$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הרחבת NPCs האדם (איור 1)
- להחיות את המניה הקפואה של NPCs אדם מהמוח העוברי (Lonza, Walkersville, MD, ארצות הברית) ותרבותם בהשעיה בT-75 צלוחיות כneurospheres (איור 1 א) במדיום neurobasal המכילה תוספי התפשטות, EGF (10 ng / ml) ו FGF (10 ng / ml).
- אחרי 3 ימים בתרבות, להעביר את neurospheres לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 500 סל"ד במשך 5 דקות.
- בטל supernatant והותיר אחריו ~ 100 בינוני μl מעל התא גלולה ולהעביר לתוך צינור Eppendorf. גלולה 100 תא μl מספיק להתפצל ל2 T-75 צלוחיות. אם פחות, לצמצם את מספר צלוחיות כתאי neuroprogenitor מצליחים להתרבות אם לפצל דק.
- Triturate את הכדור עם קצה μl 200 50x, תוך שמירה על קצה 200 μl נגד החלק התחתון של הצינור. מחלקים את ההשעיה התא באופן שווה לשני חלקים ולהוסיף אותם ל2 T-75 צלוחיות (1-2 מפוצל), אחת להמשיךהתרחבות ונוספת לבידול.
- המשך התרבות של תאי neuroprogenitor להרחבה (בקבוק הראשון) על ידי שינוי הבינוני כל 4-5 ימים עד neurospheres להגיע לגודלם המקורי של 300-500 מיקרומטר. השנה בינונית על ידי צנטריפוגה (סל"ד 500; 5 דקות), לבטל את המדיום הישן ולהוסיף מדיום חדש.
2. בידול של NPCs האדם לתרבות Neuron עשירה (איור 2)
- להתמיינות של תאי neuroprogenitor לתרבות עשירה של תאי עצב, במקום coverslip יחיד לבאר כל צלחת 24 גם ומעיל עם 100 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי-L-ליזין על ידי הוספת 500 μl לכל אחד. דגירה את הכלים ל30 דקות ב RT.
- לשאוב-L-ליזין פולי הפתרון ולשטוף את הצלחת עם מים סטריליים.
- בשלב בא, מעיל הבארות של הצלחת עם 500 μl 5 laminin עכבר מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את הבארות עם PBS.
- 4 ימים לאחר splitting התאים (שלב 1.4), להעביר את neurospheres הקטנה בבקבוק שכותרתו 'לבידול' לכלים מצופים בצפיפות של ~ 500 neurospheres לכל טוב של צלחת 24 גם.
- לאחר 6 שעות, כאשר neurospheres לצרף הצלחת, להסיר את מדיום ההתפשטות ולהוסיף בינוני בידול בהיקף של מדיום neurobasal, תוסף B27, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 מ"מ), וחומצה רטינואית (2 מיקרומטר).
3. הכתמה Immunofluorescence של NPCs הבדיל (איור 3)
- בעקבות התרבות של תאי neuroprogenitor במדיום בידול עצבי במשך שבועיים, תרבות נוירון עשיר מתקבלת. יש לשטוף את תאי העצב פעם אחת ב PBS ולאחר מכן לתקן אותם בparaformaldehyde 4% במשך 30 דקות. ברגע שנקבע, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
- דגירה התאים עם חיץ permeabilization (BSA 5% ו0.2% טריטון X-100 PBS) ב RT עבור 60 דקות.
- דגירה הצלחות O / N ב 4 i C °שייקר na עם השילוב הבא של polyclonal ונוגדנים חד שבטיים בBSA 3% ב-PBS: NeuN (1:250) וsynapsin (1:250); אצטיל כולינסטרז (1:500) וsynaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) וGAP43 (1:250); STAT3 (1:500) וGFAP (1:1,000).
- שטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה אותם עם נגד ארנב-Cy3 ונוגדנים משני אנטי עכבר FITC ב RT בחושך במשך 90 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS.
- הנח 10 μl של מדיום הרכבה על גבי זכוכית, להוציא את coverslip ממנת התרבות עם מלקחיים, ולמקם אותו במהופך על ההרכבה בינונית. בעדינות, לנגב כל מדיום הרכבה עודף וסוגר את הקצוות עם לק.
- לבחון את הנוירונים immunostained במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. Microdissection לכידת לייזר של נוירונים (איור 4)
- להבדיל NPCs לתרבות נוירון עשיר בשקופית קרום PENs מצופה laminin פולי-L-ליזין והעכבר בעקבות ההליכים המתוארים באיור 2.
- לבצע את כל השלבים הבאים בתנאי RNase חינם.
- כתם התרבויות באמצעות HistoGene כתם (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים.
- מצא האזורים של אוכלוסיות נוירונים טהורות נטולות האסטרוציטים באמצעות תמונת מפת הדרכים של כל השקופית עם מערכת Veritas LCM. סמן את תאי העצב באמצעות כלי הציור.
- מבצע לכידת לייזר של אזורים אלה באמצעות דיוק מבוקר מחשב ואוטומציה בתהליך בן שני שלבים. ראשית, IR (אינפרא אדום) הוא ירה בנקודות מרובות עם הגדרת חשמל לייזר של 70 mW ודופק של 2,500 μsec כדי לקבל הקרום לצרף את הכובע. בשלב בא, באזור המסומן הוא נכרת באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 mV.
- שילוב של תהליכים אלה באופן סלקטיבי לוכד את האזורים המסומנים מן הקרום PEN על כובעי מאקרו CapSure LCM. כאשר הכובע הוא הרים, הקרום עם neurons שומרת על הכובע.
- בודד RNA הכולל דגימות LCM באמצעות ערכת PicoPure RNA בידוד (ארקטורוס) ולטפל עם DNase.
- להגביר את RNA הבודד באמצעות ערכת ההגברה RiboAMP RNA הבאה הוראות מהערכה.
- לבצע ניתוח בזמן אמת RT-PCR באמצעות בדיקות TaqMan לזהות שרשרת כבדה neurofilament האנושי (hNFHc).
קיצורים:
לספירה, מחלת אלצהיימר; BDNF, גורם נוירוטרופי שמקורם במוח; CREB חלבון, מחזורי אלמנט תגובת AMP מחייב; DBC, AMP המחזורי Dibutyryl; EGF, גורם הגדילה באפידרמיס, FGF, גורם גדילה פיברובלסטים; GFAP, חלבון חומצי fibrillary גליה; LCM, לייזר ללכוד microdissection; NGF, גורם גדילה עצבי; NPC, neuroprogenitor תא; PEN, naphthalate פוליאתילן.