<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

סיכום

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies בתולעת ג elegans. אנחנו מראים כיצד לבנות תולעים מבטאים Aβ האנושי ₄₂ בתאי עצב וכיצד לבדוק את תפקודם במבחני התנהגות. בנוסף, אנו מראים כיצד להשיג תרבויות עצביות עיקריות שיכול לשמש לבדיקה תרופתית.

תקציר

Amylopathy הוא מונח המתאר את הסינתזה חריגה והצטברות של בטא עמילואיד (Aβ) ברקמות עם זמן. Aβ הוא סימן היכר של מחלת אלצהיימר (AD), והוא נמצא בדמנציה לוי גוף, שררת גוף הכללה וangiopathy עמילואיד המוחי ^1-4. Amylopathies לפתח בהדרגה עם זמן. מסיבה זו אורגניזמים פשוטים עם תוחלת חיים קצרות עשויים לעזור להבהיר היבטים מולקולריים של תנאים אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי ללמוד ניוון מוחיים Aβ בתיווך באמצעות elegans Caenorhabditis התולעת. לפיכך, אנו בונים תולעים מהונדסים על ידי הזרקת Aβ אנושי קידוד ה-DNA ₄₂ לבלוטות מין סינסיציאלי של הרמפרודיטים בוגרים. קווי Transformant הם התייצבו על ידי שילוב מושרה mutagenesis. נמטודות הם גיל מסונכרן על ידי איסוף וזריעת הביצים שלהם. התפקוד של נוירונים המבטאים Aβ ₄₂ נבדק במבחני התנהגות מתאימים (assay chemotaxisים). תרבויות עצביות העיקריות שמקורם בעוברים משמשות כדי להשלים נתונים התנהגותיים וכדי לבדוק את ההשפעות של neuroprotective תרכובות אנטי אפופטוטיים.

מבוא

בטא עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד של 36-43 חומצות אמינו שתקום לאחר מחשוף רציף של החלבון המקדים עמילואיד (APP) ועל ידי β secretases ¹ γ. Secretase γ מעבד סוף C-המסוף של הפפטיד Aβ והוא אחראי עליה אורכים משתנים ^5. הצורות הנפוצות ביותר של Aβ הן ₄₀ Aβ וAβ _42, האחרון להיות קשור יותר בכינוי לתנאים פתולוגיים כגון ⁵ לספירה. בריכוזי Aβ טופס β גיליונות גבוהים שמצרף ליצירת סיבי עמילואיד ^6. פיקדונות סיבים הם המרכיב העיקרי של פלאק סנילי סביב הנוירונים. שני לוחות ו oligomers Aβ diffusible, לא פלאק, הם חשבו מהווים צורות פתוגניים הבסיסיות של Aβ.

מעבדת מחקר של amylopathies העצבי הוא מסובך בשל העובדה כי תנאים אלה התקדמות עם זמן. לכן, זה importanלא לפתח חיה צייתנית גנטי דגמים-משלים לעכברים עם תוחלת חיים קצרה. מודלים אלה יכולים לשמש כדי להבהיר היבטים ספציפיים של amylopathies-בדרך כלל סלולרי ו, מולקולרי ומכוח הפשטות שלהם לעזור כדי ללכוד את המהות של הבעיה. תולעת Caenorhabditis elegans הנפילות היא קטגוריה זו. יש לו תוחלת חיים קצרה, ~ 20 ימים ובנוסף תהליכים תאיים בסיסיים, כולל רגולציה של ביטוי גנים, סחר בחלבון, קישוריות עצבית, synaptogenesis, איתות תא, ומותו הם דומים ^ל7 יונקים. תכונות ייחודיות של התולעת כוללות גנטיקה וחוסר מערכת כלי, המאפשר ללמוד באופן עצמאי נזק עצבי של נזק בכלי הדם רבי עוצמה. מצד השני, חוסר מוח מגביל את השימוש בג elegans ללימוד היבטים רבים של ניוון מוחיים. בנוסף, לא ניתן לבצע העתקה וזיהוי של הפצות אנטומיים של נגעים באורגניזם זה. מגבלה אחרתations כולל קושי להעריך את שני ההבדלים בביטוי גן פרופילים וירידת הערך של התנהגות מורכבת ותפקוד זיכרון. כאן אנו מתארים שיטות להפקת ג מודלים של amylopathies elegans.

פרוטוקול

1. בנייה של תולעים מהונדסים

1. טרנספורמציה.
   1. הכן את רפידות הזרקה. מניחים ירידה של חמה, 2% מומסת במי agarose, על coverslip זכוכית. במהירות למקום coverslip שני על הירידה בקלילות וקש עליו. לאחר agarose הוא הגדילו, שקופיות coverslips זה מזה, ואופה coverslip-הכרית בתנור ואקום ב 80 ° CO / נ
   2. למשוך pipettes. אנו משתמשים בחולץ סאטר P-97 כדי למשוך 1/0.5 מ"מ OD / מזהה ורוסיליקט נימים עם נימה. Pipettes מזויפים עם קצה סגור אשר נפרץ בשלב מאוחר יותר.
   3. הכן תערובת הזרקה. הפוך את תערובת ההזרקה המכילה את ה-DNA של עניין (20 ng / μl למבנה) בתוספת פלסמיד דנ"א הריק לריכוז סופי של 150 ng / μl. צנטריפוגה את תערובת ההזרקה כדי להסיר כל זיהום. שלב זה הוא קריטי משום שחומרים מזהמים להפחית את יעילות שינוי. העבר את 5 μl העליון (מזהמים ופסולת אחרים מצטברים בתחתית) לצינור טרי ל-Bדואר בשימוש בהזרקה.
   4. טען תמהיל הזרקה ידי קפילריות. התחתון של פיפטה הוא שקוע בתמהיל ההזרקה. בדרך כלל 0.5 μl מספיקים כדי להזריק 100 תולעים.
   5. טען פיפטה הזרקה. הכנס את פיפטה על בעל micromanipulator ולשבור אותו פתוח על ידי שפשוף הקצה שלה כנגד קצה להחליק את מכסה רכוב על שקופיות זכוכית או לחלופין נגד פסולת על כרית agarose. זהו צעד חיוני כמו טיפים נזק גדול מדי תולעת וסתומים טיפים קטנים בקלות רבה מדי. האיכות של הקצה השבור יכולה להישפט על ידי הצורה והכי חשוב על ידי קצב הזרימה. קצב הזרימה ניתן להעריך על ידי גודל הבועות זורמות מהקצה הפתוח השקוע בטיפת שמן 700 halocarbon של בתגובה ללחץ הזרקה.
   6. העבר את התולעים למשטח זריקה. מקום טיפת שמן halocarbon 700 על משטח זריקה ולהעביר כמה (1 או 2 למתחילים) תולעים לנפט. השתמש בתולעת להרים לדחוף את התולעים למטה על הכרית עדy לדבוק agarose. תולעים צריכים להיות מונחה בשורות עם צדדים הגחון פונים לאותו כיוון. הימנע מלגעת בראשו של התולעת. אם לאחר מספר ניסיונות התולעים לא מצליח לדבוק בכרית, להחליף עם כרית טרי או להגדיל agarose עובי ו / או ריכוז.
   7. הכנס את פיפטה לתוך התולעת. על ידי הזזת הבמה, למקם את התולעת בפיפטה. מקם את פיפטה בליבה של בלוטת המין המרכזית היא כי הציטופלסמה שלה שותפים רבים גרעיני תאי נבט. זה מגדיל את הסיכוי להעביר דנ"א מוזרק לצאצאים רבים. פיפטה צריכה לשקר כמעט במקביל לתולעת (~ 15 ° -25 ° זווית). לדחוף אנכי קצה פיפטה במורד הגוף של התולעת עד שהעור הוא בדיכאון. לאחר מכן הקש בעדינות על מניפולטור כדי לגרום לכניסתו של טיפ. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להזריק שתי בלוטות המין.
   8. להזריק את פתרון ה-DNA. תפעיל לחץ על פיפטה עד שמתנפח בלוטת המין. לעצור את הזרימה ולמשוך את תולעת פיפטה. בדוק את המחט לזרימה ולאחר מכן להעבירלתולעת הבאה וצעדי הזרקה חוזרת.
   9. לשחזר את התולעים: הוסף טיפה (~ 10 μl) של חיץ התאוששות בתולעים ודגירה עד התולעים להתחיל לשחות. הוסף נפח שווה של M9, לחכות עד שתולעים לחדש את החייה ולחזור כמה פעמים עד שהפתרון הוא בעיקר M9. בנפרד להעביר תולעים לצלחות זרע.
2. אינטגרציה.
   1. הנח 40 בריאים, מדושנת, L4 תולעים לתוך צלחת טרי
   2. להקרין עם γ-ray עם 4,000 ראד עבור 40 דקות. העבר את התולעים מוקרנים (P0) בזרע טרי, צלחות OP50 (4 תולעים / צלחת). לחלופין ניתן מוקרנים תולעים עם מינון של 300 יובס J / ² מ '.
   3. העבר 10-20 transformants F1 מכל צלחת לצלחות אישיות, לתייג את הצלחות עם P0 המקור המקביל.
   4. אחד מתוך 2-4 transformants F2 לכל F1 כדי צלחות נפרדות. בדקו את צאצאי F3 להעברת 100% משינוי הסמן. בדרך כלל, 1-3% של צאצאים מwil תולעת מוקרןיש לי אירוע אינטגרציה.
   5. הפוך מניות של שלושה או יותר קווי transformant עצמאיים.

2. מבחני התנהגות

1. גיל סנכרון.
   1. לגדול תולעים ב+ 10 ס"מ צלחות NGM הסטנדרטי OP50 E. coli עד אוכלוסייה גדולה של מבוגרים הרה להולדת הוא הגיע (3-5 ימים).
   2. לאסוף את התולעים ב50 צינורות מ"ל פלקון על ידי השעיית אותם במאגר 1 מיליליטר M9.
   3. הוסף חיץ M9 5 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 450 במשך 3 דקות. בטל supernatant. חזור על 3-4x.
   4. בסופו של צנטריפוגה שעברה, להסיר את supernatant ולהוסיף 10 כרכים של פתרון hypochlorite הבסיסי (0.5 M NaOH, hypochlorite 1% טריים המעורב) לתולעי pelleted. לדגור על RT במשך ~ 10 דקות. תגובת תמוגה יכולה להיות פיקוח על ידי הצבת ירידה של תגובת תמוגה על coverslip ולבחון את התולעים מתחת למיקרוסקופ. כאשר כ -80% מתולעים שבורים יש להפסיק את התגובה.
   5. לעצור את תגובת תמוגה ידי AddinG אותו הנפח של ביצת חיץ סטרילי.
   6. לאסוף את הביצים (ופגרים) על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 5 דקות.
   7. לשטוף את הביצים עם חיץ סטרילי ביצה 2-3x.
   8. דגירה הביצים O / N במאגר וזרעם על צלחות NGM סטנדרטיות M9.
2. assay chemotaxis.
   1. להכין כמה חתיכות של אגר כ 0.5x0.5x0.5 ס"מ. אנחנו נפקיד את אגר בצלחת של 10 ס"מ וחתכנו את נתחים אגר משם.
   2. משרים את הנתח אגר בתמיסה המכילה attractant הרצוי (בלהרוות, ריכוזים קרובים להרוות) במשך שעה 2. משיכה אופיינית הן ליזין (0.5 מ '), ביוטין (0.2 מ').
   3. להפקיד נתח אגר בצלחת מבחן 10 ס"מ שבו המיקום של נקודת מבחן ונקודת שליטה סומנו (איור 1 א). לאפשר איזון והיווצרות O שיפוע / N (איור 1). הכן 5 צלחות עבור ניסוי בודד.
   4. לפני הניסוי להוסיף 10 μl של 20 מ"מ NaN ₃ (anesthetic) לכל מקום.
   5. הנח 20 תולעי גיל מסונכרנים במרכז הצלחת. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 20 ° C.
   6. לאחר שעה 1, לספור את בעלי החיים על כתמי בדיקה / בקרה ולחשב את מדד chemotaxis, (CI) כדלקמן: כאשר N, N ו-N _{בדיקת CNT.,} מציינים את המספר הכולל של בעלי חיים, מספר בעלי החיים במקום המבחן ומספר בעלי החיים במקום השליטה.

3. תרבית תאים העוברית ראשונית

1. Lyse תולעים, כמתואר בגיל סנכרון.
2. לעצור את תגובת תמוגה על ידי הוספת הנפח הזהה של חיץ ביצה וסטרילית צנטריפוגות ב XG 450 במשך 5 דקות. בעדינות להשליך supernatant נזהר שלא לאבד את ביצי pelleted. חזור על 2-3x או עד supernatant הוא ברור.
3. Resuspend ביצי pelleted (ופגרים) במאגר ביצת סטרילי 2 מ"ל ולהוסיף 2 מ"ל של סוכרוז 60% סטרילי במאגר הביצה. מערבבים את הפתרון הזה עד ביצים resuspended לחלוטין (כפי שהם נוטים ליצור גושים בצנטריפוגה) ביד או באמצעות vortexing.
4. צנטריפוגה ב XG 450 במשך 15 דקות.
5. העברת supernatant (המכיל את הביצים) בזהירות לצינור סטרילי. בטל גלולה המכיל פגרים ואחרים תוצרי לוואי של תמוגה.
6. הסר סוכרוז שיורית על ידי resuspending את הביצים בחיץ הביצה וcentrifuging ב 450 XG במשך 5 דקות. בעדינות לאסוף וזורקים supernatant. חזור על 3x.
7. מתחת למכסת מנוע מינרית resuspend ביצי pelleted במאגר ביצת סטרילית המכיל U 1 / מיליליטר chitinase ב RT לעכל את קליפות ביצים. לאחר 30 דקות להתחיל לעקוב אחר התגובה (תחת מיקרוסקופ תרבות תא הפוך). כל אצווה של chitinase יש פעילות שונה במקצת. בדרך כלל עיכול יושלם בשעת 1.
8. כאשר בערך 70-80% קליפות ביצים מתעכלות על ידי chitinase תוספת CM-15 (L-15 תא התרבות Medium המכיל 10% בסרום שור עוברי, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). לנתק את התאים באמצעות מזרק עם מד 27. סנן את ההשעיה התא עם 5.0 מיקרומטר לסנן להסיר עוברים שלמים, גושים של תאים וזחלים.
9. גלולה ההשעיה התא ניתק על ידי צנטריפוגה XG ב 450 במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בתרבית תאים בינונית-15 ס"מ.
10. תאים ניתק צלחת על כיסוי זכוכית מצופה בעבר עם תלושים לקטינים בוטנים (0.1 מ"ג / מ"ל) מומסים במים. הערה: תאים חייבים לדבוק במצע על מנת לבדל.
11. יכולים להישמר תאים ב RT (16-20 ° C) באוויר במשך יותר מ 2 שבועות.

תוצאות

עם הפרוטוקולים שלנו אנחנו לומדים את ההשפעות של ₄₂ oligomer Aβ האנושי על תפקוד עצבי ^8. Aβ בר הקידוד אנושי ₄₂ ואת רצף הפפטיד האות המלאכותי הקידוד של אש וקטור pPD50.52 היה מוגבר ממבנה PCL12 ⁹ באמצעות פריימרים שהציגו אתר endonuclease הגבלת 1 Sma בקצוות. הבר היה אז מוכנס לתוך מבנה המכיל רצף אמרגן 2,481 FLP-BP-6 בוקטור אש pPD95.75 בין Sma האתר הייחודי 1 ^10. תוך שימוש בטכניקות השינוי המתוארת בפרוטוקול 1 אנו נבנו תולעת מהונדס...

דיון

כאן אנו מתארים גישה משולבת, ללמוד היבטים תאיים ומולקולריים של amylopathies באמצעות ג elegans. היתרונות של גישה זו כוללים: 1.) בעלות הנמוכה C.elegans נשמר בצלחת פטרי עם חיידקים נורמלי זורעים, בטמפרטורת חדר. 2) גנטיקה עוצמה. ניתן להשיג בבעלי חיים מהונדסים בכמה חודשים, ומגוון רחב של רצפי האמרגן זמין לנהוג ביטוי של הגן הרצוי בתאי עצב מסוימים. 3) פשוט, מאופיין היטב, מערכת עצבים. ג elegans בעל מערכת עצבים פשוטה להפליא (302 נוירונים). פשטות זו העניקה אפיון נרחב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>1. NGM
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S5886	3 גרם
אגר בקטריולוגי	AMRESCO	J637	17 גרם
בקטו-פפטון	AMRESCO	J636	2.5 גרם
מים			הביאו ל-975 מ"ל
מעוקר על ידי חיטוי, ואז הוסיפו את הפריטים הבאים וערבבו היטב
מגנזיום גופרתי	Sigma-Aldrich	M2643	1 מ"ל של 1 M מלאי
סידן כלוריד	Sigma-Aldrich	C5670	1 מ"ל של 1 M מלאי
כולסטרול	Sigma-Aldrich	C3045	1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל מלאי (באתנול)
מאגר			25 מ"ל של 1M מלאי
<חזק>2. חוצץ אשלגן פוספט
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 גרם
אשלגן פוספט דו-בסיסי	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 גרם
מים			הביאו ל-1 L
מעוקר על ידי חיטוי
<חזק>3. M9 buffer
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	P5655	3 גרם
נתרן פוספט דו-בסיסי	Sigma-Aldrich	S5136	6 גרם
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich	S5886	5 גרם
מגנזיום גופרתי	Sigma-Aldrich	M2643	1 מ"ל של 1 M מלאי
		מזוקקים	להביא ל -1 ליטר
מעוקר על ידי חיטוי
<חזק>4. מאגר ביצים (pH 7.3, 340 mOsm)
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S5886	118 מ"מ
אשלגן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	P5405	48 מ"מ
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	C5670	2 מ"מ
מגנזיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	M4880	2 מ"מ
HEPES	פישר מדעי	BP310	25 מ"מ
		מזוקקים	הביאו ל-1 L
מעוקר על ידי autoclaving
5. CM-15
L-15 תרבית בינונית	Gibco	11415	450 מ"ל
סרום בקר עוברי	Gibco	10437-028	50 מ"ל
פניצילין	Gibco	15140	50 יחידות/מ"ל
Streptomycin	Gibco	15140	50 גרם/מ"ל
התאם ל-340 mOsm עם סוכרוז ואז מסנן סטרילי לבקבוקים שעברו חיטוי ושומר ב-4 מעלות; C
<חזק>6. ריאגנטים אחרים
Halocarbon 700 שמן	Halocarbon מוצרים	9002-83-9
5 μ m Acrodisc מסנן מזרק	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
לקטין (בוטנים)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
נתרן הידרוקסיד	Fisher Scientific	S320
ליזין	סיגמא-אולדריץ'	L5501
ביוטין	סיגמא-אולדריץ'	B4639
תמיסת	נתרן היפוכלוריטסיגמא-אולדריץ'	425044
נתרן אזיד	סיגמא-אולדריץ'	71289
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S0389

מזוקקים אשלגן פוספט מזוקקים מים מים