורבים avidin שכותרתו עם phosphatase peroxidase או אלקליין 8. שיטות זיהוי אחרות לשימוש הן תיוג פולימריים, הגברת טירמין ו חיסוני מתגלגל מעגל 9. יש לציין, שיטות זיהוי שונות ניתן לשלב לגילוי Ag מרובה באותו הרקמותמדגם, אשר דווח לראשונה בשנת 1978 4. immunostaining הכפול סימולטני המוצג כאן בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין CNS ו LN סעיפי רקמות באמצעות נוגדנים משני peroxidase הנכנס ו AP מצומדות, בהתאמה. האותות היו דמיינו באמצעות 3,3'-diaminobencidine (DAB) אַב צֶבַע ואת הכחול המהיר (FB) APAAP מורכבת, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרה אתית
מחקר נוכחי מתבצע על פי הנחיות מן המועצה הארצית השבדית עבור בחיות מעבדה ואת הנחיית מועצת הקהילה האירופית (86/609 / EEC) תחת ההיתרים האתיים N338 / 09, N15 / 10 ו N65 / 10, אשר אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים בצפון שטוקהולם.

1. רקמות הכנה

  1. זלוף & קיבעון
    1. להרדים את החיה עם isoflurane לבצע זלוף transcardial דרך החדר השמאלי. ליזום את השטיפה של כלי דם עם בופר פוספט (PBS) כדי להסיר את רכיבי דם, ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PBS (PFA).
    2. לקבע מוחות גזור, מיתרי השדרה ורקמות LN היקפי ידי טבילה לתוך PFA. לאחר 24 שעות ב 4 ° C, להעביר את הרקמה מן PFA לתוך PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. לחלופין כדי PBS מסחרי, לפזר 9 גרם NaCl ב 250 מ"ל ה- S &# 246; rensen חיץ להוסיף 750 מ"ל מים deionized (DH 2 O); להכין חיץ M סורנסן 0.2 (pH 7.4) לפזר 13.8 גרם לאא 2 PO 4 x 1H 2 O ו 71.2 גרם Na 2 HPO 4 x 2H 2 O ב 2.5 L DH 2 O.
  2. התייבשות & הטבעה
    1. חותכים את הרקמה לתוך כ חלקים 5 מ"מ עובי באמצעות סכין גילוח.
    2. ליזום תהליך התקשות רקמות (התייבשות) באמצעות מעבד הסתננות אבק VIP רקמות-Tek (הליך סטנדרטי מבוסס על השקיעה לתוך ריכוזי עולה של אתנול, ואחריו פרפין קסילן ולבסוף (טבלה 1).
    3. הנח את הרקמה בתוך תבנית ושופך את פרפין הנוזלי סביב המדגם כדי ליצור "בלוק פרפין". אחסון לטווח ארוך דורש בטמפרטורת החדר (RT). עם זאת, לפני חתך, היא מומלצת להתקרר אבני, למשל, לילה (o / n) בשעה 4 מעלות צלזיוס.

2. חתך

  1. מניחים את גוש פרפין לתוך מחזיק קבוע המזחלת microtome, אשר יכול לנוע קדימה ואחורה על פני הסכין. התאם את הזווית האופטימלית בין הגוש וסכין microtome (זה תלוי בגיאומטרית סכין, אלא גם על מהירות החיתוך וטכניקה).
  2. חותכים 3 - 5 מיקרומטר עבה בחיתוכים מהגוש פרפין.
  3. העבר רק סעיף לחתוך לתוך מיכל מים ולעגן אותה ובהמשך מהמים לשקופית זכוכית.
  4. לחץ על הסעיף הרכוב בזהירות נגד מגבת נייר כדי להסיר שאריות מים ובועות אוויר פוטנציאליות. מסחרי מראש צופה שקופיות זכוכית דבקות הם מומלצות.
  5. ניקוי רכוב שקופיות במשך כמה שעות בתנור על 50 - 60 מעלות צלזיוס.

3. Deparaffinization (Rehydration & חסימת אנדוגני Peroxidase)

  1. לטבול את השקופיות 2x לתוך קסילן (תחליף קסילן לחילופיןXEM-200), בכל פעם 15 - 20 '.
  2. לשטוף באתנול 99%.
  3. כדי לחסום את פעילות peroxidase אנדוגני, דגירת הסעיפים 30 'בתמיסת מתנול המכילה מי חמצן 0.25% מימן.
  4. המשך התייבשות באמצעות אתנול עם הגדלת תכולת מים (99%, 70%, ובסופו של דבר במים מזוקקים.
  5. מנקודה זו עד ההרכבה של תלושים לכסות חלקים צריכים להישמר לחה.

4. אחזור Antigen

  1. להשתמש ספינת מזון להרתחת השקופיות פתרון אחזור אנטיגן (במקרה זה EDTA pH 8.5 חיץ) עבור 60 '(פתרון למלאי EDTA מכיל 1.21 גרם טריס ו EDTA 0.37 גרם מומס ב 50 מ"ל DH 2 O; להכין את העבודה פתרון לדלל פתרון 2.5mL EDTA המניות 47.5 מ"ל dH 2 O).
  2. לצנן את השקופיות על RT עבור כ. hr 1 ולאחר מכן לשטוף 3 - 5x עם טריס שנאגרו מלוחים (TBS, השתמש לחילופין PBS) המורכב 0.05 מ 'טריס ו 0.15 M NaCl; wi pH 7.5 מותאםה HCl. לחלופין להשתמש TBS מסחרי.

5. חסימת אתרי הקישור הנוקבת

  1. כדי למנוע תגובות רקע נוקבות, דגירת מדורי RT במשך 30 'בפתרון החסימה המכיל סרום עובר עגל 10% (FCS) ו -90% חיץ DAKO.

6. זוגי immunolabeling: דגירה סימולטני עם Abs הראשי

  1. לדלל הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים בפתרון חסימת דגירה o / n ב 4 מעלות צלזיוס. עבור immunostaining כפול לשלב α-eotaxin (Ccl11; 1: 300) עם α-Cd68 (ED1; 1: 1,000) או α-Iba1 (Aif1, 1: 1,000) או α-Cd8α (שור-8; 1: 200) .
  2. יש לשטוף את השקופיות 3-5x עם TBS חיץ (להשתמש לחילופין 10x מדולל חיץ DAKO).
  3. לדלל כמות הנדרשת של נוגדנים משני (אנטי-עז biotinylated ו AP מצומדות ועכבר אנטי, הוא 1: 200) בתמיסת חסימת דגירת 1 hr על RT.
  4. יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ (לנודואר לחילופין 10x מדולל חיץ DAKO).
  5. דגירה השקופיות עם מורכבות peroxidase-חזרת avidin (HRP) מדולל הפתרון חוסם עבור שעה 1 על RT.
  6. יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ (להשתמש לחילופין 10x חיץ בדילול DAKO).

ויזואליזציה 7.

  1. ויזואליזציה של נוגדנים משני AP שכותרתו כבול
    1. הכן 0.1 M Tris-HCl חיץ ידי המסת טריס 12.1 גרם 1 L DH 2 O ו להתאים את pH באמצעות HCl. השתמש חיץ טריס-HCl אותו להכין 1 M פתרון levamisole. כן טרי 4% פתרון Nano 2 ב DH 2 O.
    2. כדי לקבל 50 מ"ל של המצע כחול (FB) מהיר (נפח נדרש אחד קובט זכוכית רגילה) לפזר 6.25 מ"ג Naphtol-AS-MX-פוספט ב 312.5 μl DMF בצינור זכוכית ומערבבים לתוך 50 מ"ל של טרום התחמם (37 מעלות צלזיוס) חיץ טריס-HCl. כדי לפזר 12.5 מ"ג FB RR מלח 312.5 μl 2 N HCl להוסיף 312.5 μl של בעבר prepaאדום 4% פתרון Nano 2 ומערבבים את התערובת לתוך אותו 50 מ"ל של חיץ מראש חימם Tris-HCl. לנער קל עד שהנוזלים הצהובים מתבהרים ולבסוף להוסיף 77 μl של פתרון בעבר הכין 1 M Levamisole. תסנין המתקבל תערובת ויוצקים על גבי שקופיות להציב קובט זכוכית.
    3. ליזום את הדגירה על 37 מעלות צלזיוס ולשלוט בפיתוח תהליך תחת מיקרוסקופ אור כ. כל 15 - 30 דקות. אם פונה מטושטש, להחליף את פתרון FB בתערובת טרייה.
    4. יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ ולהעביר לאחר מכן למאגר PBS.
  2. ויזואליזציה של נוגדנים משני biotinylated כבול
    1. הכן DAB / H 2 O 2 לפתח פתרון על ידי דילול 1 מ"ל פתרון המניות DAB (25 מ"ג DAB לכל 1 מ"ל PBS) ב 49 מ"ל PBS. להוסיף 16.5 μl H 2 O 2 ו תסנין לפני לשפוך על הסעיפים.
    2. המרה של DAB אַב צֶבַע לתוך המצח מזרזפיגמנט n יכול להיות מיידי. לשלוט בתהליך הפיתוח תחת מיקרוסקופ האור (אפילו כמה דגירה כבר שנייה עשויים להעלות רקע גבוה ומסווה את האות המסוימת).
    3. עוצמת המשקע פיגמנט חום ניתן לשפר לחילופין על ידי הדגרה הפתרון המורכב בגפרת-נחושת 2% ו -0.9% NaCl עבור 5 '.
    4. יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם PBS ולבסוף עם DH 2 O, להשתמש לחילופין מי ברז.
    5. הר שקופיות עם תלושי לכסות ישירות מהמים באמצעות הרכבה בינונית GelTol מימית. הימנע מיצירת בועות אוויר.
    6. אפשר ייבוש מלא של הרכבה בינונית, למשל, o / n ב 4 ° C.. חנות יבשה שקופיות על RT.
1. % אתנול 20 ' 40 ° C
2. % אתנול 60 &# 39; 40 ° C
3. % אתנול 90 ' 40 ° C
4. % אתנול 60 ' 40 ° C
5. % אתנול 90 ' 40 ° C
6. % אתנול 60 ' 40 ° C
7. % אתנול 90 ' 40 ° C
8. % אתנול 120 ' 40 ° C
9. Xylol 30 ' 40 ° C
10. Xylol 60 ' 40 ° C
11. פָּרָפִין 60 ' 60 ° C
12. פָּרָפִין 60 ' 60 ° C
13. פָּרָפִין 60 ' 60 ° C
14. פָּרָפִין 120 ' 60 ° C

עיבוד רקמות בטבלה 1. על ידי מעבד הסתננות אבק VIP רקמות-Tek.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

immunostainings הזוגי (שיתוף stainings) בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי CNS ו LN. 3-5 מיקרומטר פרוסות עבות רקמות נחתכו באמצעות מזחלת microtome, רכוב ובהמשך על גבי שקופיות זכוכית דבקות מראש מצופה ומטופל כפי שתואר לעיל 10,11,12. בקצרה, לאחר deparaffinizing, התייבשות רקמות איון peroxidase אנדוגני, סעיפים היו נתונים בתהליך יחזור אנטיגן, ואחריו צעד חסימה לחסל אתרי קישור נוקבים. שיתוף stainings בוצעו, לפי הצירופים הבאים: i) C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נהלי IHC רגילים לעתים קרובות דורשים התאמות ספציפיות כדי להשיג תוצאה אופטימלית, מה שמרמז ניסיון רב נפוץ אבל גם "ניסוי וטעייה" גישה. מ הכנת רקמה עד להדמית היעד, כמעט כל צעד בפרוטוקול עלול להיות כפוף להם כדי המעוצבים באופן אינדיבידואלי שינויים על מנת לשפר את התוצאה הסופית. פרוטוקול מכתים זוגי המוצג כאן מדגים חלבון מבוסס IHC מיקוד מותאם במיוחד להערכת גומלין בין חלבוני היעד של העניין שלנו קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי רקמות CNS ו LN מושפעים neuroinflammation. כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים להנס לאסמן ויאן באואר על ההדרכה והתמיכה. אנו מודים גם לקטלין בנדק על הסיוע הטכני המצוין ולקרוליין ווסטרלונד על ההערכה הביקורתית והלשונית.

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ-Biogen Idec, קרן ונר-גרן, מועצת המחקר השוודית, האגודה השוודית לאנשים עם מוגבלויות נוירולוגיות, קרן המוח השוודית, המסגרת השישית של האיחוד האירופי EURATools (LSHG-CT-2005-019015) ו-Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט
איזופלורן (איזופלורן): 1-כלור-2,2,2-טריפלואוראתיל (אתר דיפלואורמתיל) 2-כלור-2-(דיפלואורמתוקסי)-1,1,1-טריפלואורתן (C<תת>3H<תת>2ClF<תת>5O)בקסטר1001936060הקרנת עיניים. כנראה משפיע על הפוריות ופוגע בתינוק ברחם. יש לתת רק בסביבת הרדמה מאובזרת כראוי.
סודיום כלוריד (NaCl)Merck1.0604
פוספט בופר מלח (PBS), טבליהSigma-AldrichP4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% ב-1x PBSApl pharma34 24 28סכנה בריאותית. מאכל. דליק. רעילות חריפה.
אתנול ≥ 99.5%, מוחלט (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1Lדליק.
קסילן (קסילנים, דרגה היסטולוגית; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Flamable. רעילות חריפה.
Histo-Comp שעוות פרפיןרקמה-TekV0-5-1001
שקופיות מיקרוסקופ דבקStarfrostMIC-1040-W
תחליף קסילול XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200רגישות נשימתית. מסרטן.
α-CD8 (Ox-8) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוניAbD SerotecMCA48G
α-Iba1 (AIF1) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוניMilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוניAbD SerotecMCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) נגד חולדות עזים, נוגדן ראשוניSanta Cruz BTSC-6181
נוגדן משני מצומד פוספטאז אלקליין (AP)Dakopatts, דנמרקD0314
נוגדן משני ביוטינילציהאמרשם ביוטקRPN1025
אבידין- קומפלקס פרוקסידאז חזרת (HRP) סיגמא-אולדריץ'A3151
נפתול AS-MX פוספט (C19H18NO5P)סיגמא-אולדריץ'N4875-1Gרעילות חריפה.
מלח RR כחול מהיר, אזואיקון דיאזו מס' 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742רעילות חריפה.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen)DAKOS3000דליק מאוד. רעיל.
נחושת גופרתית (CuSO4)Merck1.02791רעילות חריפה. ערפול סביבתי.
GelTol הרכבה מימית בינוניתThermo Electron Corporation230100
מי חמצן, 30% (H2O2)Merck107210רעילות חריפה.
מתנול (CH3OH)Fluka65543רעילות חריפה. רגישות נשימתית. מסרטן. דליק.
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן, בסיס TRIS (C<תת>4H<תת>11NO3)AppliChemA1379גירוי בעור ובעיניים.
Tris Buffered Sabe (TBS), טבליהSigma-AldrichT5030
די-סודיום מימן פוספט דיהידראט (Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
נתרן דימימן פוספט מונוהידרט (NaH2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
סרום עגל עוברי (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO מאגר שטיפת ציטומציה 10x DAKOS3006יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות; C לעיכוב צמיחת חיידקים. הימנע מקצף.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO)Fluka40250דליק. רעילות חריפה.
כיסויי Glas 24 x 36 מ"מ Menzel-Glä serBB024036A1
חומצה הידרוכלורית, conc. (HCl)Sigma-Aldrich30721מאכל, מגרה, מחלחל. רגיש לריאות (בצורת ערפל חומצי). רעיל.
תמיסת חומצה הידרוכלורית נפחית, 2 M HCl (2 N)Fluka71826מאכל, מגרה, מחלחל. רגיש לריאות (בצורת ערפל חומצי). רעיל.
נתרן ניטריט, ריאגנט פלוס, ≥ 99.0% (NaNO2)מחמצן Sigma-AldrichS2252. רעיל. מסוכן לסביבה.
חומצה אתילנדיניטרילוטטראצטית מלח דיסודיום דיהידראט (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454חשיפה אוראלית עלולה לגרום להשפעות רבייה והתפתחותיות.
<חזק> ציוד
Tissue-TekV.I.P מעבד הסתננות ואקוםSakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 הרץ
האקר-ברייט 8000 סדרה בסיס מזחלת מיקרוטום מכשירי האקר מכשירי
קיטור מזון ביתי בראוןMultiGourmet FS 20
מיקרוסקופ אור Leica Polyvar 2

מקורות

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794(2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Avidin Horseradish Peroxidase
Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.