מאמר שיטה

מיקרוסקופי שדה רחב פלורסנט וזרימת cytometry הדמית פלורסנט בטלפון סלולרי

DOI:

10.3791/50451

⸱

11 באפריל 2013

 , 
1Electrical Engineering Department, University of California, Los Angeles , 2Bioengineering Department, University of California, Los Angeles , 3California NanoSystems Institute (CNSI), University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו בודקים את התוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. מכשירים הבוסס טלפון הסלולרי אלה מייקרו ניתוח עשויים להיות שימושיים לניתוח cytometric, כגון ביצוע משימות ספירת תאים שונות, כמו גם לתפוקה גבוהה הקרנה של דוגמה, דגימות מים בגדרות משאבים מוגבלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה פלורסנט וcytometry זרימה משמשות כלים נרחבים במחקר ביו ואבחון קליני. עם זאת מכשירים אלה באופן כללי יחסית מסורבלים ויקרים, מה שהופך אותם פחות יעיל בהגדרות המשאבים המוגבלות. פוטנציאלי כדי לטפל במגבלות אלה, אנו הוכחנו לאחרונה את השילוב של מיקרוסקופ שדה רחב ניאון וכלי cytometry זרימת הדמיה בתא טלפוני שימוש קל משקל קומפקטי, וקבצים מצורפים חסכוניים Opto-fluidic. בעיצוב cytometry הזרימה שלנו, תאים שכותרתו fluorescently סמוקים דרך ערוץ microfluidic שממוקם מעל יחידת המצלמה הקיימת בטלפון סלולרי. דיודות מופעלות סוללה פולט אור (LEDs) הן קת מצמידה לצד זה שבב microfluidic, אשר למעשה מתפקד כמוליך גל מצב מרובה לוח, שבו אור העירור מונחה אחיד כדי להלהיב את מטרות ניאון. המצלמה בטלפון סלולרי מתעדת סרט זמן לשגות של תאי הניאון זורמים דרךערוץ microfluidic, שם את המסגרות הדיגיטליות של הסרט הזה מעובדים כדי לספור את מספר התאים שכותרתו בתוך יעד הפתרון של עניין. שימוש בעיצוב דומה Opto-fluidic, אנחנו יכולים גם תמונת תאים אלה שכותרתו fluorescently במצב סטטי על ידי רבדה למשל את חלקיקי הניאון בין שתי שקופיות זכוכית ולכידה התמונות שלהם הניאון באמצעות המצלמה בטלפון סלולרי, שיכול להשיג רזולוציה מרחבית של דוגמה ~ 10 מיקרומטר מעל שדה של נוף גדול מאוד של ~ 81 מ"מ 2. טלפון נייד זה מבוסס cytometry זרימת הדמית ניאון ופלטפורמה מיקרוסקופית עשויה להיות שימושית במיוחד בהגדרות משאבים מוגבלות, למשל לספירה של CD4 + תאי T כלפי ניטור של HIV + חולים או לגילוי של טפילי מים שמקורן במי שתייה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה וזרימת cytometry נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות 1-12 במחקר ביו ומדעי, כמו גם אבחון קליני לספירה ואפיון של סוגי תאים שונים. עם זאת, מיקרוסקופים קונבנציונליים ומכשירי הזרימה cytometry הם יחסית מורכבים ויקרים, אשר מגביל את השימוש בם למעבדות מרכזיות מבוססות היטב בעיקר. לאחרונה פתחנו cytometry קומפקטי וקל משקל ניאון הדמיה ומיקרוסקופיה מכשיר משולב בטלפון סלולרי, 13,14 אשר מראה הבטחה לחסכוני לתרגם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זרימת cytometry וטכניקות הקשורות לניתוח מייקרו לסביבות משאבים מוגבלים עבור טלרפואה יישומים שונים המשפיעים על בריאות העולמית.

בתצורת optofluidic הזרימה cytometry (ראה איור 1C למשל ו1D), polydimethysiloxane ערוץ אישית מעוצב-(PDMS) מבוסס microfluidic הוא positioneד בחזית תא טלפון מצלמת היחידה, בי-דיודות פולט אור (LEDs) הן הקת מצמידות לשולי הערוץ. שבב microfluidic זה, יחד עם הנוזל בתוך המדגם, מהווה מוליך גל מישורי Opto-fluidic (מורכב מלמשל PDMS הנוזלי-PDMS), כך שאור העירור מונחה אחיד לשאוב את הדגימות שכותרת הניאון בתוך ערוץ מייקרו. פליטת הקרינה מן האובייקטים שכותרתו אלו, תאים למשל, הוא צלם עוד יותר באמצעות עדשה נוספת הונחה מייד אחרי הטלפון סלולארי מצלמת היחידה והוא ממופה על תחמוצת מתכת-סמיקונדקטור חיישן משלימת הטלפון סלולרי (CMOS) תמונה. מאז פליטת הניאון נאספת בניצב לנתיב אור העירור, מסנן קליטת פלסטיק זול מספיק כדי להסיר את אור העירור המפוזר ויכול לספק רקע הגון כהה תחום נדרש הדמית ניאון. שימוש בעיצוב דומה Opto-fluidic, אנחנו יכולים גם תמונת אובייקטי הניאון בstatic מצב (ראה איור 1A ו-1B), שבו חלקיקי הניאון הם דחוקים בין 2 כוס מחליק במקום זורם בתעלת microfluidic ופליטת חלקיקי ניאון ניאון מאלה שנתפסו על ידי חיישן CMOS הטלפון סלולארי תמונה לספירת חלקיקים ו אפיון. בהתבסס על דרישות שונות של יישומים, cytometry זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב ניתן לבחור. לדוגמה, מכשיר cytometry זרימת טלפון נייד יכול להיות שימושי במיוחד לסינון כמויות גדולות של דגימות נוזליות (למשל כמה מ"ל) לזיהוי של תאים או פתוגנים נדירים.

בכתב יד זה אנו סוקרים כמה מהתוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. ניתוח מייקרו אלה טלפון סלולרי מבוסס, cytometry ההדמיה ופלטפורמות חישה יכולים לספק הזדמנויות שונותלטלרפואה ונקודה של טיפול אבחון, במיוחד משפיע מאבקנו נגד אתגרי בריאות העולמיות באזורים מוגבלים משאבים של העולם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסעיף זה, אנחנו מציגים את פרוטוקולי הניסוי למיקרוסקופיה טלפון נייד המבוססת השדה רחב פלואורסצנטי 13 ופלטפורמת cytometry Opto-fluidic הדמית 14. אנו נשתמש בחרוזי ניאון ותאי דם לבן שכותרתו fluorescently לבחון פלטפורמות הדמיה אלה.

הכנת א טלפון סלולרי מבוססת פלורסנט מיקרוסקופ שדה רחב וCytometer תזרים ההדמיה Opto-fluidic

מיקרוסקופ הטלפון סלולרי המבוסס השדה רחב פלורסנט או cytometer זרימה מורכבת משני חלקים עיקריים: טלפון מצלמה וOpto-fluidic הקומפקטי תוספת על קובץ מצורף.

1. טלפון המצלמה

בעוד שהטכניקות שהוצגו חלות על כמעט כל טלפון מצלמה, בחר סוני אריקסון Aino כבסיס למכשירים אלו. תא הטלפון הזה יש ~ חיישן 8 מגה פיקסל RGB CMOS ולהתקין עליו ומובנה בעדשה שיש אורך מוקד (ו 1) של ~ 4.65 מ"מ.

2. קובץ מצורף Opto-fluidic למיקרוסקופיה פלורסנט שדה רחב

הקובץ המצורף האופטי הוא תוכנן על ידי Autodesk ומודפס במדפסת עלית 3-D ממד באמצעות חומר תרמופלסטי ABSplus. בתהליך הדפסה זה, חומרי מודל ותמיכה מחוממים בראש חול בתוך המדפסת ומופקדים שכבה אחרת שכבה על בסיס דוגמנות. כאשר שלב זה הושלם, חומר העזר ניתן להמס, עוזב מודל 3D חזק של אב הטיפוס הרצוי העיצוב המצורף האופטי שלנו מורכב מנוריות (אורך גל במרכז ~ 470 ננומטר, Digikey), מסנן פלסטיק (# NT54-46, אדמונד אופטיקה), מגש מדגם, ועדשת f 2 Plano-קמורה מ"מ = 15 (# NT45-302, אדמונד אופטיקה). כל הנוריות ומסנני פלסטיק ניתן לשנות בקלות על בסיס הספקטרום של fluorophores. הצעדים להרכבה מצורפת Opto-fluidic זה כוללים:

  1. מניח את העדשה בקובץ המצורף בעמדת בעל העדשה הספציפית שלה.
  2. הנח את מסנן הפלסטיק על מגש המסנן וחלק אותו לקובץ המצורף, או קלטת מסנן הפלסטיק מול עדשת המצלמה בטלפון נייד.
  3. הכנס את מגש LED לקובץ המצורף.
  4. הנח את שקופיות זכוכית המדגם למגש המדגם. חלק את מגש המדגם לקובץ המצורף. להתמודד עם הנוריות כלפי המדגם.
  5. קליפ המצורף על הטלפון הסלולרי, כך שעדשה הנוספת היא ישירות במגע עם עדשת המצלמה בטלפון נייד.
  6. השתמש במתג על קובץ המצורף כדי להפעיל את הנוריות.
  7. תמונת מדגם עניינים עם יחידת המצלמה בטלפון סלולרי באמצעות "מצב הלילה" שלה.

3. קובץ מצורף Opto-fluidic לCytometry ההדמיה פלורסנט

כאשר יש צורך להקרין כמויות גדולות של דגימות נוזליות לצורך זיהוי של אירועים נדירים, מכשיר cytometry זרימת optofluidic יכול להיות עדיף. אנחנו יכולים לשנות את עיצוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי השדה הרחב שלנו ולהפוך אותו לcytometer זרימה, Wכאן ערוץ microfluidic מבוסס PDMS משמש כדי לספק דגימת נוזל הרף דרך נפח ההדמיה. קובץ המצורף האופטי גם הוא תוכנן על ידי Autodesk ומודפס על ידי מדפסת ממד 3 D-עלית. הוא גם מורכב מנוריות (אורך גל במרכז ~ 470 ננומטר, Digikey), מסנן פלסטיק (# NT54-46, אדמונד אופטיקה), מגש מדגם, וaspherical עדשה (F = 4.5 מ"מ) (מוצר # C230TME-; Thorlab). הצעדים להרכבה מצורפת Opto-fluidic זה כוללים:

  1. הנח Aspherical העדשה לקובץ המצורף.
  2. הנח את מסנן הפלסטיק על מגש המסנן וחלק אותו לקובץ המצורף, או קלטת מסנן הפלסטיק בחזית עדשת המצלמה של הטלפון הסלולרית.
  3. חלק את ערוץ microfluidic לאותו הקובץ מצורף Opto-fluidic.
  4. קליפ המצורף על הטלפון הסלולרי, כך שהעדשה הנוספת היא ישירות במגע עם עדשת המצלמה בטלפון נייד.
  5. השתמש במתג על קובץ המצורף כדי להפעיל את הנוריות.
  6. חבר microfluidic ערוץ למשאבת המזרק ולספק דגימת הנוזל לתוך מכשיר microfluidic בקצב זרימה קבועה.
  7. צלם סרט של תאים / חלקיקים זורמים דרך ערוץ microfluidic שימוש במצב הווידאו של המצלמה בטלפון סלולארי הניאון.

לדוגמא הכנת B.

4. הכנת דוגמאות פלורסנט מייקר חלקיקים

  1. חרוזי ניאון עם קוטר 10 מיקרומטר (חרוזים אדומים: מוצר # F8834 עירור / פליטת 580nm/605nm; חרוזים ירוקים: מוצר # F8836: עירור / פליטת 505nm/515nm) נרכשים מInvitrogen (קרלסבד, קליפורניה).
  2. מערבב 10 μl של חרוזי ניאון ירוקים, 10 μl של חרוזי ניאון אדומים עם 40 μl מי DI.
  3. Place10 μl של תערובת חרוז זה בשקופית זכוכית באמצעות micropipette ולשים שקופית כוס נוספת בחלק העליון שלו כדי להפוך את מבנה כריך.
  4. הכנס מבנה הכריך הזה למגש המדגם וחלק אותו לקובץ המצורף בטלפון נייד.

5. הכנה של תאי דם לבן שכותרתו fluorescently

  1. קח חומצה SYTO16 תיוג ערכת גרעין ניאון (# S7578, טכנולוגית חיים) ונאגר מלוחים פוספט (PBS) יצא מהמקרר ולהביא אותם לטמפרטורת חדר.
  2. העברת דגימת דם כל μl 200 מצינור איסוף דם EDTA לצינור פוליסטירן מ"ל 1.5 (# 05-408-129, הפישר סיינטיפיק).
  3. הוסף 1 מיליליטר חיץ תאי דם אדום lysing (# R7757, סיגמה אולדריץ) למדגם 200 μl כל הדם והמערבב היטב.
  4. לאחר 5 דקות, סרכזת דגימת דם lysed ולהסיר את פתרון supernatant.
  5. Resuspend תאי הדם הלבנה הגלולה לחיץ PBS 200 μl ועדינות לערבב אותם.
  6. הוסף SYTO16 פתרון 5 μl 1 מ"מ לדגימת תאי הדם הלבנה. עטוף את המדגם ברדיד אלומיניום ולדגור בסביבה חשוכה ל~ 30 דקות.
  7. צנטריפוגה המדגם שוב. Supernatant מוסר ומתויג תא הכדורי דם הלבן מחדשמושעה לחיץ PBS.
  8. הנח μl 5-10 כותרת דגימת נוזל תא דם לבנה כדי להחליק כיסוי, והנח את תלוש עטיפה שנייה בחלק העליון של המדגם.
  9. הכנס את שקופית המדגם דחוק למגש המדגם ותדמיתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הטלפון סלולרי.

לחלופין

  1. רף לספק את תאי דם הלבן שכותרתו fluorescently דרך ערוץ microfluidic באמצעות משאבת מזרק אוטומטית, גם בעת הקלטת סרט מיקרוסקופי ניאון של תאים זורמים באמצעות המצלמה בטלפון סלולרי במצב וידאו. אנחנו צריכים גם להדגיש כי משאבה ניידת מופעלת סוללת מזרק או אפילו כוח המשיכה יכולה להיות מנוצלת כדי להסיע את הזרימה דרך ערוץ microfluidic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם שאיבת Opto-fluidic / ערכה (1C 1D ותרשימים) עירור שלנו, תאים שכותרתו fluorescently יכולים להיות מועברים באופן רציף לערוץ microfluidic באמצעות משאבת מזרק בזמן שהמצלמה בטלפון סלולרי מתעדת סרט זמן לשגות ניאון מיקרוסקופי של התאים זורמים. סרטי ניאון אלה לאחר מכן ניתן לנתח במהירות באמצעות קווי מתאר איתור ומעקב 14,15 אלגוריתמים כדי לקבוע את המספר המוחלט והצפיפות של התאים זורמים דרך ערוצי microfluidic באופן אוטומטי, לוקח את הפונקציה של זרימת cytometer הדמית נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו הצגנו התוצאות האחרונות שלנו בטלפון סלולרי המבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב וזרימת cytometry הדמית Opto-fluidic שימוש קל משקל וקומפקטיים לצרף קבצי Opto-fluidic למצלמות טלפונים סלולריים. שימוש בפלטפורמה טכנולוגית זו אנו צלמנו אובייקטי ניאון לרבות חלקיקי מייקרו ותאי דם לבן שכותרתו בדגימות דם שלמות. לכן, כלים זה קומפקטי וחסכוניים טלפון סלולרי מבוססי פלורסנט הדמיה עשויים להיות שימושיים לאבחון נקודה של טיפול, במיוחד באזורים של משאבים מוגבלים למאבק בבעיות שונות בעולם בריאות, כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד"ר Ozcan הוא המייסד של חברת סטארט אפ שמטרה למסחר את ההדמיה ממוחשבת וכלים מיקרוסקופים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

א Ozcan תודה מכיר את התמיכה בפרס לנשיאות קריירה המוקדם עבור מדענים ומהנדסים (PECASE), של משרד לחקר צבא (נרו) בפרס חוקר צעיר, הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס קריירה, משרד מחקר של צי (ONR) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בפרס במאי החדש ממציא DP2OD006427 ממשרדו של המנהל, המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טלפון סלולריSonySony Ericsson Aino
עדשה פלנו-קמורהEdmund Optics# NT45-302
עדשה אספריתThorlab# C230TME-A
מסנןEdmund Optics#NT54-46
Blue LEDDigikey#365-1201-ND
סוללהDigikey#P032-ND
צינור פוליסטירןפישר סיינטיפיק# 05-408-129
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםסיגמא אולדריץ'R7757
SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning
חרוזי פלורסנט אדומים (10 μ m)Life Technologies#F8834
חרוזי פלואורסצנט ירוקים (10 μ m)Life Technologies#F8836
SYTO16 תיוג פלואורסצנטי של חומצת גרעיןLife Technologies# S7578

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
  2. Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
  3. Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
  6. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
  7. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801(2006).
  11. Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
  12. Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
  13. Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
  14. Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
  15. Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
  16. Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
  17. Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
  18. Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LEDPoint of Care

מאמרים קשורים