העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים במבחנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חיוניים כדי לספק סובלנות חיסונית עצמי, כמו גם לאנטיגנים זרים מסוימים. יכול להיות שנוצר Tregs מתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה עם TCR-ושיתוף גירוי בנוכחות TGFβ ו-IL-2. זה נושא פוטנציאל עצום לטיפולים עתידיים, לעומת זאת, המולקולות ומסלולי איתות שבידול שליטה הם במידה רבה לא ידועים.
ניתן להשפיע תאי T עיקריים דרך ביטוי גנים מחוץ לרחם, אך שיטות נפוצות אינן מצליח למקד את המדינה הנאיבית החשובה ביותר של תא T לקראת הכרת אנטיגן העיקרית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבטא גנים מחוץ לרחם בתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה לפני גרימת בידול Treg. היא חלה התמרה עם אדנווירוס כפול המחסר ומסבירה הדור והייצור שלה. אדנווירוס יכול לקחת עד מחדיר גדול (עד 7 קילו) והוא יכול להיות מצויד עם יזמים כדי להשיג overexp הגבוהה והחולףression בתאי T. זה למעשה transduces תאי T עכבר נאיביים אם הם מבטאים רצפטור אדנווירוס Coxsackie מהונדס (מכונית). חשוב מכך, לאחר הדבקת תאי T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) ויכול להיות מופעל ומובחן לTregs דומה לתאים שאינם נגועים. לכן, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של CD4 התמיינות תאי T מראשיתו. זה מבטיח כי ביטוי גנים מחוץ לרחם כבר נמצא במקום כאשר אירועי איתות ראשונים של גירוי TCR הראשוני גורם לשינויים תאיים שסופו של דבר יובילו לבידול Treg.
מבוא
Tregs הם חיוניים כדי לשמור על סבילות חיסונית ולצנן את התגובות חיסוניות להחטיא. Tregs לדכא הפעלת תא T עובר אורח. כתוצאה מכך, אבלציה של Tregs מובילה לאוטואימוניות הקטלנית והרס עצמי מונעת על ידי תאי T מופעל 1. Tregs להתפתח בבלוטת התימוס במהלך סלקציה שלילית של CD4 מבשרים אחת חיובי, אבל הם גם יכולים להבחין בפריפריה מתאי T מסוג CD4 תמימים על גירוי אנטיגן במינון נמוך עם 1,2 שיתוף הגירוי הכי מוצלח. נראה הרתי Tregs לדכא אוטואימוניות רקמה נגד-אנטיגנים עצמיים, ואילו ההיקפי Tregs היו מעורב במתן סובלנות במעי או הריאה. המושרה Tregs אלה potently למנוע הפעלת תא T לאחר הכרה של אנטיגנים זרים ברירית, כולל אנטיגנים סביבתיים מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שיבוט של גן של עניין לוקטור כניסה
- לשבט את הגן של עניין לוקטור כניסה. ההגברה PCR של הגן ואחרי קשירה בוטה סוף לתוך וקטור topoisomerase מצמידים (למשל pENTR / D-TOPO) או הגבלת אנזים בתיווך שיבוט עשוי לשמש להליך זה.
2. העברת הגן של עניין לוקטור יעד pCAGAdDu
- להעביר את הגן של עניין מוקטור כניסתו לוקטור היעד על ידי רקומבינציה LR (מיקס למשל Gateway LR Clonase השני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ייצור וירוס
עבור דור של titers וירוס גבוה, העיתוי של מסיק תא HEK293A בייצור וירוס ראשוני או הגברה וירוס הוא קריטי. תמונות עם ניגודיות ניאון ושלב נציג עם סימנים חזותיים של ייצור נגיף מוצגות באיור 3. CPE נצפו 10 ימים לאחר transfection של תאי HEK293A עם וקטור שליטת pCAGAdDu ללא הוספה. CPE מאופיין על ידי ההופעה של אזורים עם תאים מוגדלים ועיגול לטובה שמתחילים לנתק ולהציג ביטוי גבוה של ה-GFP סמן הזיהום. ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דור וירוס וטיטרציה
לקבלת תוצאות אופטימליות transfection, האיכות והכמות של וקטור לינארית מופיעות חשוב ביותר. אנו לא צופים השפעה שלילית על ייצור lysate עיקרי מצמיחת יתר ראשונית של התרבות מאז הזיהום ימשיך במהירות ברגע ייצור וירוס יעיל מתרחש. עם זאת, ייצור נגיף על ידי תאי HEK293A יכול להיות מושפע ממוסיף ארוך שמפחיתים את היעילות. כמה מסגרות קריאה פתוחות למעשה נמצאו להפריע לייצור וירוס. בדרך כלל ניתן הצילו מניות נגיפיות א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לLirui דו לבניית וקטור pCAGAdDU ואוליבר גורקה למתן פרוטוקול הקיבעון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת שיבוט pENTR / D-TOPO | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II תערובת אנזים | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | ניו אינגלנד Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N HEK293A | |
| קו תאים | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| צלחות 6 בארות | BD Falcon | 353046 | |
| צלחת תרבית רקמות 14 ס"מ | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1) 1Jdgr | Taconic Farms | דגם מס' 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Veneza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM תערובת ויטמינים חיוניים (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads עכבר T-Activator CD3/CD28 להרחבת תאים והפעלה | Invitrogen | 114-56D | |
| רקומביננטי אנושי TGF-beta 1 | R& D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים כחולים ניתנים לתיקון | Invitrogen | L-23105 | |
| עכבר BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| נגד עכבר/חולדה Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | ||
| 4427975 LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
מקורות
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
