מאמר שיטה

צמיחת מדידה וDynamics ביטוי גנים של גידול ממוקד

DOI:

10.3791/50540

⸱

6 ביולי 2013

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של ניסויים אלה היא להפיק נתונים בזמן קורס כמותיות על הצמיחה והדינמיקה של ביטוי גנים נחלשו ס typhimurium מושבות חיידקים הגדלים בתוך גידולים. סרטון זה עוסק בהכנת גידול תא והשתלה, הכנת חיידקים והזרקה, הדמיה כל בעלי החיים הארה, כריתת גידול, וספירת חיידקי מושבה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של ניסויים אלה היא להפיק נתונים בזמן קורס כמותיות על הצמיחה והדינמיקה של ביטוי גנים נחלשו ס מושבות חיידקי Typhimurium גדלו בתוך גידולים.

אנחנו שנוצרנו גידולי xenograft מודל בעכברים על ידי הזרקה תת עורית של שורת תאי סרטן השחלות אנושית, OVCAR-8 (מאגר גידול DCTD NCI, פרדריק, MD).

אנחנו הפכנו זנים מוחלשים של ס ' חיידקי typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) עם לוציפראז constitutively הביע (luxCDABE) פלסמיד להדמיה 2. זנים אלה במיוחד ליישב גידולים תוך שמירה על המהות שאינה ארסית לעכבר 1.

ברגע שגידולים מדידים הוקמו, החיידקים הוזרקו דרך הווריד דרך וריד הזנב עם משתנה מינון. גידולים מקומיים, ביטוי חיידקי גן היה פיקוח בזמן אמת במהלך 60 שעות באמצעותin vivo הדמיה המערכת (IVIS). בכל נקודת זמן, גידולים שנכרתו, הומוגני, ומצופים לכמת מושבות חיידקים למתאם עם נתוני ביטוי גנים.

יחד, נתונים זה מניב מדד כמותי לצמיחה בvivo ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים הגדלים בתוך גידולים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביולוגיה סינטטי התקדמה במהירות בעשור האחרון, וכעת נמצאת בעמדה כדי להשפיע על בעיות חשובות בתחום אנרגיה ובריאות. עם זאת, התרחבות לזירה הקלינית הואטה על ידי חששות בטיחות והיעדר פיתוח קריטריונים לעיצוב במעגלים גנטיים vivo. האצת יישומים רפואי השפעה גבוהה תדרוש שימוש בשיטות שממשק ישיר עם תשתית רפואית, מעגלים גנטיים שפועלים מחוץ לסביבת המעבדה המבוקרת, ומארחי חיידקים בטוחים וקלינית מקובלים.

מספר הזנים נחקר לטיפול בסרטן בשל היכולת שלהם לגדול באופן מועדף בגידולים. אלה כללו ג נובי, E. coli, ו 'cholorae, longum ב', וס typhimurium 3-8. ס typhimurium יצר עניין מסוים כפי שהם הציגו בטיחות וסובלנות במספר הניסויים קליניים בבני אדם 9-12. bacteri אלה הוצגו בתחילה כדי ליצור אפקטים אנטי סרטניים באמצעות גירוי של מערכת החיסון על ידי המארח ודלדול של חומרים מזינים הנדרשים לחילוף חומרים של תאי סרטן. ייצור של מטענים הטיפוליים מאוחר יותר נוסף בעקבות שינויים גנטיים. בעוד שמחקרים אלה מייצגים התקדמות חשובות בשימוש בחיידקים לטיפולים סרטניים, רוב המאמצים קיימים יש לסמוך על ביטוי ברמה גבוהה, שנובע בדרך כלל במשלוח של מינונים גבוהים, אפקטים מחוץ היעד, והתפתחות של עמידות מארח 13-16 .

עכשיו, ביולוגיה סינטטי עשויה להוסיף ייצור מטענים לתכנות על ידי ניצול מעגלים גנטיים המחשוב מעוצב שיכול לבצע חישה ומשלוח 17-20 מתקדמות. יכולים להיות מתוכננים מעגלים אלה לפעול כמערכות שיגור שחשים גירויים ספציפיים לגידול וייצור מטענים עצמי לווסת לפי צורך. עם זאת, לומד את הפונקציה של מעגלים אלה in vivo עד כה היה מאתגר.

> Ve_content "מאז פלסמידים הם המסגרת המשותפת למעגלים סינטטיים, אנו מתארים שיטה כדי לאפיין את הדינמיקה של ביטוי גנים המבוסס על פלסמיד in vivo תוך שימוש במודל עכבר. שיטות אלה לנצל הדמיה הארה זמן לשגות ומדידת כמותית של biodistribution. יחד, גישות אלה מספקות מסגרת ללימוד רשתות מבוססות פלסמיד in vivo עבור יישומים קליניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תא

  1. שורות תאי מעבר תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות תרבות תא. בניסוי זה, השתמשנו בתאי OVCAR-8 (NCI מאגר DCTD גידול, פרדריק, MD). לגדל תאים ליעד confluency של 80 - 100%.
  2. דגירה תאים עם טריפסין 5 מ"ל במשך 5 דקות, ואז מוסיף 5 מיליליטר מדיום RPMI + FBS להשבית טריפסין.
  3. קציר וספירת תאים בhemocytometer. Resuspend בללא DMEM פנול האדום בריכוז היעד של 5 x 10 7 תאים / מ"ל, או כ -200 μl לכל בקבוק.
  4. הוסף צמיחה המופחת של 15% גורם Matrigel (BD Biosciences) ולשמור את ההשעיה התא על קרח עד השתלה.

2. השתלת גידול

  1. הרדימי 4 נקבות עכברים ישנים שבוע NCR / נו באמצעות 3% isoflurane ולחכות בערך 5 דקות על מנת להבטיח הרדמה עמוקה. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
  2. לטעון את התאים (100 μl לגידול) במזרק 1 מ"ל ולצרף 27 1/ 2 מחט מד.
  3. לכל אחד משני אתרי הזרקת כנף עוקץ אחוריות בין שתי המדינות, להרים את העור בעדינות עם מלקחיים כדי להפוך את האוהל ולהזריק תאים בבסיס. הקפד לא לחדור עמוק מדי, ייצור דם. להשתמש בפינצטה כדי להסיר בעדינות מזרק ללא ניתזים.
  4. לפקח על צמיחת גידול ביום למשך 10 - 20 ימים עד קוטר גידול של 2 - 4 מ"מ הוא הגיע.

3. הכנת חיידקים

  1. התחל תרבות לילה של חיידקים ב3 מ"ל LB תקשורת + אמפיצילין ממניות מקפיא C -80 או צלחת בקירור. בניסוי זה, השתמשנו בס typhimurium הזן ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
  2. בבוקר, לדלל 1:100 התרבות לLB המסונן ולגדול לOD600 0.4-0.6.
  3. ספין למטה ולשטוף 3 פעמים בופר פוספט (PBS) וresuspend בOD600 סופי של 0.1 (כ 1 x 10 7 תאים / מ"ל).

4. הזרקת חיידקים

  1. להרדים את החיהעמדת ד בצד שלה עם הזנב מצביע לכיוון היד הדומיננטית שלך. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
  2. להתרחב וריד הזנב באמצעות מים חמים או מנורת חום.
  3. טען את החיידקים (100 μl לכל עכבר) במזרק 1 מ"ל ולכופף את הקצה רק פחות מ -90 מעלות.
  4. יישר את קצה המזרק עם וריד הזנב, לחדור בעומק רדוד (צריך להרגיש שום התנגדות), ולהזריק חיידקים. שים לב לעקירת זרימת דם לזריקה מוצלחת.

5. עכבר הדמיה

  1. להרדים בעלי חיים בחדר האינדוקציה ואז למקם כל עכבר על פלטפורמת ההדמיה. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לשמור על מיקום מדויק על מנת להבטיח תוצאות כמותיות בין נקודות זמן.
  2. בעלי חיים תמונה באמצעות מערכת ההדמיה IVIS הספקטרום (Caliper מדעי חיים). אם הדמיה של בעלי חיים יותר מאשר 1, מקום מחסומי אור ביניהם כדי למנוע צולב illumination. בעלי חיים צריכים להיות צילמו ראשון בצד הגחון כדי לאשר לוקליזציה של חיידקים.
  3. בעלי חיים תמונה באמצעות dorsally IVIS כל 2 שעות למשך תקופת הניסוי (36 שעות). ליצור כמובן זמן להחזר השקעה נתון.

6. כימות biodistribution קטריאלי

  1. להרדים בעלי חיים באמצעות CO 2 ומקום על הגב על חיתול סופג.
  2. הפעל את החיה כדי לחשוף את שני גידולים תת עורי כנף העוקץ האחוריות. חותכים את רקמת העור שמסביב כדי להפריד ולהסיר את הגידולים. מחזיק את הגידול עם פינצטה, להסיר את העור באמצעות תנועת מספריים הפוכה. כאשר רובו של העור הופרד, להסיר לחלוטין את הגידול באמצעות פינצטה.
  3. מניחים את האיברים בצינורות microcentrifuge-שקלו מראש. מאז המסה של צינורות אלה יכולים להשתנות באופן משמעותי חשוב לשקול מראש אותם לתוצאות כמותיות.

7. כימות biodistribution קטריאלי

  1. עבור כל נקודת זמן, בלו, ולשקול את הגידולים.
  2. להוסיף 500 + 15% גליצרול PBS μl וhomogenize באמצעות רקמות-Tearor (BioSpec). יש לשטוף את 3 פעמים homogenizer עם אתנול בין דגימות.
  3. ליצור דילולים וצלחת לספירת מושבה חיידקים סדרתיים. לצלחת דילולים מרובים בצלחות שימוש מראש מחולקות צלחת אחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים להפיק נתונים על צמיחה בvivo ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים ממוקדים סרטניים. זרימת העבודה הכוללת מסוכמת באיור 1.

בשלב הראשון, אנו מזריקים חיידקים (ירוק) ותמונת חיה באמצעות IVIS למדוד ביטוי גנים עם הארה (כחול) כמדווח.

לאחר מכן, בשלב השני, אנו בלו, homogenize, וגידולים צלחת לספירת מושבה כדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הליך זה, אנו מסוגלים לייצר קורסי זמן לצמיחה ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים מיישבים גידולים. בעוד מדידות אלה מבוצעות באופן שגרתי במבחנה בתרבות אצווה או מכשירים מיקרופלואידיקה, הם הרבה יותר קשים לבצע בגוף חי.

ישנם כמה שינויים שניתן ליישם שיטות אלה. בזמן שאנחנו משמשים-OVCAR 8 שורת התאים לייצר המודלים העכבר שלנו, מספר שורות תאים אחרים עשוי להיות בשימוש באופן שקול. לדוגמה, ניתן להשתמש בשורות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לח' פלמינג לקריאה ביקורתית ועריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת Misrock דוקטורים (TD) וNDSEG בוגרת מלגה (AP). בנק המרכזי של שוויץ הוא חוקר HHMI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"לBD Biosciences309602
3/10 סמ"ק מזרק אינסוליןBD Biosciences309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X), נוזלי, עם L-גלוטמיןInvitrogen11875-119
AmpicillinSigma AldrichA0166-5G
LB אגר מרקסיגמא אולדריץ'L2897
מרק לוריא-ברטאניBD Biosciences244610

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511(2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VivoIVIS

מאמרים קשורים