Method Article

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

DOI:

10.3791/50487

⸱

September 16th, 2013

 ,  , 
1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי Neuroprogenitor (NPCs) מבודדים מהמוח העוברי האנושי הורחבו בתנאי שגשוג בנוכחות גורם אפידרמיס צמיחה (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) כדי לספק שפע של תאים. NPCs הובדלו בנוכחות שילוב חדש של גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורם במוח (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) וחומצה רטינואית על מנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר כדי להשיג נוירון עשירה בתרבויות. NPCs גם הובדלו בהעדר neurotrophins, DBC וחומצה רטינואית ובנוכחותו של גורם נוירוטרופי הריסים (CNTF) להניב תרבויות astrocyte עשיר. NPCs המובחן התאפיינו מכתים immunofluorescence לפנל של סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43. חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) וSTAT3, סמני astrocyte, התגלו ב10-15% מNPCs המובחן. כדי להקל עלאפיון מולקולרי תאים מסוג מסוים, microdissection ללכוד לייזר בוצע לבודד את תאי עצב בתרבית על naphthalate פוליאתילן שקופיות קרום (PEN). השיטות שתוארו במחקר זה מספקים כלים רבי ערך כדי לקדם את ההבנה של המנגנון המולקולרי של ניוון מוחיים שלנו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירוגנזה חיים ארוכים ידועה להתרחש באזור subventricular של החדרים לרוחב ובשכבת subgranular של gyrus משוננת של המוח של היונקים הבוגרים 1. תאי Neuroprogenitor (NPCs) שמקורם באזורים אלה הם תאי multipotent שיכול להתמיין לתאי עצב, האסטרוציטים וoligodendrocytes 2. NPCs יצרו עניין בשל הפוטנציאל שלהם להיות מושתלים בחולים עם הפרעות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) 3. מחקרים עם NPCs יש בדרך כלל מתמקדים בזווית ההשתלה הזה, אבל את הפוטנציאל של תאי עצב שמקורם בNPC כמודל תרבית תאים כדי לקבוע את המנגנון של ניוון מוחיים לא נוצל במלואו. מחקרים קודמים המשמשים בדרך....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הרחבת NPCs האדם (איור 1)

  1. להחיות את המניה הקפואה של NPCs אדם מהמוח העוברי (Lonza, Walkersville, MD, ארצות הברית) ותרבותם בהשעיה בT-75 צלוחיות כneurospheres (איור 1 א) במדיום neurobasal המכילה תוספי התפשטות, EGF (10 ng / ml) ו FGF (10 ng / ml).
  2. אחרי 3 ימים בתרבות, להעביר את neurospheres לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 500 סל"ד במשך 5 דקות.
  3. בטל supernatant והותיר אחריו ~ 100 בינוני μl מעל התא גלולה ולהעבי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרחבת NPCs (איור 1)

כאשר neurospheres מפורקים להשעית תא בודדת על ידי טחינה דקה, קצה פיפטה צריך לגעת בתחתית של התחתית, כך שיש התנגדות מסוימת, כאשר השעית pipetted למעלה ולמטה. את מספר הפעמים של טחינה דקה ינוע בין יחידים וצריך להיות מוכרע על ידי ניסוי וטעייה על ידי בחינת ההשעיה תא וכתוצאה מכך מתחת למיקרוסקופ. זה קריטי כדי לספק צפיפות מספקת של השעיה תא בגלל הריבוי יהיה בקצב מהיר יותר כאשר NPCs בא במגע ק.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים במחקר זה מודל הנוירון עשיר בתרבית תאים בהתמיינות של תאי neuroprogenitor אנושיים עצמי חידוש ושיטה לבודד את אוכלוסייה טהורה של תאי עצב על ידי microdissection ללכוד לייזר. יש לנו השתמשתי בשילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לבידול עצבי של NPCs. DBC משמש להפעלת CREB, גורם שעתוק שמשפר את הנוירוגנזה 12. חומצה הרטינואית גורמת ליציאת מחזור התא ומפחיתה את אוכלוסיית גליה 13. השיטה המתוארת במחקר זה משלבת שינויים על הדוח הקודם שלנו 14. אנחנו קוד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים להכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הצטיינות סקירה (NEUD-004-07F) מהמנהל הוותיקים (לSP).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תאי נוירו-פרוגניטור (NPCs) LonzaPT-2599
Neurocult NS-A מדיום בסיסי אנושיטכנולוגיית תאי גזע5750
Neurocult NS-A תוסף התפשטותטכנולוגיית תאי גזע5753
Neurocult NS-A תוסף התמיינותטכנולוגיית תאי גזע5754
תוסף B-27 (50x) Invitrogen17504-044
גורם גדילה אפידרמלי אנושיטכנולוגיית תאי גזע2633
גורם גדילה פיברובלסטים סיגמאF0291
איתות תאיגורם נוירוטרופי שמקורו במוח 3897S
גורם גדילה עצבי Invitrogen13257-019
דיבוטיריל מחזורי AMPסיגמאD-0627
פולי-L-ליזין סיגמאP-5899
למינין עכבר סיגמאL-2020
חומצה רטינואיתסיגמאR-2625
STAT3 נוגדןאיתות תאים9132
נוגדן GFAPאיתות תאים3670
GAP43מעבדות העברת נוגדנים612262
נוגדן BDNFMilliporeAB1534SP
נוגדן אצטיל כולינאסטראז Santz cruzSc-11409
נוגדן SynaptophysinAbcamab18008-50
נוגדןNeuN ChemiconMAB377
נוגדן סינפסיןNovusNB300-104
אנטי עכבר FITCJackson Immuno115-095-146
מעבדות
אנטי ארנב Cy3Jackson Immuno711-165-152
מעבדות
BSASigmaA1653
Triton-X 100Acros21568-2500
Paraformaldehye Fisher4042
Coverslip (החלקת כיסוי עיגול גדול)Fisherbrand12-545-102
מדיום הרכבה (זהב מאריך)InvitrogenP36930
ממברנת עטיישומית ביו-מערכות יישומיותLCM0521
ערכת צביעת חתך קפוא Histogene LCMביו-מערכות יישומיותKIT0401
ערכת הגברת RNA RiboAmpביו-מערכות יישומיותKIT0201
ערכת בידוד RNA של Picopureביו-מערכות יישומיותKIT0202
Capsureכובעי LCMשל Macro ביו-מערכות יישומיותLCM0211
מחקרמחקר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionHuman Neuroprogenitor CellsNeuronal DifferentiationImmunofluorescent StainingNeuron Rich CulturePEN Membrane SlidesGene Expression AnalysisNeurotrophic Growth FactorsCell IsolationRNA Amplification

Related Articles