אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי ומפורט לצביעה חיסונית כפולה בחלקי רקמת מערכת העצבים המרכזית של חולדה (CNS) ובלוטות הלימפה ההיקפית (LN) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות
במאמר זה
סיכום
תקציר
אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספק מאוד להדמית חלבון מסוימת, אמינה ואטרקטיבית. אחוזי הצלחה ופרשנות של תיוג ססגוני מבוסס IHC הוא מאתגר, במיוחד כאשר נעשו שימוש להערכת גומלין בין חלבוני היעד בתוך הרקמה עם תכולת שומן גבוהה, כגון מערכת העצבים המרכזית (CNS).
הפרוטוקול שלנו מייצג עידון של טכניקת immunolabeling תקן המותאמת במיוחד עבור זיהוי של שני חלבונים המבניים מסיסים בחולדה CNS ובלוטות לימפה היקפיות (LN) מושפעות neuroinflammation. עם זאת, עם או בלי שינויים נוספים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש סבירה לגילוי מטרות חלבון נלווים אחרות, אפילו באיברים ומינים אחרים מאשר כאן מוצגים.
מבוא
למרות ניצול של תפוקה גבוהה מתקדמת וניתוחים שבוצעו על methylome, transcriptome או אפילו ברמה proteome, immunostaining נותר תקן הזהב לגילוי חלבון ישירות במדגם רקמות, תרבית תאים או למרוח התא. מדגים את דפוס לוקליזציה / הפצה, אימונוהיסטוכימיה (IHC) עשויה להעריך יחסי יחסי גומלין הטופוגרפי של חלבוני היעד, ואף מצביעה פעילויות הביולוגיות שלהם. לכן, IHC מנוצל נרחב למטרות קליניות ומחקר, למשל, לאבחון, טיפול הערכות, חקר מנגנוני מחלה, שינויים פונקציונליים phenotypical במודלים של בעלי חיים, וכו '
שעיקרן היסטולוגיה, פתולוגיה, ביוכימיה ואימונולוגיה, IHC ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרה אתית
מחקר נוכחי מתבצע על פי הנחיות מן המועצה הארצית השבדית עבור בחיות מעבדה ואת הנחיית מועצת הקהילה האירופית (86/609 / EEC) תחת ההיתרים האתיים N338 / 09, N15 / 10 ו N65 / 10, אשר אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים בצפון שטוקהולם.
1. רקמות הכנה
- זלוף & קיבעון
- להרדים את החיה עם isoflurane לבצע זלוף transcardial דרך החדר השמאלי. ליזום את השט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
immunostainings הזוגי (שיתוף stainings) בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי CNS ו LN. 3-5 מיקרומטר פרוסות עבות רקמות נחתכו באמצעות מזחלת microtome, רכוב ובהמשך על גבי שקופיות זכוכית דבקות מראש מצופה ומטופל כפי שתואר לעיל 10,11,12. בקצרה, לאחר deparaffinizing, התייבשות רקמות איון peroxidase אנדוגני, סעיפים היו נתונים בתהליך יחזור אנטיגן, ואחריו צעד חסימה לחסל אתרי קישור נוקבים. שיתוף stainings בוצעו, לפי הצירופים הבאים: i) C.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נהלי IHC רגילים לעתים קרובות דורשים התאמות ספציפיות כדי להשיג תוצאה אופטימלית, מה שמרמז ניסיון רב נפוץ אבל גם "ניסוי וטעייה" גישה. מ הכנת רקמה עד להדמית היעד, כמעט כל צעד בפרוטוקול עלול להיות כפוף להם כדי המעוצבים באופן אינדיבידואלי שינויים על מנת לשפר את התוצאה הסופית. פרוטוקול מכתים זוגי המוצג כאן מדגים חלבון מבוסס IHC מיקוד מותאם במיוחד להערכת גומלין בין חלבוני היעד של העניין שלנו קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי רקמות CNS ו LN מושפעים neuroinflammation. כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
תודות
אנו מודים להנס לאסמן ויאן באואר על ההדרכה והתמיכה. אנו מודים גם לקטלין בנדק על הסיוע הטכני המצוין ולקרוליין ווסטרלונד על ההערכה הביקורתית והלשונית.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ-Biogen Idec, קרן ונר-גרן, מועצת המחקר השוודית, האגודה השוודית לאנשים עם מוגבלויות נוירולוגיות, קרן המוח השוודית, המסגרת השישית של האיחוד האירופי EURATools (LSHG-CT-2005-019015) ו-Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנט | |||
| איזופלורן (איזופלורן): 1-כלור-2,2,2-טריפלואוראתיל (אתר דיפלואורמתיל) 2-כלור-2-(דיפלואורמתוקסי)-1,1,1-טריפלואורתן (C<תת>3H<תת>2ClF<תת>5O) | בקסטר | 1001936060 | הקרנת עיניים. כנראה משפיע על הפוריות ופוגע בתינוק ברחם. יש לתת רק בסביבת הרדמה מאובזרת כראוי. |
| סודיום כלוריד (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| פוספט בופר מלח (PBS), טבליה | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% ב-1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | סכנה בריאותית. מאכל. דליק. רעילות חריפה. |
| אתנול ≥ 99.5%, מוחלט (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | דליק. |
| קסילן (קסילנים, דרגה היסטולוגית; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. רעילות חריפה. |
| Histo-Comp שעוות פרפין | רקמה-Tek | V0-5-1001 | |
| שקופיות מיקרוסקופ דבק | Starfrost | MIC-1040-W | |
| תחליף קסילול XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | רגישות נשימתית. מסרטן. |
| α-CD8 (Ox-8) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוני | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוני | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) עכבר נגד חולדות, נוגדן ראשוני | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) נגד חולדות עזים, נוגדן ראשוני | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| נוגדן משני מצומד פוספטאז אלקליין (AP) | Dakopatts, דנמרק | D0314 | |
| נוגדן משני ביוטינילציה | אמרשם ביוטק | RPN1025 | |
| אבידין- קומפלקס פרוקסידאז חזרת (HRP) | סיגמא-אולדריץ' | A3151 | |
| נפתול AS-MX פוספט (C19H18NO5P) | סיגמא-אולדריץ' | N4875-1G | רעילות חריפה. |
| מלח RR כחול מהיר, אזואיקון דיאזו מס' 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | רעילות חריפה. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | דליק מאוד. רעיל. |
| נחושת גופרתית (CuSO4) | Merck | 1.02791 | רעילות חריפה. ערפול סביבתי. |
| GelTol הרכבה מימית בינונית | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| מי חמצן, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | רעילות חריפה. |
| מתנול (CH3OH) | Fluka | 65543 | רעילות חריפה. רגישות נשימתית. מסרטן. דליק. |
| טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן, בסיס TRIS (C<תת>4H<תת>11NO3) | AppliChem | A1379 | גירוי בעור ובעיניים. |
| Tris Buffered Sabe (TBS), טבליה | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| די-סודיום מימן פוספט דיהידראט (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| נתרן דימימן פוספט מונוהידרט (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO מאגר שטיפת ציטומציה 10x | DAKO | S3006 | יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות; C לעיכוב צמיחת חיידקים. הימנע מקצף. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | דליק. רעילות חריפה. |
| כיסויי Glas 24 x 36 מ"מ | Menzel-Glä ser | BB024036A1 | |
| חומצה הידרוכלורית, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | מאכל, מגרה, מחלחל. רגיש לריאות (בצורת ערפל חומצי). רעיל. |
| תמיסת חומצה הידרוכלורית נפחית, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | מאכל, מגרה, מחלחל. רגיש לריאות (בצורת ערפל חומצי). רעיל. |
| נתרן ניטריט, ריאגנט פלוס, ≥ 99.0% (NaNO2) | מחמצן Sigma-Aldrich | S2252 | . רעיל. מסוכן לסביבה. |
| חומצה אתילנדיניטרילוטטראצטית מלח דיסודיום דיהידראט (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | חשיפה אוראלית עלולה לגרום להשפעות רבייה והתפתחותיות. |
| <חזק> ציוד | |||
| Tissue-TekV.I.P מעבד הסתננות ואקום | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 הרץ | |
| האקר-ברייט 8000 סדרה בסיס מזחלת מיקרוטום | מכשירי האקר מכשירי | ||
| קיטור מזון ביתי | בראון | MultiGourmet FS 20 | |
| מיקרוסקופ אור | Leica Polyvar 2 |
מקורות
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
