הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

20.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50444

⸱

31 ביולי 2013

 ,  ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Engineering and Industrial Science, Swinburne University of Technology, 2Department of Otolaryngology, The University of Melbourne

במאמר זה

סיכום

גירוי עצב אינפרא אדום הוצע כחלופה לגירוי חשמלי במגוון רחב של סוגי עצב, כוללים אלה הקשורים למערכת השמיעה. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיקון מהדק ללימוד המנגנון של גירוי עצב אינפרא אדום בתרבות של נוירונים שמיעתיים ראשוניים.

תקציר

זה כבר הוכיח בשנים האחרונות כי אור לייזר פעם, אינפרא אדום יכול לשמש כדי לעורר תגובה חשמלית ברקמה עצבית, ללא תלות בכל שינוי נוסף של רקמת המטרה. גירוי עצבי אינפרא אדום כבר דיווח במגוון רחב של רקמה עצבית היקפית וחושית in vivo, בעניין מסוים שמוצג בגירוי של תאי עצב בעצב השמיעה. עם זאת, בעוד אח"י הוכח לעבוד בהגדרות אלה, המנגנון (או מנגנונים) שבאמצעותו אור אינפרא אדום גורם לעירור עצבי כיום אינו מובן היטב. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את כל שיטת תיקון מהדק תא שנועדה להקל על החקירה של גירוי עצבי אינפרא אדום בנוירונים שמיעתיים ראשוניים בתרבית. על ידי ביסודיות המאפיין את התגובה של תאים אלה לתאורת לייזר אינפרא אדום במבחנה בתנאים מבוקרים, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג הבנה משופרת של Physica היסודיl ותהליכים ביוכימיים שבבסיס גירוי עצבי אינפרא אדום.

מבוא

תחומי bionics נוירופיזיולוגיה והרפואי להסתמך בכבדות על טכניקות המאפשרות גירוי לשליטה של ​​תגובות חשמליות ברקמה עצבית. בעוד גירוי חשמלי נשאר תקן הזהב בעירור עצבי, הוא סובל ממספר חסרונות, כגון נוכחות של חפצי גירוי בעת הקלטת תגובות עצביות, וחוסר גירוי ספציפי בשל התפשטות נוכחית לתוך רקמה הסובבת 1.

בשני העשורים האחרונים שראו את הפיתוח של טכניקות גירוי אופטי תיווך 2. כמה מטכניקות אלה דורשות שינוי של רקמות היעד, או באמצעות תוספת של מולקולה מסוימת (מולקולות כלוב למשל) 3 או צורה כלשהי של מניפולציה גנטית (למשל optogenetics) 4, אף אחת מהן הן קלים ליישום מחוץ למסגרת מחקר. עניין מיוחד ולכן הוא גירוי עצבי אינפרא אדום (INS), wherebרקמה העצבית Y היא נרגשת על ידי אור לייזר אינפרא אדום פעם. יש אח"י הפוטנציאל להתגבר רבים מהחסרונות של גירוי חשמלי על ידי הפעלת גירוי של רקמה עצבית 2 מאוד ספציפי, ללא מגע. עם זאת, בעוד אח"י הודגם בהצלחה במגוון רחב של הגדרות in vivo, המנגנון המדויק של עירור נשאר לא ברור.

כמה פרסומים האחרונים הראו התקדמות לקראת גילוי המנגנון עומד מאחורי אח"י 5-7. חימום מהיר עקב ספיגה של אור לייזר על ידי מים שנראה לשחק תפקיד מפתח. עם זאת, מעבר לכך קונסנסוס הוא עדיין לא הגיע. שפירא ואח'. 7 להציע מנגנון כללי ביותר לפיה חימום מהיר גורם להפרעות בהפצה של חלקיקים טעונים הסמוכים לקרום התא, מה שמוביל לשינוי בקיבול של קרום התא ושלילת הקוטביות שלאחר מכן. בנוסף, אלברט ואח'. 5 טוענים כי laseחימום המושרה R מפעיל מחלקה מסוימת של טמפרטורת תעלות יונים הרגישות (הקולטן החולף ערוצי vanilloid פוטנציאליים), המאפשר ליונים לעבור דרך קרום התא. בשלב זה לא ברור כיצד מנגנונים אלה לשלב, או אם אכן יש גורמים נוספים שעדיין לא זוהה.

למרות מספר קטן של פרסומים (הפניות 5,7-9) חקרו אח"י במבחנה, הרוב המכריע של עבודה שפורסם בתחום זה בוצע in vivo (למשל 1,6,10-18 הפניות). גירוי אינפרא אדום של נוירונים שמיעתיים כבר שטח של עניין מיוחד, בשל היישומים האפשריים בשתלי שבלול 10,14-18. בעוד בניסויי vivo הם חשובים כדי לוודא את היעילות של הטכניקה במסגרות שונות, הרמה המוגברת של שליטה המוענקת על ידי ניסויים במבחנה צפוי להוביל להבנה מפורטת יותר של mechליברטריאניות אחראית לאח"י. דו"ח זה מתאר את ההכנה של נוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה לחקירות מהדק תיקון, כמו אלה יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים בסיסיים גם בעת קישור לגוף הגדול של נתונים קיימים ממערכת השמיעה.

טכניקת מהדק התיקון היא כלי מצוין לחקירות של תופעות אלקטרו, לספק אמצעי הקלטת פעילות חשמלית בתאים בודדים ולומד את תרומתם של זרמי 19 הבודדים המשמשים כבסיס. כאשר טכניקה זו מיושמת לאורווה בהכנה במבחנה של נוירונים העיקרי, כגון תאי עצב הגנגליון ספירלה בתרבית, היא מציעה את ההזדמנות ללמוד לעומק את המנגנונים שבאמצעותם פעילות עצבית היא בשליטה ומניפולציה.

הפרוטוקולים המפורטים בשיטות מתאר בעבודה זו לחוקרת את ההשפעה של גירוי לייזר על התכונות החשמליות של תאי עצב הגנגליון ספירלה באמצעות מהדק תיקוןהקלטות. הגישה מבוססת על לייזר סיב מצמידים ולא לייזר ללא מרחב, מאפשרת תפעול בטוח יותר, כמו גם קל יותר לשחזור יישור ללא הצורך לשנות את תצורת מיקרוסקופ הרגילה. על בסיס הפרוטוקולים הללו, זה צריך להיות אפשרי לביצוע מגוון רחב של ניסויים במטרה בצורה ברורה יותר על מנת לקבוע את המנגנון או מנגנונים מאחורי אח"י.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות של נוירונים גנגליון ספירלה

  1. לעקר עגול קטן (בקוטר 10 מ"מ לדוגמה) coverslips זכוכית ומלקחיים מעוקלים בחיטוי. העבר את coverslips מעוקר לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית 4-טבעת 35 מ"מ פטרי או צלחת 4 היטב, תוך שימוש במלקחיים מעוקרים. החלת 150 μl של פולי-L-ornithine (500 מיקרוגרם / מ"ל) והעכבר laminin (0.01 מ"ג / מ"ל) למשטח העליון של coverslip והמקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס) לתקופה של עד 48 שעות. להבטיח כי את coverslips לא יצוף מתחתית הבאר.
  2. הכן 50 תקשורת Neurobasal סטריליים מ"ל (NBM) לכל תרבות עצבית: 47.5 מיליליטר Neurobasal, 0.5 מ"ל N 2 תוספת, תוספת 1 ​​מ"ל B27, 0.5 L-גלוטמין מ"ל, ו0.5 פניצילין, סטרפטומיצין מ"ל. הערה: אפשר להקפיא תוספי, מאוחסן ב -20 ° C והוסיף לתקשורת ביום הנדרש.
  3. לנתק את תאי עצב הגנגליון ספירלה מגורי חולדת 4-7 שלאחר הלידה יום כפי שתואר לעיל 20,21,ing שניהם (טריפסין 0.025% 0.001% וDNase אני) אנזימטי וטכניקות מכאניות. עיין Whitlon et al. -22 ויירה ואח'. 23 לנהלים מפורטים של תרבות ספירלת גנגליון נוירון, או פארקר et al. 24 להפגנה של בידוד כישור.
  4. לשאוב כל פתרון poly-L-ornithine/laminin שנותר מאת coverslips ולשטוף בקצרה עם NBM.
  5. הוסף 150-200 μl של ההשעיה תא עצב גנגליון הספירלה ניתקה את coverslips ולמקום לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 10% CO 2). הערה: ניתן להכין עד 20 coverslips מהמלטה ממוצעת של 8 גורי חולדה.
  6. ארבע שעות אחרי נוירונים ציפוי, לשאוב את הפתרון להסרת תא פסולת ולהחליף עם NBM הטרי חימם μl 150-200. הערה: תקשורת עשויה לדרוש חידוש יומי כדי למנוע התייבשות.
  7. לחזור coverslips לחממה עד נדרשים עבור קלטות אלקטרו. הערה: ספירלה ניתקהתרבויות נוירון גנגליון יכולות לשמש לניסויי אלקטרו ארבע שעות לאחר ניתוק ולעד יומיים לאחר מכן. זמן במבחנה צריך להילקח בחשבון בעת הניתוח של תוצאות. לחדש NBM כל 24-48 שעות.

2. הכנה להקלטות מהדק תיקון

  1. הכן את פתרונות
    1. פתרון תאי (micropipette): 115 מ"מ K-גלוקונאט, 7 מ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 0.05 מ"מ EGTA, 2 מ"מ Na 2 ATP, 2 מ"מ MgATP, 0.5 מ"מ Na 2 GTP (להתאים ל-pH 7.3 עם KOH; להסתגל ל295 / ק"ג mOsmol עם סוכרוז). לעבור את הפתרון באמצעות סינון סטרילי (0.2 מיקרומטר) ומחלקים ל200 aliquots μl להיות מאוחסן ב -20 ° C עד ליום ההקלטה.
    2. פתרון תאי (אמבטיה): 137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מ (להתאים ל-pH 7.4 עם NaOH; להסתגל ל300-310 mOsmol / ק"ג עם סוכרוז) . פתרון זה הוא עשה ביום ההקלטה.
  2. הכן micropipettes הקלטה עם התנגדות של 2-6 MΩ. אנו משתמשים בליזר CO 2 חולץ (P-2000; מכשירי סאטר) והתכה של זכוכית בורה (קוטר 1.0 מ"מ חיצוני; קוטר 0.58 מ"מ פנימי, אורך 75 מ"מ).
  3. הכן את לייזר. פרוטוקול זה מיועד לשימוש עם סיבי מצמידים לייזר, כגון גירוי עצב אינפרא אדום 1870 ננומטר מOptoTech P / ל ' הסיב האופטי המשמש למשלוח אור בניסויים שלנו הוא סיב מיקרומטר 200/220 ליבה / שכבת מגן קוטר סיליקה עם צמצם מספרי של 0.22 ומחברים FC-PC בשני קצותיו (AFW טכנולוגיות MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). את מיתרי התיקון נחתכו במחצית כדי לייצר שתי צמות סיבים (connectorized כלומר בקצה אחד והבקיע בשני). את ההשפעות של קוטר ליבת סיב וצמצם מספרי על שינויי טמפרטורה מושרה לייזר כבר נדונו בהרחבה על ידי תומפסון ואח'. 25
    1. קליב קצה סיב משלוח האור באמצעות טכניקות סטנדרטיותולהבטיח כי הקצה המתקבל הוא באיכות גבוהה על ידי התבוננות במיקרוסקופ אופטי (כלומר הקצה צריך להיות ניצב לציר הסיבים ויופיעו שטוח על בדיקה חזותית). חבר את סיבי האור למסירת פלט סיבי מצמידים של לייזר באמצעות הגירוי מתאים באמצעות מחבר (למשל Thorlabs ADAFC2).
    2. למדוד את כוח לייזר הפלט מהקצה ביקע של סיבי משלוח האור באמצעות מכשיר מתאים (למשל עם FieldMate קוהירנט LM-3 גלאי ראש). מומלץ לבדוק את כוח לייזר בכל פעם שמשלוח סיבי האור הוא ביקע או התאמה משמעותית הוא עשה לליזר (לדוגמא תחבורה ממעבדה אחת לשנייה).
    3. הכנס סיבי אספקת אור לצ'אק סיבים או מכשיר שווה ערך ולהדביק את צ'אק לmicropositioner המתאים. חשוב להיות מסוגל לקבוע את זווית θ שהסיב האופטי עושה עם coverslip במדויק. angl זהניתן למדידה בדואר על ידי לקיחת תצלום של ההסדר הניסיוני ושימוש בתוכנות עיבוד תמונה (למשל ImageJ) כדי להשיג את הזווית. זווית θ (או טווח זוויות אפשריות) היא מוגבלת בעיקר על ידי מגבלות מרחביות של הסדר ניסיוני - במיוחד במיקרוסקופ. ערכים אופייניים של θ בניסויים שלנו (המבוסס על מיקרוסקופ זקוף) הם סביב 36 מעלות, לעומת זאת זווית האופטימלית עשויה להיות שונה באופן משמעותי עבור setups חלופי (למשל אלה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה).
    4. ליצור קשרים בין מערכת תיקון מהדק נתונים הרכישה (למשל Digidata 1440A, התקנים מולקולריים) כפי שמוצג באיור 2 והליזר. היציאה הדיגיטלית ממערכת נתונים רכישת מהדק התיקון צריכה להיות מחוברת לליזר באמצעות מחולל אותות חיצוניים, כך שניתן להגדיר פרמטרים דופק לייזר עצמאיים של מערכת איסוף הנתונים. לחלופין פלט זה יכול להיות מחובר ישירות לנהג לייזר (המחייב את אורך הפולס ושיעור החזרה שייקבעו על ידי תוכנת רכישת נתונים). בכל מקרה, את האות המשמשת להפעלת לייזר צריכה להיות מחוברת בחזרה לקלט של מערכת רכישת נתונים על מנת להבטיח כי העיתוי והאורך של פעימות לייזר ניתן להקליט במקביל לאות אלקטרו.

3. הקלטות מהדק תיקון לחקירת של אח"י

  1. מלא את המכל המתאים של מערכת זלוף עם פתרון תאי ולהתאים את קצב הזרימה לספק טפטוף של האמבטיה בשיעור של 1-2 מ"ל / דקה. אנו משתמשים בגרוויטציה מערכת (בקבוק aspirator, שסתום קורט, וצינור PE) עם דוד בשורה כדי לאפשר חימום מהיר של הפתרון, ומשאבת peristaltic להסיר פתרון בילה על ידי יניקה.
  2. מניחים coverslip עם תאים בתרבית לתוך תא ההקלטה (אמבטיה) של מיקרוסקופ זקוף. באמצעות מטרת מים טבילת ההגדלה גבוהה (ה. גרם. 40X) ושלב בניגוד (לעומת פער התערבות למשל או ניגוד שיפוע Dodt), מבחינה ויזואלית לאתר את תאי עצב הגנגליון הספירלה בתוך התרבות. נוירון גנגליון ספירלה טיפוסי הוא שלב בהיר, עגול וכ 15 מיקרומטר בקוטר עם גרעין בולט, כפי שמוצג באיור 1 א.
  3. ברגע שתא עצב כבר נמצא, לעבור למטרה בהגדלה נמוכה (למשל 10X) ולאתר את היעד בתוך נוירון שדה הראייה.
  4. הזז את הסיב האופטי משלוח האור למקומו באמצעות ההליך הבא (או שווה ערך):
    1. השתמש micropositioner להעביר סיבי הפלט עד הקצה קרוב לנוירון היעד בשני המישורים האופקיים ואנכיים. המצב האנכי של קצה הסיב יכול להיות מאומת על ידי נע מעלה ומטה האובייקטיבי (סריקת המיקוד).
    2. לעבור בחזרה למטרת ההגדלה הגבוהה ולמקם את הקצה של הסיב האופטי בתפקידו המיועד בסמוך לtהוא נוירון (ראה איור 2 הבלעה). בעת כוונון המיקום האנכי של הסיבים, חשוב שהקצה התחתון של הסיבים מונח על (כלומר רק נגיעה) coverslip, כדי למזער את אי הוודאות במיקום של הסיבים. היישור אופטימלי במישור האופקי יהיה תלוי בזווית θ שהסיבים עושה עם coverslip והרדיוס של R הסיבים. על מנת למקם את הסיב כך שהמרכז של נוירון היעד שוכן לאורך ציר הסיבים, מרחק האופקי בין הקצה העליון של הסיבים ותא המטרה צריך להיות
      Δ target = R (cosec θ - 2 חטא θ),
      שבו ערכים שליליים היו מציינים כי את סככות סיבים האופטיות לתא. כאשר יישור הסיבים, מרחק של יעד Δ בין הקצה העליון של הסיבים והמרכז של נוירון יכול להיות מושגת על ידי כ בדיקה חזותית. עם זאת יעד Δ נועדתשמש כקו מנחה גס בלבד. מיצוב הסיבים כך שהמרחק בפועל Δ בין הקצה העליון של הסיבים והמרכז של הנוירון מדידה שונה מΔ היעד (כמו באיור 1) יכול לספק תובנות לגבי ההשפעה של שניהם עקירת רדיאלי (כלומר מהמרכז עקירת קורה) וצירי (כלומר לאורך ציר הסיבים) של הקרן ביחס לנוירון היעד. לדוגמה, הגדרת Δ ≈ 0 יהיו צפויים להגדיל את הטמפרטורה המקומית באזור של התא - כלומר מאז פרופיל הקרן לסיבי multimode טיפוסיים הוא מקורב היטב על ידי הפצה עליונה כובע 26, הירידה באנרגיה נספגת באופן מקומי (טמפרטורה) בשל עקירה ממרכז האלומה הוא מינימאלי בהשוואה לעלייה באנרגיה נספגת מהזזת פני סוף הסיב קרוב יותר לתא.
      אמנם יש להקפיד למקם את הסיבים בצורה מדויקת וrepeatably כפוssible באמצעות רמזים חזותיים, מדידה מדויקת של מיקום הסיבים יחסית ליעד נוירון (למשל Δ) הוא בעל חשיבות גדולה יותר ממיקומה במרחק קבוע מראש משם. ניתן לקבוע Δ (עם חוסר ודאות מרבי משוער של ± 3 מיקרומטר) על ידי ניתוח תמונה כמתואר בשלב 3.8.2 של הפרוטוקול. בכמה ניסויים 5,8, כבר מצמידים מקורות אור לבנים דרך הסיב על מנת למקד את התא הרצוי. גישה זו נמצאה כיעיל בהתקנת מיקרוסקופ הזקופה, כעוצמת האור מפוזר מאזור היעד הייתה נמוכה יחסית בזוויות הרדודות האלה (θ).
    3. ברגע שהסיבים הוא במיקום, להזיז אותו על ידי סכום ידוע כדי לאפשר מיצוב ברור של micropipette. הסיבים אז יכולים להיות חזרו לעמדתו המקורית בעת הקלטה עצבית מושגת.
  5. מלא micropipette עם פתרון תאי ובאופן מאובטח שיתאים למקומו על הראשיםכאחוז מהמגבר (כגון התקני 700B, מולקולריים Multiclamp). באמצעות צינור המחובר לצדו של בעל microelectrode, להחיל כמות קטנה של לחץ חיובי כדי למנוע סתימה של micropipette.
  6. באמצעות micromanipulator, הזז את micropipette למקום בדיוק מעל נוירון היעד.
  7. פרוטוקול לכל הקלטות סלולריים:
    1. החל 10 אלפיות שנייה, 10 mV כיכר גל דופק (מבחן חותם למשל) במצב מתח מהדק של המגבר ולהתאים את פוטנציאל micropipette (פיפטה קיזוז) של האות לתחילת המחקר 0 NA. גם מבחן החותם צריך לשמש כדי לקבוע אם ההתנגדות של microelectrode נמצאת בטווח הרצוי (למשל 2 - 6 MΩ).
    2. תוך מעקב ההתנגדות, השתמש התאמות קנס של micromanipulator למקם micropipette עדינות על פני השטח של תא עצב היעד. כאשר micropipette נמצא במגע עם העצב, ההתנגדות תגדיל (על ידי ~ 0.5-1 MΩ). אניmmediately בעקבות עליית ההתנגדות, הסר את לחץ הנוזל החיובי וליישם את לחץ שלילי קטן. ברגע שהתנגדות עברה 10 - 20 MΩ, לתקן את קרום הפוטנציאל לרמה מחזיקה (למשל סביב -60 mV).
    3. התנגדות האלקטרודה צריכה להמשיך לעלות עד שהוא עולה על GΩ 1, מסמן כי חותם יעיל (שמכונה 'gigaseal') כבר נוצר בין קרום התא וmicropipette. בשלב זה, להסיר את כל לחץ הנוזל מmicropipette.
    4. ברגע שgigaseal כבר נוצר, השתמש בפולסים קצרים (הנוכחיים 25 עד 100 μsec; 1 V) או קטניות קצרות של לחץ נוזל שלילי לקרע של קרום התא ולהשיג את כל תצורת תא.
    5. רשום את קיבול הקרום, התנגדות והתנגדות סדרת קלט כפי שיקבע מעקומת מעריכי מצויד הנוכחי במהלך בדיקת דופק החותם. למזער את ארעיים קיבול על ידי התאמת בקרות CpFast וCpSlow על המגבר, אז switcשעות מגבר לכל מצב תא, ולפצות את הקיבול והתנגדות עד נוכחי שטוחה הוא ציין במהלך בדיקת החותם. החלת פיצוי התנגדות סדרה (~ תיקון 70%; 70% חיזוי), התאמת בקרות קיבול והתנגדות כדי לשמור על תגובת חותם מבחן שטוחה.
    6. מעבר למצב נוכחי מהדק במגבר. שימו לב לפוטנציאל הממברנה במנוחה (בהעדר ההזרקה הנוכחית). הגדרה נוכחית מחזיק לייצב את פוטנציאל הממברנה ברמה הרצויה (למשל -60 mV). לנטרל את קיבול פיפטה ולהתאים את איזון הגשר כדי לאזן את הירידה במתח.
    7. בדקו את מאפייני הירי של נוירון על ידי גירוי עם depolarizing הנוכחי (10-200 הרשות הפלסטינית ב10 צעדי הרשות הפלסטינית; 300 אלפיות משך זמן).
    1. להזיז את גב הסיב האופטי למקומו בסמוך לתא העצב. שימוש בתוכנת הדמיה מצמידים את מצלמת CCD, ללכוד תמונות של העמדה של הסיבים ביחס לנוירו היעדn, תוך התמקדות במישור של נוירון בתחילה, ולאחר מכן, בקצה העליון של הסיבים אופטיים (ראה איור 1).
    2. על ידי ניתוח שלאחר מכן מהתמונות שהתקבל (למשל 1b דמויות ו1 ג') ניתן לקבוע באופן מדויק Δ (עמדת הקצה העליון של קרוב המשפחה הסיב האופטי למרכז נוירון היעד). ברגע שΔ ידוע, ניתן לחשב פרמטרים כגון מרחק מהפנים סוף הסיבים לנוירון היעד (לאורך ציר הסיבים) z והעקירה הרדיאלי של נוירון ממרכז r δ הקרן באמצעות יחסים טריגונומטריות פשוטים:
      Z = R חטא 2θ + cos θ Δ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ חטא θ) 2 + δy 2) 1/2,
      בי δy הוא המרחק בין ציר הסיבים ומרכז נוירון כפי שניתן לראות מלמעלה למשל SE (דואר איור 1).
      ניתוח צריך לקחת בחשבון וריאציות positional מתא לתא, כפי שהידע מדויק של מיקום פרמטרים אלה ייתכן שיהיה צורך לפתור את מחלוקות אפשריות בין תהליכי גירוי 25.

4. ניסויי INS

  1. בעת הקלטת נתונים אלקטרו באו מהדק נוכחי או תצורות מהדק מתח, הפעל את לייזר הגירוי בפרמטרים הרצויים (למשל חשמל, אורך הפולס, שיעור החזרה וכו '). עם לייזר שלנו, כוח האופטי נשלט באמצעות הזנה ישירה לנהג לייזר והיא מצוינת באופן ידני לפני כל הקלטה. אורך הפולס ושיעור החזרה יכולים להיות נשלטו על ידי מי ממחולל אותות חיצוני או תוכנת רכישת נתונים (כמתואר בשלב 2.3.4). ודא שנתונים הם משני ערוץ מהדק התיקון וערוץ הדק לייזר.

פעימות לייזר עם אורכים הנעיםמכל 500 μsec עד 15 אלפיות השני ואנרגיות של 0.25-5 ~ mJ לדופק בדרך כלל תשואת תגובות חשמליות הניתנות למדידה. הגדרת שיעור החזרה של פעימות לייזר כדי להיות הרץ 1 פחות או עשויה להיות שימושית עבור ניסויים ראשוניים, שכן הוא יהיה למזער את ההשפעות של פרמטר זה. תוצאות אופייניות המראות את השינוי באות המוקלטת מוצגות בסעיף הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נוירונים הגנגליון ספירלה להגיב לתאורת לייזר עם צורות גל הדיר בשני תצורות הקלטה נוכחי, מהדק מתח ומהדק. 3a איור מראה שינויים אופייניים בזרימה הנוכחית על פני קרום תא בתגובה ל2.5 אלפיות שנייה, 0.8 mJ דופק לייזר (תגובה ממוצעת מ6 פעימות לייזר, שחזרו במרווחים של 1 SEC) עם פוטנציאל הממברנה שנערך ב -70 mV, ו-60 mV -50 mV. זרמים פנימה נטו עוררו באופן עקבי בתגובה לפעימות לייזר, וחזרו לערכים ההתחלתיים לאחר ההארה חדלה. הצורה של הזרמים המושרה לייזר ניתן לראות להשתנות כפוטנציאל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שימוש בפרוטוקולים שתוארו במאמר זה ניתן לחלץ ונוירונים הגנגליון ספירלה תרבות ולחקור לייזר עורר פעילות חשמלית על ידי ביצוע ניסויים שלמים מהדק תיקון סלולרי. כאשר נעשה שימוש במבחנה, טכניקת מהדק התיקון מספקת רמה של שליטה על פרמטרים של ניסוי שזה לא אפשרי בגוף חי. פרמטרים גירוי לייזר כגון אורך גל, דופק אנרגיה, אורך הפולס, צורת דופק, ורצפי חזרה דופק ניתן ללמוד במסגרת שחזור. בנוסף, הסביבה שבה תאי העצב נשמרים (טמפרטורת פתרון למשל, גורמים כימיים) יכולה להיות שיטתי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי תחת הצמדת פרויקט מענק LP120100264.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים וציוד לתרבית תאים
כיסויי זכוכיתLomb ScientificCSC 10 1 GP
צלחת תרבית תאים 4 טבעות VWR International82050-542
תמיסת פולי-L-אורניתיןSigma-AldrichP4957
למיניןInvitrogen23017-015
מעוקל מלקחייםWPI14101Dumont #5 פינצטה (45& מעלות; קצה זווית)
CO2 IncubatorThermoScientific Heracell 150i
טבלה 1. חומרים וציוד לתרבית תאים.
Neurobasal media
Neurobasal AGibco10888-022
תוסף N-2Invitrogen17502-048
תוסף B27 ללא סרוםInvitrogen17504-044
פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen15140-148
L-גלוטמיןInvitrogen25030-149
<חזק>תמיסה תוך-תאית
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P4504
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034
אשלגן D-גלוקונאטסיגמא-אולדריץ'G4500
EGTAסיגמא-אולדריץ'E3889
Na2ATPSigma-AldrichA2383
MgATPSigma-AldrichA9187
NaGTPSigma-AldrichG8877
אשלגן הידרוקסידLabServBSPPL738.500
סוכרוזSigma-AldrichS8501
<חזק> תמיסה חוץ-תאית
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'310166
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P4504
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'383147
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ'M8266
D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
נתרן הידרוקסידLabServBSPSL740.500
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S8501
<חזק>טבלה 2. פתרונות לתרבית תאים ומהדק תיקון. א) מדיה נוירו-בזאלית. ב) פתרון תוך-תאי. ג) פתרון חוץ-תאי.
מיקרוסקופ זקוףZeissAxioExaminerD1מצויד בניגודיות Dodt
מטרת טבילה במיםZeissW Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
פלטפורמה ושלב XY ThorLabsBurleigh תא הקלטה גיברלטר
וורנר אינסטרומנטסRC-26G
שולחן בידוד רעידותTMCMicro-g 63-532
מכשירי אבחוןמצלמת CCDRT1200
תוכנת מצלמהמכשירי אבחוןSPOT מחמם פתרון בסיסי
בשורהוורנרSH-27B
בקר טמפרטורהוורנרTC-324B
מגבר מהדק תיקוןהתקנים מולקולרייםMulticlamp 700B
מהדק תיקון מערכת רכישת נתוניםמכשירים מולקולרייםDigidata 1440A
מיקרומניפולטורמכשירי סאטרMPC-325
מכשירי סאטר זכוכית מיקרופיפטהGBF100-58-15זכוכית בורוסיליקט עם נימה
חולץ מיקרופיפטהמכשירי סאטרP2000
תוכנת הקלטהAxoGraphו כלים אלקטרופיזיולוגיים
בקבוק שואבסיגמא-אולדריץ'CLS12201Lבקבוק שואב פיירקס 1 ליטר, עם יציאה לצינורות
צינורות PEהרווארדPolyE #340
משאבה פריסטלטית MasterflexCole-ParmerHV-07554-85
<חזק>טבלה 3.ציוד מהדק תיקון.
1,870 ננומטר דיודת לייזרOptotech
200/220 μ כבל תיקון סיבים אופטיים מולטי-מוד בקוטר m (FC/PC)AFW TechnologiesMM1-FC2-200/220-5-C-0.22סיבים אופטיים לאספקת אור, ליבת סיליקה וחיפויים, 0.22 NA
סיבים אופטיים דרך מחבר (FC/PC)ThorlabsADAFC2
קליבר סיבים אופטייםEREMFO1
כלי הפשטת סיבים אופטיים (0.25 - 0.6 מ"מ) סימנס
כלי הפשטת סיבים אופטיים (0.6 - 1.0 מ"מ)סימנסלהסרת ציפוי חיצוני של כבל תיקון
מחוללכל מחולל אותות שיכול להפיק את צורות הדופק הדרושות ומסוגל להיות מופעל חיצונית
מיקוםבהתאמה אישית. יכול להחליף במיקרופוזיציה סטנדרטית המשמשת לניסויי מהדק תיקון
צ'אק סיבים אופטייםניופורטFPH-DJ
מד כוח לייזר וראש גלאיקוהרנטיFieldMate (מד כוח) עם LM-3 (ראש גלאי)
<חזק>טבלה 4. ציוד לייזר.
חבילת מעבדת להסרת מעטפת סיבים אופטיים אותות סיבים אופטיים

מקורות

  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
  3. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
  4. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  5. Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  6. Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
  7. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736(2012).
  8. Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
  9. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
  10. Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
  11. Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
  12. Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
  13. Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
  14. Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
  15. Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).
  16. Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
  17. Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
  18. Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  20. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
  21. Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
  22. Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
  23. Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
  24. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).
  25. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).
  26. Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
  27. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
  28. Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נוירונים שמיעתייםנוירוני הגנגליון הספירליהקרנת לייזרמערך פאץ'-קלאמפ (Patch Clamp)מיקום סיב אופטיקיבול ממברנהפיצוי התנגדות טוריתמצב קלאמפ זרם (Current Clamp)
הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.