הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של נוירונים חושיים של

12.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50543

⸱

10 ביולי 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Marine Biology and Fisheries, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences, University of Miami

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית Aplysia אחרי הרדמה, הבידוד של תאי עצב לתרבות לטווח קצר, ברקמות ובהקלטות של זרמי יון תא בודדים באמצעות טכניקת מהדק התיקון.

תקציר

יש חלזון הרכיכה הימי Aplysia californica היסטוריה מכובדת כמודל של תפקוד מערכת עצבים, עם משמעות מיוחדת במחקרים של למידה וזיכרון. ההכנות האופייניות למחקרים מסוג זה הן אלה שבי חושיים ונותרו ללא פגע motoneurons בבעלי חיים גזורים מינימאלי, או תרבות משותפת עצבית טכני משוכללת של חושי וmotoneurons פרט. פחות נפוץ היא ההכנה העצבית המבודדת שבו אשכולות קטנים של תאי עצב להלכה הומוגניות הם ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבות בטווח קצרה. תאים מבודדים כאלה שימושיים לאפיון biophysical של זרמי יונים באמצעות טכניקות מהדק תיקון, ואפנון ממוקד של conductances אלה. פרוטוקול להכנת תרבויות כאלה מתואר. הפרוטוקול מנצל את עצב סנסורי glutamatergic בקלות לזיהוי של גרעיני צדר וbuccal, ומתאר את הניתוק שלהם ותחזוקה המינימאליתתרבות n במשך כמה ימים ללא סרום.

מבוא

רכיכת opistobranch הימית, Aplysia, כבר מודל הנוירוביולוגי שימושי במשך עשורים רבים. הוא ידוע בעיקר כמודל של התרגלות והתניה קלסית 7, 8. מחקרים על למידה וזיכרון במודל זה זכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 2000 לאריק ר 'קנדל, בפרס הוא משותף עם Arvid Carlsson ופול גרינגרד 10. מחקרים שכלל הקלטות חשמל מהכנות מופחתות, שבו אלמנטים של מערכת העצבים של חסר חוליות זה הם גזורים מבעלי החיים עם עצבים ושרירים עזבו מצורף, סייעו להבהיר את התפקידים של נוירונים בודדים בAplysia. זיהוי של מנגנונים מולקולריים מדויקים המהווים למידה בAplysia עם זאת, לעתים קרובות מועסק טכניקה אחרת, לטווח ארוך שיתוף תרבויות של נוירון חושי וmotoneuron, השיגה אחד אחד מבעלי החיים תורמים בודדים ואפשרו ליצירת סינפסה בצלחת תרבות 21 .

אנחנו ואחרים 1, 3, 6, 14, 15, 16, ניצלו את הקלות שבי זיהה יכולים להיות ממוקדים נוירונים במודל זה, כמו גם הסיבולת שלהם בניסויים לטווח ארוך כדי להפוך את תרבויות טווח קצרות ניתקות של צבירי נוירונים להלכה הומוגניות שבו אנחנו לומדים זרמים יוניים תחת מהדק מתח בתצורת תיקון המהדק. נוירונים רבים Aplysia לעמוד לסיבובים חוזרים ונשנים של תיקון הידוק כדי לאפשר זמן למניפולציות ניסיוני לטווח ארוך. הטכניקה שימושית לתאי עצב, כגון תאי neurosecretory השקית של גנגליון הבטן, ואת עצב סנסורי של גרעיני צדר וbuccal דיסוציאציה שאנו מתארים כאן, אבל לא לתאי עצב גדולים מאוד> קוטר 60 מיקרומטר, כגון L7 או R2 של גנגליון הבטן. אנחנו לא מעסיקים Aplysia סרום בתרבויות שלנו, בניגוד לשיתוף התרבויות חושי motoneuron המתוארת במקום אחר. רוב הנוירונים שהושגו באמצעות הליך זה יהיו ללא תהליכים עבור tאז הוא ראשון 48 שעות בתרבות, בהנחיית שלמה הקלטת מתח תא, אלא יצמח ולפרט אקסונים ותהליכים אחרים למשך כ 14 ימים לפני שמת ממחסור בחומרים מזין ו / או גורמי גדילה.

טכניקה זו מייצרת תרבויות העיקריות של 50-100 נוירונים לכל צלחת מאזורים שתועדו פיסיולוגיים של גרעיני buccal וצדר. פרוטוקול זה שימושי לחוקרים לומדים היבטים של פיזיולוגיה של תא בודד בניסויים הדורשים ניסיון רב משכפל לכל בעלי חיים. הוא מייצר זוג תואם של תרבויות בשל ההפרדה האנטומי של תאי המטרה לhemiganglia ימין ועל שמאל, ומאפשר שתועלת ממחקרי הטיפול מתאים ותרבויות בקרה.

פרוטוקול מטרות מצרר buccal S (BSC) הנוירונים של גנגליון buccal ופלאורלי ventrocaudal (PVC) הנוירונים של גנגליון פלאורלי. תאים אלה הם גודל מתאים לכל הקלטות מתח תא וRobus התצוגהתגובות glutamatergic t. המתודולוגיה דנה מתאימה לרוב הגרעינים במערכת העצבים Aplysia.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תא

  1. ביום 1, לשקול ולהרדים בעלי חיים.
    1. שוקל 30 ק"ג חיה G-1. הרדימי במחזורי 5-10 בעלי חיים של 1:1 מי ים: MgCl איזוטוני. 6 שעות 2 0 במשך שעה 1 עם אוורור כגון משאבת אוויר אקווריום חשמלית עם airstone המצורף.
  2. כדאי להכין ציוד לנתיחה.
    1. להרכיב מגש חיתוך נקי עם סיכות ישרות מנירוסטה, כגון סיכות בד. להרכיב כמה צלחות פטרי המכילות מי ים מלאכותי (ASW; ראה לוחות 1 ו -3) + פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
    2. יש מיקרוסקופ חשמל נמוך מוכן. יש מכשירי חיתוך נקיים מוכנים, כגון האף מצולעים ומלקחי כירורגיות בסדר, ובסדר ומספריים כירורגיות גדולים. לרסס את המכשירים עם 70% אלכוהול isopropol לפני השימוש ולאפשר לו להתייבש.
  3. בעלי החיים עמדו על מגש לנתיחה.
    1. עמדת חיה צד למטה הגחון במגש לנתיחה. בעלי חיים פיןדרך קצוות של קיר גוף וגבולות parapodial, אך להימנע מזנב וראש, כדי לחשוף את פני השטח הגבי וחריץ איברי המין
    2. יש לשטוף את המשטח הגבי במים ברז קרים והאיטי בריצה. החל זרם אור של 70% אלכוהול isopropol מבקבוק לחיץ לאורך חריץ איברי המין ועל החלק העליון של הראש.
  4. הפוך את החתך הראשוני.
    1. באמצעות מיקרוסקופ כוח נמוך (ראה טבלה 2) ובא לידי ביטוי באור כדי לראות את הנקודה שבה חריץ המין נובע ממרווח הקליפה הקדמי, מתיחות להחזיק עם מלקחיים מצולע האף קיפול של רקמה בצד השמאל של מקור זה, תוך חיתוך רדוד חור לאורך כל הדרך החלק, האזור השטוח של קיר גוף רק בצד ימין של חריץ איברי המין עם מספריים בזווית משובחים.
    2. Hemolymph יש לשים לב לשפוך מהחור, לעתים נושא עימה גנגליון בטן והבטן.
  5. להרחיב את החתך.
    1. השתמש במספריים גדולים כדי להרחיב את החתך דואר anteriorly לנקודה בין rhinophores, תוך משיכת כלפי מעלה עם הלהב התחתון, כדי למנוע גניבת ציוד המעיים. האיברים הפנימיים יקויימו לשפוך מתוך החתך.
  6. הסר את הגרעינים.
    1. למקם את המגש ולמקד את המיקרוסקופ באזור הראש.
    2. בעזרת מלקחיים נקיים ומספריים עדינים, הסר את גרעיני הראש על ידי ניתוק בנקודה אחת את העצבים היוצרים את גרעיני הראש לתוך טבעת סביב הוושט כדי להסיר צדר-דוושה ומוחות גרעיני כקבוצה.
    3. הסר את גנגליון buccal ששומר על צד הגחון של הוושט.
    4. הסר את גנגליון הבטן על ידי חיתוך 4 connectives העצב גדול שהנושא מגנגליון זה.
  7. לבודד את הגרעינים של עניין.
    1. חתוך גרעיני ראש בנפרד, ומשאיר באורך של connectives מחובר זה לזה גנגליון של עניין ששווה לפחות הקוטר של גנגליון, זה יהיה לעכב אנזים יתר מערכת העיכולשל התאים של עניין בשלב הבא.
    2. לשים את כל גנגליון היעד באמצעות 2 שטיפות של ASW + P / S, נע בין שטיפות עם מלקחיים נקיים.
    3. אם מיקוד תאי PVC, השאר את hemiganglion צדר הזכות צמודה לhemiganglion הדוושה הימנית, ובאופן דומה לעזוב את hemiganglion צדר השמאלי מחובר לhemiganglion הדוושה השמאלית.
    4. השלך הגרעינים לא רצויים ושאר בעלי החיים על פי נוהג מקובל במחקר.
  8. Enzymatically לעכל את הגרעינים.
    1. עבור כל גנגליון, להכין 1 מ"ל של תמיסת אנזים בהיקף של 3.75 מ"ג dispase, hyaluronidase 1 מ"ג ו0.3 גרם collagenase הסוג XI לכל מ"ל של ASW + P / S בצינור פוליפרופילן חרוטי 15 מ"ל.
    2. המקום נשטף הגרעינים בפתרון אנזים ולצרף את הכובע בחוזקה. מניחים את הצינור על צידו על שייקר סיבובי (ראה טבלה 2) במהירות איטית לשעה 13-5 בלילה כ 23 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר).
  9. הכןמנות התרבות.
    1. לפני microdissection (יום 2), להכין מנות התרבות במכסת מנוע בתרבית רקמת פולי-D-ליזין (PDL) מצופים. הוסף ~ 0.5 מ"ל PDL (0.2 מ"ג / מ"ל ​​של מים סטריליים) למרכז צלחת 35 מ"מ ל~ 25 דקות.
    2. יש לשטוף את PDL 3x עם מים סטריליים. לאפשר לו להתייבש. UV-לעקר את הצלחות.
  10. יום 2 בודד תאי עצב.
    1. מלא מרכז 35 מנות מ"מ שהיו PDL מצופה וUV מעוקר עם כ 0.5 מ"ל של ASW + P / S כדי ליצור אי של מדיה בתוך הצלחת אחרת היבשה. ניתן לעשות זאת על הספסל, מחוץ למכסת מנוע בתרבית הרקמה. צלחת אחת צריכה להיות מוכנה לכל אשכול של תאים שמקורם hemiganglion.
    2. יש צלחת לנתיחה בקוטר 100 מ"מ מוכן שנעשתה על ידי sylgard ציפוי וריפוי משטח 5 מ"מ עמוק נתיחה, לבוש עם סיכות לנתיחה קנס של כמה מידות כדי לשמש כסיכות ובדיקות (ראה טבלה 3). יש לשטוף את המנה הזו עם 70% אלכוהול isopropol, ולאחר מכן עם ASW + P / S, ולבסוף Fill עם ASW + P / S.
  11. הכן microdissection של הגרעינים מעוכל.
    1. יוצקים את התמיסה המכילה אנזים צדר-הדוושה וbuccal הגרעינים מתעכלים לתוך הצלחת לנתיחה.
    2. מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ כנגד משטח שחור תחת אור מוחזר.
    3. שימוש ברקמת החיבור המצורפת, להצמיד כל צד הגבי hemiganglion צדר-דוושה למעלה. הרקמות תהיה רכות ולא סובלניים של מתיחה.
  12. Microdissect נוירונים PVC.
    1. באמצעות 2 זוגות של מלקחיים עדינים נקיים, ומחזיק את סיכת נתיחת קנס בזוג אחד של מלקחיים כמו בדיקה, לבודד את תאי PVC מhemiganglion פלאורלי. אנזים עיכול יהיה הוסר או שבורה מנדן רקמת חיבור המכסה את אשכול PVC, אך התאים ידבק אחד לשני.
    2. השתמש הבדיקה לנתק את התאים הללו מחיבור דוושת פלאורלי 18, אז תן אשכול סתיו התא לחלק התחתון של הנתיחהמנה.
  13. העבר את הנוירונים לצלחת התרבות.
    1. העבר את אשכול התא לצלחת תרבות 35 מ"מ שהוכנה על ידי בעדינות מתחנף האשכול לתוך קצה מעט אש מלוטשת חד פעמית זכוכית פיפטה פסטר, ולאחר מכן מחלק אותו לאט לתוך האי התקשורת בצלחת התרבות, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך פיפטה. חזור על בידוד של אשכול PVC של hemiganglion האחרים והמקום לתוך צלחת תרבות נפרדת.
  14. Microdissect ולהעביר נוירונים BSC.
    1. להצמיד את צד הגחון גנגליון buccal למעלה, בזהירות כדי לא לפגוע בתאים של עניין. חזור על שלב 1.12 עם 2 צבירי תאי BSC של גנגליון buccal 10.
    2. בידוד של נוירונים PVC וBSC יהיה לייצר 4 מנות התרבות המכילות צבירי נוירונים המכילות: 2 מנות אשכולות BSC ו -2 מנות המכילים צבירי PVC. מחק את שאר הגרעינים ומניחים בצד הצלחת לנתיחה 100 מ"מ.
  15. Dissociate את צבירי התאים.
    1. מניחים צלחת תרבות המכילה תאים על הבמה של מיקרוסקופ כוח הנמוך ולהסיר את הכיסוי.
    2. לנתק את אשכול PVC בעדינות על ידי מצליף את תחתית צלחת התרבות בסמוך לאשכול התא עם סיכת נתיחת קנס שנערכה במלקחיים. מצליף הוא לחפור את הקצה של הסיכה לתוך הפלסטיק של תחתית הצלחת כאילו מנסה לחפור את כתם מפלסטיק. כאשר חיכוך עם הפלסטיק משחרר את נקודת הסיכה, גל כלי הקשה מופק באמצעות המדיום שמפרק הגוש הסמוך של תאים.
    3. תנועות 05-10 מאי תהיה צורך כמעט לנתק את התאים לחלוטין, אבל עדיף להשאיר את האשכולות קטנים של תאים ולא לקפיציים יותר מדי פן ייהרסו את התאים על ידי צרופה מכאני.
    4. החלפת מכסים ולחזור עם מנות התרבות אחרות.
  16. אחסן תרביות תאים.
    1. מניחים את מנות התרבות המכילות איי תקשורת במרכזים שלהם עם תאים ניתק לתוךמיכל גדול המאפשר זרימת אוויר, כגון צלחת 25 מ"מ x 150 סיבוב פטרי פלסטיק, ומניח את המנה הזו בסט חממה עד 17 ° C.
    2. להתקין בתא צלחת פתוחה של מים כמקור ללחות. לעזוב ללא הפרעה בין לילה. התאים ידבק בציפוי פולי-D-ליזין במרכז הצלחת.
  17. מנות תרבות מבול.
    1. ביום 3, בעדינות להציף את המנות עם 2.5 מ"ל של ASW + P / S. לבחון וספירת התאים באמצעות מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך. חנות ב17 ° C החממה.

2. Electrophysiology

השיטה היא תיקון סטנדרטי הידוק שתואר בטקסטים רבים (למשל סאקמן ונהר, 1995) 16. פרוטוקול זה יעבוד על תאי ≤ קיבול 100 PF, או תאים <קוטר 60 מיקרומטר בימים 3 ו 4 לפרוטוקול. תאים ללא תהליכים הם אופטימליים להקלטה. Considerat המיוחד הבאיונים להחיל:

  1. ניתן לאכלס תאים גדולים יותר עם הגדרת התצורה במגבר 200B Axopatch מוגדר β = 0.1. הפעלה של זרמים גדולים מאוד עלולה לגרום לתאים כדי להימלט מהדק מתח. פתרונות ASW תחליף לתוכן מלח (לדוגמה: חלק של NaCl להחליף עם כלוריד N-methy-D-glucamine בלתי חדיר) עשויים לשמש כדי להפחית את כל משרעת נוכחית תא.
  2. pipettes תיקון ורוסיליקט מלא סיבים משך על חולץ פיפטה וbackfilled אמצע הדרך עם פתרון תאי (ICS) בהיקף של 450 מ"מ KCl ומלחים אחרים (ראה טבלת מס '1) הם מתאים, וצריך להיות התנגדות של כ 0.5-1 MOhms. אם בידוד של זרמים יוניים ספציפיים הוא רצוי, למשל, Na + זרמים יכולים להיות מוחלפות בהיעדר זרמי K, K + בפתרון זה עם יונים אחרים כגון מדעי המחשב +. Cl - החלפה של מעגלים משולבים עם אניון impermeant גם אם מוצדק ICS טבעי יותר הוא רצוי9.
  3. התאים הם חזקים עם> 1 הקלטות ארוכות-HR אפשריים בטמפרטורת חדר. הקלטה היא אופטימלית בימים 3 ו -4 לפרוטוקול, המקביל ל 24-48 שעות בתרבות. לאחר 48 שעות יש קושי להרכיב חותמות gigaOhm, אולי בגלל הפירוט של glycocalyx על פני התא, ובעיות שנגרמו על ידי מהדק חלל תולדת תהליך. התאים שימושיים, עם זאת, ללימודים שאינם תיקון מהדק, כגון רעלים, שיכולים להתבצע ב< 14 ד.
  4. ASW ופתרונות אחרים כדי להימכר מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, כמו גם פתרון תאי, צריכים להיות מסוננים באמצעות מזרק רכוב 0.2 מיקרומטר Acrodisk מסנן (לוח 3) לחסל את החלקיקים קטנים שמפריעים להיווצרות חותם gigaOhm.
  5. הפחתת רגישות מתרחשת בעת שימוש באגוניסטים כגון D-Aspartate (D-ASP), ולכן ~ 1-2 דקות בין יישומים של אגוניסטים מומלץ. לעומת זאת, potentiation הוא נצפה לעתים קרובות עם appli חזר מהירקטיון של אגוניסטים כגון L-גלוטמט (L-Glu).
  6. אגוניסט זרמים הופעלו כגון L-Glu ניתן ללמוד על ידי יישום אגוניסטים עם פיפטה Picospritzer. פיפטה זה משך את אותו הדבר כמו פיפטה את התיקון והוא מכיל אגוניסט בASW. כאשר קצה פיפטה זו ממוקם מתחת לצינור היציאה של מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, ובזווית של ° 45 מצינור יצוא (איור 2F), אגוניסט יהיה שטף במהירות מתא, והפחתת הרגישות תהיה ממוזער. פיפטה אגוניסט צריכה ליצור זווית של 90 מעלות או יותר יחסית לפיפטה את התיקון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

את מיקומם של תאי העצב התחושתיים בתוך הגרעינים שממוקדים בפרוטוקול זה, הנוירונים BSC ו-PVC מוצגים באיור 1. הנוירונים BSC נמצאים ב2 אשכולות סגלגלים סימטריים בצד הגחוני של גנגליון buccal, את פני השטח שפונה מגוש buccal בגנגליון שלם (איור 1 א). הנוירונים PVC יצירת צבירים דו צדדיים, בצורת V שמקיפים את פני השטח הגבי של גנגליון צדר לכיוון הציר המרכזי (איור 1). יש עצב סנסורי אלה יש את היתרון של מיקום סטריאוטיפי בתוך הגרעינים, למרות מקבץ ימי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקות דיסוציאציה מתוארות כאן יניבו תרבויות נוירון חושיות המכילות 50-100 נוירונים בודדים וביניהם מספר קטן של תאי גליה ובלתי מזוהים אחרים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם זמן הגרעינים יישארו בפתרון אנזים, והמצליף, ניתוק מצבירי התאים מתעכלים להתפרק האשכול לתוך תאים בודדים. אנזים עיכול (שלב 1.8) חייב להיות מותאם בטמפרטורה זמינה. בשעה 23 ° C עם רעד איטי, 13 שעות מספיקות לעיכול של BSC אשכולות while15 שעות היא אופטימלית עבור אשכולות PVC. תשואות נמוכות בתא צלחת התרבות ניתן לייחס לזמן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מומן על ידי NIH P40 OD010952, קרן Korein, אוניברסיטת מיאמי המלגה לSLC ואחוות Maytag לATK. המחברים תודה להכיר את צוות של המשאבים הלאומי לAplysia, כמו גם לורן Simonitis וחנה פק, שסיפק micrographs לדמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מי ים מלאכותיים ASWSigma-Aldrichמגוון(מ"מ): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
תמיסה תוך-תאיתסיגמאמגוונת(מ"מ): 450 KCl, 2.9 CaCl<תת>2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA ו-40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysineSigmaP6407 
פניצילין/סטרפטומיצין נוסף ל-ASW בשעה 1:100Lonzo Walkersville, Inc.17-603E5,000 יחידות/מ"ל פניצילין בתוספת 5,000 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין
Neutral dispase IIRoche Diagnostics10165859001 
היאלורונידאזסיגמא-אולדריץ'H4272 
קולגנאז מסוג XISigma-AldrichC9407 
L-גלוטמט (L-GLU)סיגמא-אולדריץ'49601-100G 
D-אספרטט (D-ASP)סיגמא-אולדריץ'11200-10G 
N-מתיל-D-אספרטט (NMDA)ביומול100002-268 
L-ASPSigmaA6683-25G 
אלפא-אמינו-3-הידרוקסיל-5-מתיל-4-איזוקסזול-פרופיונית (AMPA)SigmaA6816-5MG 
אנטגוניסטים של L-Glu Rשונים שונים 
אגר 
קינורנטסיגמא-אולדריץ'61250 
APVסיגמא-אולדריץ'A5282 
DL-2-אמינו-5-פוספונופנטנואית חומצה (אנטגוניסט NMDAR) 
2-פרופנולVWRSPBDH1133 
תמיסת כלורידסיגמאמגוון25 גרם FeCl3 + 25 מ"ל HCl מרוכז + 50 מ"ל H2O
סיליקון סילגארד פולימר 2 חלקיםWorld Precision Instruments (WPI)SYL184מספק משטח פינ-אאוט לצלחות חיתוך קטנות
מיקרוסקופ הגדלה זום 0-40x לנתיחותWild 
Techniquip 150 וואט סיבים אופטיים תאורהמיקרואופטית של פלורידהTQ FOI-150 
אורביטלי RotoMix 50800 
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך של Nikon Diaphot עם מטרות 4x, 20x (אופציונלי) ו-40xSR Research Ltd.Eyelink II 
אוסצילוסקופ דיגיטלי TektronixSR Research Ltd. 
pClamp 10 תוכנה לאיסוף וניתוח נתוניםמולקולריים 
מחשב עם מערכת הפעלה Windows XP ומעלהפתרונותThinkserver עם כוננים קשיחים במצב מוצק (80GB) וצגי רעש נמוכים
חולץ מיקרופיפטה Flaming/Brown P87Sutter Instruments, Novato, CA 
מגבר מהדק Axopatch 200B מבית Axon Instruments עם תחום קיזוז קיבוליות של 1-1000 pF; קדם-מגברמולקולריים, Sunnyvale, CA 
מכלול מחזיק אלקטרודות של Axon Instruments עבור Axopatch 200B קדם מגברהתקנים מולקולריים, Sunnyvale, CACV203BU 
ממיר A/D Digidata 1200התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA 
פיקוספריצר, מופעל על ידי N2 מתכוונן ללחץ ומשך פרקרהאניפין, קליבלנד, אוהיו 
שולחן בידוד רעידות TMC Micro-GAmetek 
כלובייצור מותאם אישית
Burleigh Piezoelectric Clamshell MicromanipulatorsBurleigh Instruments; Thorlabsכיום PCS-5000; -סדרה 6000 + תושבות
מניפולטורים ידניים Narishige M-152 (למערכת זלוף ופיקוספריצר)Narishige USA 
זכוכית פיפטה נימה, 1.5 מ"מ OD, קוטר פנימי 0.84 מ"מ -WPI1B150-3 
3 אינץ' 
Ag/AgCl חצי תאWPIEP4 
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, צינורות צנטריפוגה 35-2097 BD Falcon*VWRSP21008-918 
מספריים זוויתייםכלי מדע עדינים15006-09 
מלקחיים משובחים של דומוסטרכלי מדע משובחים11295-00 
כלי תרבית רקמות בז 35 מ"מVWRSP25382-064 
פלקון 150 x 25 מ"מ כלי תרבית רקמה; 1013VWRSP1013ניתן גם להפוך לכלי חיתוך קטנים עם sylgard
sylgardWPISYL184 
מגש נתיחת בעלי חייםשונים 
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 35-2097 BD FalconVWRSP21008-918למערכת זלוף 6 קדחים המוזנת בכוח הכבידה
קליפסים מאלומיניום עם קצוות חור בורגלחומרי בנייןלמערכת זלוף
23 מחטים (נקודות כיבוי תיוק ידניות)VWRSPלמערכת זלוף
צינורות פוליאתילן 0.022 "מזהה x 0.042" OD; 427411בקטון-דיקינסוןעבור מערכת זלוף
H-7 פיפטה מעמד / מחזיק למערך זלוף microcapNarishige ארה"בלמערכת זלוף
חד כיוונייםלמערכת זלוף
Drummond Microcaps 1 μ lVWRSPלמערכת זלוף
18 מחטי מד ליניקה (תייק נקודות) 
צינורות פוליאתילןקול פארמר4.27436E+11 
סיכות חיתוך עדינותכלי מדע עדינים26002-20 
צינורות נימייםKimble 71900-100מלוטשים באש ובצורת U בלהבת מבער בונסן וממולאים באגר 3% בחנות
מלאכתחימר לדוגמנות 
מחזיק כלים לשלב מיקרוסקופ עם אמבטייצור מותאם אישית
פיפטות פסטורVWRSP14672-412 
נורות פיפטהVWRSP53283-911 
מסנני מזרק AcrodiskVWRSP28144-040 
זכוכית נימה בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ"מ בקוטר 1.5 מ"מWPI1B150F-3 
גליל חנקן בטוהר גבוה ווסת 

טבלאות 1-3. רשימות ריאגנטים, חומרים וציוד.

מערבל התקנים מחשב התקנים פאראדיי אורך חנות שסתומים ECS קרקע מבודד מתפצל

מקורות

  1. Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
  2. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
  3. Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
  4. Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
  5. Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
  6. Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
  7. Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
  8. Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
  9. Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
  10. Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
  11. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  12. Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
  13. Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
  14. R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  15. Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
  16. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
  17. Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
  18. Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
  19. Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
  20. Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
  21. White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
  22. Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
  23. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד נוירונים תחושתייםדיסקציה של גנגליוןעיכול אנזימטידיסוציאציית תאיםהכנת כלי תרביתקיבוע מתח (Voltage Clamping)תחזוקת תרבית עצבית
בידוד של נוירונים חושיים של
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.