מאמר שיטה

לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

DOI:

10.3791/50566

⸱

12 בדצמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), CNRS/Université Paris Diderot, 2ImagoSeine BioImaging Core Facility, Institut Jacques Monod, CNRS/Université Paris Diderot, 3Laboratoire d'Immunopathologie et Chimie Thérapeutique, CNRS/Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, המטרה העיקרית הייתה לנטר את הספיגה התאית ובסופו של דבר אקסוציטוזיס של ננו-צינורות פחמן (CNTs). מנקודת מבט זו, הצענו כאן שיטה ייחודית המשתמשת בציטומטריית זרימה של הדמיה מולטי-ספקטרלית המאפשרת כימות ולוקליזציה של CNTs במספר תאים רלוונטי סטטיסטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-חומרים מבוססי פחמן, כמו ננו-צינורות פחמן (CNTs), שייכים לסוג זה של ננו-חלקיקים שקשה מאוד להבחין בינם לבין מבני תאים עשירים בפחמן ודה פקטו עדיין אין שיטה כמותית להעריך את תפוצתם ברמת התא והרקמה. מה שאנו מציעים כאן הוא שיטה חדשנית המאפשרת זיהוי וכימות של CNTs בתאים באמצעות ציטומטר זרימת הדמיה מולטי-ספקטרלי (ImageStream, Amnis). מכשיר זה שפותח לאחרונה משלב הן תפוקה גבוהה של תאים והן הדמיה ברזולוציה גבוהה, ובכך מספק תמונות עבור כל תא בזרימה ישירה ולכן ניתוח תמונה רלוונטי מבחינה סטטיסטית. כל תמונת תא נרכשת בערוצים של שדה בהיר (BF), שדה כהה (DF) ופלואורסצנטי, מה שנותן גישה בהתאמה לרמה ולהתפלגות של ספיגת האור, האור המפוזר והפלואורסצנטי עבור כל תא. הניתוח מורכב מהשוואה של פיקסל אחר פיקסל של כל תמונה, של 7,000-10,000 התאים שנרכשו עבור כל תנאי של הניסוי. לוקליזציה וכימות של CNTs מתאפשרים הודות לכמה תכונות מהותיות מסוימות של CNTs: ספיגת אור ופיזור חזקים; אכן CNTs מופיעים ככתמים כהים נספגים חזק ב-BF וכתמים בהירים ב-DF עם קו-לוקליזציה מדויקת.

למתודולוגיה זו יכולה להיות השפעה ניכרת על מחקרים על אינטראקציות בין ננו-חומרים ותאים בהתחשב בכך שפרוטוקול זה ישים עבור מגוון גדול של ננו-חומרים, ככל שהם מסוגלים לספוג (ו/או לפזר) את האור בצורה חזקה מספיק.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשורים האחרונים, מקומם של ננו-חלקיקים צבר חשיבות במגוון רחב של יישומים. בפרט, ננו-צינורות פחמן (CNTs) נחקרים יותר ויותר כננו-כלים ליישומים אבחנתיים וטיפוליים מגוונים; הודות לתכונות החשמליות, התרמיות והספקטרוסקופיות המיוחדות שלהם, CNTs יכולים לשמש ככלי משלוח לתרופות מגוונות או חומרי ניגוד, או יכולים להיות מעורבים גם בהנדסת רקמות1.

עם זאת, חששות לגבי הרעילות הפוטנציאלית של ננו-חומרים כאלה עדיין נמצאים במחלוקת, בעיקר מכיוון שגורלם של CNTs באורגניזם נותר שנוי במחלוקת מאוד. אכן חסרות שיטות מתאימות לאיתור וכימות שלהם בתאים ורקמות חיים: לדוגמה, הוצעו טכניקות כמו ספקטרוסקופיה של ראמאן, פוטו-אקוסטית והדמיית פוטו-לומינסנציה קרובה לאינפרא אדום, אך כל שיטה מראה מגבלות בהתאם לסוג הננו-צינוריות ו/או סביבתן2-8.

כאן, השיטה המוצעת יכולה להיות ישימה לזיהוי וכימות של ננו-חלקיקים בתאים. זה התאפשר הודות לשימוש ב-ImageStream, מכשיר המשלב גם זרימה ציטומטרית וגם הדמיה ברזולוציה גבוהה. הוא משלב את היתרונות של רכישת תאים גדולים (עד 5000 אירועים לשנייה) - והיתרונות של נתונים סטטיסטיים ותמונות ברזולוציה גבוהה של כל תא בו זמנית (רזולוציה מרחבית של 0.5 מיקרומטר). בדרך כלל, תמונות נאספות באמצעות מצלמת CCD והן ייצוג דו-ממדי בקנה מידה אפור של התא. האור מכומת עבור כל פיקסל בתמונה ומזהה הן את העוצמה והן את המיקום של הקרינה או רכיבים בעלי גודל תת-תאי (ב-BF למשל), מה שמאפשר בכך יכולת רבת עוצמה להבחין בין תאים על סמך המראה שלהם9,10.

המטרה כאן הייתה לתכנן שיטה ננומטרולוגית שתאפשר הערכה כמותית של התפלגות והתנהגות CNTs בתאים. בפרט, שיטה זו פותחה כדי לחקור קליטה תאית, עיבוד ואקסוציטוזיס של CNTs על ידי תאים. הוכחנו תחילה את הסחר התאי המורכב של CNTs ושנית את ההעברה של ננו-חומרים אלה בין תאים: CNTs מופנמים בתאים בורחים מתאי המארח שלהם כאשר הם בלחץ, מתפשטים לחו"ל בחלל החוץ-תאי ומופנמים מחדש על ידי תאים נאיביים, בין אם הם הומוטיפיים או הטרוטיפיים11

.

מחקר קודם הראה כי מנגנונים שונים של קליטת תאים, אקטיביים או פסיביים, יכולים להתרחש בהתאם לתפקוד CNT ומצב צבירה12. כאן ה-CNTs מרובי הקירות פונקדו באמצעות ציקלו-הוספה ואמידציה של 1,3-דו-קוטבי ולאחר מכן נגזרו עם בדיקה פלואורסצנטית, פלואורסצנטית באיזותיוציאנט (FITC). במיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, נראה שהם מופנמים על ידי תאים בנפרד עם לוקליזציה ציטוזולית או כצרורות, הנמצאים בעיקר בתאים אנדוזומיים וליזוזומליים11. ב-ImageStream, ה-CNTs המקובצים מופיעים עם מתאם גבוה ככתמים כהים על BF וכתמים בהירים על DF, מה שמאפשר הבחנה ברורה בין תאים המסומנים ב-CNT לתאי בקרה. מצד שני, התפלגות האות הפלואורסצנטי הנפלט על ידי הסמן הפלואורסצנטי הפונקציונלי עם CNTs לא הייתה כל כך מקומית: ואכן, ככל הנראה עקב תופעת מרווה, הכתמים הפלואורסצנטיים הירוקים אינם תואמים בהכרח את הכתמים ב-BF ו-DF. זה מצביע על כך שראשית, בדיקה פלואורסצנטית אינה חובה לזיהוי CNTs עם ImageStream, ושנית - קל וחומר - שהיא אינה מייצגת באופן מלא הן לכימות והן ללוקליזציה של CNTs.

מעבר לכימות יחסי סטטיסטי של ננו-חלקיקים, שיטה זו מספקת גם מידע הנוגע ללוקליזציה של CNTs בתאים, כלומר היא מבחינה, למשל, CNTs בחלק הפנימי של התא לעומת אלה הקשורים לקרום הפלזמה. היכולת למקם CNTs בתמונות תאים מתגברת בבירור על המגבלה של ניתוח ציטומטריית זרימה קונבנציונאלי13. ההליך פותח כאן באמצעות יצירת מסכות המתאימות לאזורים ספציפיים בתא ובחירת הכתמים הכהים המתאימים ל-CNT טעונים.

באופן כללי, שיטה זו יכולה להיות מיושמת עבור מגוון רחב של ניסויים הכרוכים בצורך בהדמיה, או כמות, בתאים, בתנאי שהננו-חלקיקים המשמשים מסוגלים לספוג חזק (ו/או לפזר) את האור.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ננו-צינורות פחמן לפיזור מים (CNTs)

  1. פזרו את ה-CNT הראשונים במי תרבית תאים, לפני סוניקציה למשך 20 דקות בסוניקטור מי אמבטיה ב-20 מעלות צלזיוס. אם CNTs מתפקדים עם בדיקה פלואורסצנטית, הגן עליהם ככל האפשר מפני אור לאורך כל הניסוי.

2. תיוג תאים עם CNTs

  1. לגדל תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVEC) (למשל) על צלחות של 25 סמ"ר במדיום DMEM, המכילים 10% סרום בקר עוברי ו-1% סטרפטומיצין פניצילין.
  2. הכן תמיסות של CNTs בריכוז של 0, 10, 20 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל במדיום שלם ותאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות או ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות (2 מ"ל של תרחיף CNT לצלחת של 25 ס"מ).

3. קיבוע תאים

  1. הסר את מדיום הדגירה לאחר מכן; שטוף תאים עם PBS, נסה והשהה מחדש תאים במדיום DMEM שלם. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,200 סל"ד.
  2. החלף את המדיום תחילה ב-paraformaldehyde 4% למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ב-PBS כדי לשמר אותם. במידת הצורך ניתן לאחסן תאים בשלב זה של התהליך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים עד לניתוח הציטומטריה.
  3. כל דגימה צריכה להכיל כ-106 תאים המרוכזים ב-50 מיקרוליטר של PBS. השעו אותם בצורה נכונה כדי למנוע אגרגטים במהלך הניתוח וסנן אותם דרך מכתים רשת של 50 מיקרומטר.
    הערה: יש לבצע כל שלב בעדינות רבה כדי לשמר תאים.

4. רכישת ImageStream

השתמש בציטומטר זרימת ההדמיה הרב-ספקטרלית ImageStream כדי לרכוש תמונות של תאים.
יש לכבד כמה נקודות:

  1. בחר הגדלה מותאמת (כאן נעשה שימוש במטרה של פי 40).
  2. אם משתמשים בפלואורוכרום:
    - הכן דגימת בקרה ללא פלואורוכרום.
    - הכן תאים עם בקרה חיובית בצבע יחיד לכל פלואורוכרום המשמש ב
    בנוסף לדוגמאות שלך.
  3. השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לעורר את ה-FITC ובערוץ 02 כדי לאסוף את פליטת הקרינה (פס פס 480-560 ננומטר). בנוסף, השתמש גם בערוצים 01 ו-06 עבור השדה הבהיר (BF) והשדה הכהה (DF) בהתאמה.

5. לאחר עיבוד - תוכנת ניתוח IDEAS (גרסה 4.0)

  1. מבין כל האירועים שנרכשו, יש להגביל תחילה את הניתוח לאוכלוסיית התאים הבודדים: השתמש בתרשים נקודות דו-פרמטרי המייצג 'יחס גובה-רוחב' (כלומר רוחב/גובה) לעומת 'שטח תא' (פרמטרים המיושמים על תאים ב-BF) (איור 1). תאים בודדים הכלולים באזור העניין עם שטח סטנדרטי ויחס גובה-רוחב קרוב ל-1 מופלים לאחר מכן מאירועים רב-תאיים (שטח גדול ויחס גובה-רוחב קטן) ופסולת (שטח קטן במיוחד).
  2. כדי לבחור תאים במישור הממוקד, השתמש בתרשים נקודות דו-פרמטרי המותאם לתאים המסומנים ב-CNTs עם ניגודיות גבוהה: התווה את ה'ניגודיות' לעומת 'שיפוע RMS' (המודד את איכות החדות של תמונה) בתמונת BF - זה מאפשר הוצאה של תאים לא ממוקדים המציגים הן שיפוע RMS נמוך והן ניגודיות נמוכה בתמונות ה-BF שלהם (איור 1).
    1. קבע את הפרמטר המספק את ההפרדה הסטטיסטית הטובה ביותר בין תאים מסומנים לתאים ללא תווית באמצעות "מצא את התכונה הטובה ביותר". במחקר שלנו, תכונת אובייקט הפיקסל הממוצע היא הפרמטר המתאים ביותר (איור 2).
    2. עקוב אחר היסטוגרמה באמצעות פרמטר זה לעומת התדר המנורמל כדי להשוות את כמות ה-CNTs שנקלטו עבור ריכוזים שנבדקו (איור 3).
    3. עקוב אחר הגרף הדו-פרמטרי 'אובייקט פיקסל ממוצע על BF' (סימון: ממוצע Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) לעומת 'עוצמה על DF' (Intensity_MC_Ch06), על מנת לחקור את המתאם בין שני הפרמטרים הללו (איור 4).
  4. הכימות מוערך גם באמצעות מסכות:
    1. מכיוון ש-CNTs מופיעים ככתמים כהים הסופגים בעוצמה על BF, צור תחילה מסיכת סף המתאימה להם במדויק על ידי בחירת טווח מוגבל של פיקסלים בעוצמה נמוכה המורכב בין 0-533 במחקר זה (מסכה 1, סימון: עוצמה (M01, BF, 0-533)) (איור 5). הבחירה בעוצמת הסף נעשית על תאים מסומנים בהשוואה לתאי הבקרה.
    2. לעומת זאת, צור גם מסכה המתאימה לפיקסלים בעוצמה גבוהה (150-4095 במקרה זה) של ה-DF (מסכה 2, סימון: עוצמה (M06, DF, 150-4095)) (איור 6).
    3. התוויית גרף באמצעות שטח המסיכה (1 או 2; (סימון: Area_Intensity(M01, BF, 0-533) עבור מסכה 1): זה יספק כימות יחסי של הפנמת CNTs בריכוזים שונים (איור 7).
    4. בדוק את מידת המתאם בין שתי המסכות הללו (הודות לתרשים הדו-פרמטרי 'שטח מסכה 1' לעומת 'שטח מסכה 2') (איור 7).
  5. צור מסיכות אחרות כדי למקם CNTs בתאים:
    1. מסכה המתאימה לחלק הפנימי של התא: Erode(M01, 7) - המקבילה למסכה של התא כולו (M01) (איור 8), שנשחקת עוד יותר מ-7 פיקסלים (איור 9).
    2. מסכה המתאימה לממברנה רק באמצעות המשוואה הבוליאנית: M01 ולא Erode (M01,7) - מסכה של התא כולו (M01) מופחתת מהפנים (Erode(M01,7)) (איור 10).
    3. כדי לקחת בחשבון את הפיקסלים הכהים על הממברנה (המתאימים ל-CNTs), צור אז את המסכה: עוצמה(M01 ולא Erode(M01, 7), BF, 0-533) (איור 11).
    4. דמיין את המסיכות השונות המוחלות על אוסף תאים כדי לבדוק את הרלוונטיות שלהן (איור 12) עבור תאים מסומנים וללא תווית.
    5. החל את אזור התכונה על המסכה ובחר את הפיקסלים השחורים על הממברנה 'Area_עוצמה(M01 ולא Erode(M01, 7), BF, 0-533)' מה שנקרא אזור שחור. זה יאפשר לכמת את ה-CNTs על הממברנה.

      כדי להבחין סופית בין CNTs שהופנמו מאלה שנספחו רק על הממברנה, שרטטו את האזור השחור על הממברנה לעומת האזור השחור על התא כולו (כלומר 'עוצמת Area_ (M01 ולא שחיקה (M01, 7), BF, 0-533' לעומת 'עוצמת Area_ (M01, BF, 0-533)').

      הערה: אותו סוג של נוהל מיושם עם האות הפלואורסצנטי FITC: השווה את העלייה בעוצמת הקרינה של FITC לעומת ירידת אות הפיקסלים הממוצע ב-BF, או את הקו-לוקליזציה בין כתמים כהים בעוצמת הקרינה BF ו-FITC. במקרה שלנו, סוג זה של ניתוח אינו רלוונטי מכיוון שאות הקרינה אינו תואם נכון לכתמים כהים ב-BF מצד אחד ולשדה בהיר ב-DF מצד שני, מה שמראה שתכונות מהותיות של CNTs (ספיגת אור ופיזור) מתאימות יותר מהאות הקשור לבדיקה הקרינה.
  6. לאחר יצירת כל העלילות בתנאי ניסיוני אחד, צור "תבנית דוח סטטיסטי", שמור את התבנית כקובץ .ast ואצווה את כל קבצי הנתונים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה כללית של העיקרון של התקן ImageStream ניתנת באיור 1. הוא מייצר מספר תמונות ברזולוציה גבוהה של כל תא בזרימה, כולל שדה בהיר (BF), שדה כהה (DF או אור מפוזר בצד) ותעלות פלואורסצנטיות, כפי שמודגם באיור 2 עם שלושה תאים שונים המסומנים ב-CNT. שכבות העל של ערוצים אלה מוצגות גם הן, וממחישות ממבט ראשון את המתאם.

בהתחשב בכך שכל הניתוח שלאחר העיבוד מבוסס על דימות תאים, בחירת התאים הממוקדים היא קריטית למחקר (איור 3). למעשה, נוכחותם של CNTs גורמת לשינויים הן בניגודיות והן בשיפוע בהשוואה לתאים שאינם מסומנים: תאים ממוקדים, לאחר שהפנימו כמות חשובה של CNTs, נוטים להיות בעלי שיפוע RMS נמוך (שהוא בדרך כלל הפרמטר הייחודי המשמש להבחנה בין תאים ממוקדים לעומת תאים לא ממוקדים) אך גם ניגודיות חשובה, המסביר מדוע עלילה דו-פרמטרית חיונית. באיור 3 מוצגת ההבחנה בין תאים לא ממוקדים (אזור צהוב) לעומת תאים ממוקדים (אזור כחול).

ניתן להבחין בבירור ב-CNTs מופנמים בתאים - במיוחד ב-BF המופיע ככתמים כהים הסופגים חזק (ראה את ההשפעה של ריכוז תיוג מגוון, איור 4). יתר על כן, נותח אות הפיקסלים הממוצע ב-BF, ונתן כימות יחסי של הקליטה: גרפים באיור 5 מראים את העלייה המשמעותית שלו עם ריכוז תיוג ה-CNT (תוצאות עבור כ-7,000 תאים לכל תנאי ניסוי).

שנית, כימות של CNTs אפשרי גם באמצעות שימוש במסכות, המיושמות על טווח מוגבל של פיקסלים כהים של ה-BF או על פיקסל בעוצמה גבוהה של ה-DF (ראה דוגמאות באיור 6), המתאים לכתמים הנובעים מנוכחות CNTs. לפיכך, התוויית השטח של מסכות אלה מאפשרת הדגשה כמו גם הגברת הספיגה (מודגם באיור 7 עם שטח המסכה ב-BF, בחירת פיקסלים הנעים בין 0-533).

בנוסף, ניתן להעריך את המתאם בין כתמים ב-BF ו-DF על ידי התוויית עוצמת ה-DF לעומת אות הפיקסלים הממוצע של BF (כמו באיור 8) (ניתוח בלתי תלוי במסכה) או אזור המסכה ב-BF (מסכה 1) לעומת האזור ב-DF (מסכה 2).

לגבי ההליך שנוצר ללוקליזציה של CNTs בתוך התאים, איור 9A מציג את המסכות השונות שנוצרו. שים לב שיש לבדוק באופן חזותי את החוסן של מסיכות הלוקליזציה (בהתבסס על שחיקה של מסיכת התא המוגדרת כברירת מחדל) באוסף של תאים עם תוויות וללא תווית. אותן מסכות משמשות לכל הדגימות.

שרטוט השטח הכולל של כתמים שחורים על קרום התא לעומת זה שעל התא כולו מספק ציון הפנמה לתאים שהודגרו במשך 20 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בהשוואה לדגירה של שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס (ראה איור 9B); זה מצביע על כך ש-CNTs ממוקמים בעיקר על הממברנה ב-4 מעלות צלזיוס, ואילו ב-37 מעלות צלזיוס CNTs מופנמים ביותר מ-90% מהתאים.

לבסוף, לגבי הקרינה, פרמטר זה לא שימש כאינדיקטור לכימות CNTs עקב מתאם נמוך מדי בין כתמים פלואורסצנטיים לכתמים ב-BF (ו-DF). ואכן, המתאם בין עוצמת ה-FITC לפיקסל הממוצע של השדה הבהיר מצביע על מקדם מתאם פירסון של -0.2. באיור 10 מומחשים שני מקרים, שבהם אות הקרינה תואם כראוי או לא עם הנקודה השחורה של השדה הבהיר.

figure-results-1
איור 1. סקירה כללית של ה-ImageStream - הפעלה כללית. מערכת ההדמיה המולטי-ספקטרלית רוכשת עד 12 תמונות/תא בשלושה מצבים שונים: שדה בהיר, שדה כהה ופלואורסצנטי. ההתקנה מורכבת מ-5 לייזרי עירור, כולל 405, 488, 560 ו-658 ננומטר. אור נאסף מהתאים הזורמים בקובט עם עדשות אובייקטיביות שונות (במחקר זה נעשה שימוש בעדשת האובייקטיבית 40X) ומועבר לאלמנט הפירוק הספקטרלי, המורכב מקבוצה של מסננים ארוכים במערך זוויתי. מצלמת ה-CCD שאוספת תמונות תאים מופעלת בטכניקה הנקראת זמן-עיכוב-אינטגרציה על מנת למנוע פסים של תמונה. עומק שדה מורחב (EDF) הוא אופציה.

figure-results-2
איור 2. גלריית תמונות של תאים המסומנים בננו-צינורות פחמן (50 מיקרוגרם/מ"ל) שנלכדו על ידי ImageStream דרך ערוצים מגוונים (שדה בהיר (BF), שדה כהה (DF), פלואורסצנטיות (FITC) ושכבותיהם). CNTs הכלואים בתוך ליזוזומים תוך-תאיים מופיעים ככתמים שחורים גדולים בתמונות שדה בהיר. לעומת זאת, הם יוצרים כתמים בהירים על השדה הכהה ועל תמונות הקרינה.

figure-results-3
איור 3. בחירת תאים במוקד. תרשים נקודות דו-משתני המייצג שיפוע שורש ממוצע ריבועי (rms) לעומת ניגודיות בתמונות BF מאפשר אי הכללה של תאים לא ממוקדים. כאן האזור הצהוב מייצג תאים לא ממוקדים, בעוד שתאים ממוקדים מיוצגים בכחול. התאים הלא ממוקדים מאופיינים הן בניגודיות נמוכה והן ב-rms בשיפוע נמוך בתמונת השדה הבהיר. בנוסף לשיפוע rms, תכונת הניגודיות נדרשת להבחין בין תאים ממוקדים לאחר התיוג שלהם עם CNT.

figure-results-4
איור 4. קליטה תלויה במינון של CNTs המוצגת על ידי ImageStream. מספר ושטח הכתמים השחורים בתמונות השדה הבהיר גדלים עם המינון של CNTs במהלך הדגירה עם תאים (נע בין 0-50 מיקרוגרם למ"ל). שימו לב שתאי הבקרה נטולי כתמים שחורים.

figure-results-5
איור 5. כימות יחסי של קליטת CNT על סמך תמונות השדה הבהיר. היסטוגרמות של תכונת הפיקסל הממוצע המופעלת על "אובייקט" המסיכה הכוללת את כל התא מראות בבירור התנהגות תלוית מינון, שניתן להשתמש בה לכימות טווח R9 סוגר את התאים החיוביים ל-CNT.

figure-results-6
איור 6. יצירת מסכות לבחירת כתמים שחורים ב-BF וכתמים בהירים בתמונות DF. מכיוון ש-CNTs מופיעים ככתמים כהים הסופגים חזק בתמונת BF, נוצרת מסיכת סף לבחירת טווח מוגבל של פיקסלים בעוצמה נמוכה המורכבת בין 0-533 במחקר זה (מסכה 1, סימון: עוצמה(M01, BF, 0-533))). לעומת זאת, מסכה המתאימה לפיקסלים בעוצמה גבוהה (150-4095 במקרה זה) בתמונת DF (מסכה 2, סימון: עוצמה (M06, DF, 150-4095)) משמשת לבחירת נקודה בהירה ב-DF, המתאימה לאזורי פיזור גבוהים.

figure-results-7
איור 7. קליטה תלויה במינון של CNTs מודגמת על ידי כימות של אזור הנקודה השחורה בתמונות BF. באמצעות מסיכת סף (מסכה 1) המונחת על BF, ניתן לכמת את שטח הכתמים השחורים עבור כל תא, המראה התפלגות תלוית מינון.

figure-results-8
איור 8. שיטות כימות CNT המבוססות על תמונות BF (ספיגה) ו-DF (פיזור) מתואמות. משמאל, ממוצע הפיקסל בתמונת ה-BF לעומת העוצמה בתמונת ה-DF, הראה מתאם טוב לתאים המסומנים ב-CNTs (50 מיקרוגרם/מ"ל) (מקדם מתאם פירסון r = -0.68). מימין, אזור המסכה מתאים לכתמים כהים על BF לעומת אזור המסכה המתאים לכתמים בהירים על DF עבור תאים המסומנים ב-CNT (50 מיקרוגרם/מ"ל). מקדם המתאם של פירסון הוא r = -0.83.ערכים מ-7,000 תאים משורטטים.

figure-results-9
איור 9. לוקליזציה של CNT בתאים באמצעות מסכות ספציפיות. (A) מסכות נוצרות כך שיתאימו למיקום מסוים בתא, כלומר משמאל לימין - התא כולו, הממברנה בלבד, והחלק הפנימי של התא. מסכה נוספת מתאימה לכתמים שחורים הודות לעוצמת סף (מסכה 1, סימון: עוצמה (M01, BF, 0-533)). (B) ניתן לקבל הערכה של לוקליזציה של CNTs על ידי מדידת שטח הכתמים השחורים בלוקליזציות שונות של התאים באמצעות מסכות הלוקליזציה המתוארות ב-A. דגירה עם CNTs (50 מיקרוגרם/מ"ל) בוצעה הן ב-37 מעלות צלזיוס והן ב-4 מעלות צלזיוס כדי לעכב את מסלול ההפנמה. הגרף המייצג את האזור השחור על הממברנה לעומת האזור השחור על התא כולו מראה ספיגה תלוית מינון של CNTs על הממברנה ב-4 מעלות צלזיוס, בעוד שהפנמה מלאה של CNTs יעילה ב-37 מעלות צלזיוס.

figure-results-10
איור 10. קולוקליזציה של כתמים שחורים המושרים על ידי CNT על BF עם כתמים בהירים פלואורסצנטיים בתמונת FITC. הכתמים הבהירים הקרינה לא תמיד מקובלים יחד עם הכתמים השחורים ב-BF. הם מתאימים כראוי לשני התאים הראשונים המוצגים, אך לא לשני התאים האחרונים.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שינוי ופתרון בעיות

במחקר זה, המטרה הראשונה הייתה להעריך את הכמות והלוקליזציה של CNTs בתאים. המיקרוסקופיה הקונפוקלית יכולה הייתה להיות אפריורי שיטת הזהב להערכת ההתפלגות התוך-תאית של CNTs המתפקדים עם הסמן הפלואורסצנטי FITC8,14. עם זאת, החיסרון העיקרי הוא המגבלה להדמיה של תא בודד ולכן היעדר נתונים רלוונטיים מבחינה סטטיסטית. ה-ImageStream מאפשר עבודה מעבר למכשולים הללו: ואכן, על ידי סינון מספר רב של תאים (5,000-10,000) בזמן קצר (<דקות), הוא מניב תוצאות חזקות סטטיסטית, המשופרות גם על ידי הדמיה ברזולוציה גבוהה המספקת תמונות לכל תא ברזולוציה תת-תאית (0.5 מיקרומטר). לאחר מכן זה מאפשר לנתח כמות גדולה של נתונים על סמך ניתוח תמונה בודדת.

בהשוואה לציטומטריית זרימה קונבנציונלית, היתרון הייחודי של ImageStream הוא לספק תמונות מולטי-ספקטרליות של כל תא והשוואה של פיקסל אחר פיקסל של עוצמת האות. לפיכך, ImageStream משלב את הכוח הסטטיסטי של ציטומטריית זרימה בתפוקה גבוהה עם היתרונות האנליטיים של הדמיה קונפוקלית עבור כל תא מנותח. זה חיוני לכימות יחסי ללא תווית ולוקליזציה של CNTs בתאים.

2. שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול

השלב הקריטי מורכב מבחירת הפרמטרים המתאימים ביותר לכל מחקר. במקרה שלנו, הדרך הטובה ביותר הייתה לבסס את הניתוח על תכונות הספיגה והפיזור של הננו-צינורות: המתאם הטוב בין לוקליזציה של כתמים כהים על BF וכתמים בהירים על DF תומך בכך שהשיטה שפותחה רלוונטית ואמינה - וייתכן שלא הייתה אפשרית ללא הדמיית תאים.

3. מגבלות הטכניקה

יש להדגיש כי הדמיה של CNTs בתאים התאפשרה רק מכיוון שהם נוטים להצטבר בשלפוחיות תוך-תאיות אנדוזומליות, ואז להופיע כנקודות ספיגה ופיזור חזקות. אין לזהות ננו-צינוריות בודדות על סמך שיטה זו, בעוד שבסופו של דבר ניתן לזהות אותן בפלואורסצנטיות, מה שמהווה מגבלה ברורה. שנית, הכימות אינו 'מוחלט' אלא יחסי לריכוזי תיוג שונים ובהשוואה לתאי הביקורת הלא מסומנים. חלק מהמאפיינים הכמותיים (פיקסל ממוצע, עוצמה וכו') הם פרמטרים מוחלטים, בעוד שאחרים תלויים בבחירת המסכות (מסכת סף, מסכות לוקליזציה).

4. משמעות ביחס לשיטות הקיימות

בכל הנוגע לפלואורסצנטיות, ניתוח ImageStream מדגיש את הקולוקליזציה הלקויה של אשכולות CNT בין אות בהיר של FITC לכתמים בערוצים האחרים. לכן, נראה כי הקרינה לא הייתה אינדיקטור אמין לכימות ולוקליזציה של CNTs. עם זאת, תוך התגברות על המגבלה של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית, המבוססת בעיקר על כימות פלואורסצנטי, התפוקה הגבוהה המולטי-ספקטרלית של ImageStream סוללת את הדרך לכימות סטטיסטי ללא תוויות , תוך מתן לוקליזציה של ננו-צינורות פחמן בתוך התאים.

5. יישומים עתידיים

ניתן להכליל את שיטת הננומטרולוגיה הסטטיסטית הזו בתפוקה גבוהה לכל ננו-חומרים, המראים ספיגה ופיזור גבוהים של אור בעת אינטראקציה עם תאים. לכן, עשויים להיות לו יישומים חשובים לחקר הננו-ביו-ממשק, ננוטוקסיקולוגיה וננו-רפואה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי ANR P2N (פרויקט Nanother 2010-NANO-008-04), על ידי אזור איל דה פראנס (חוזה מס' E539) ועל ידי CNRS. הגישה הפתוחה שולמה על ידי EMD Millipore.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ImageStreamfigure-materials-1 Amnis

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
  2. De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
  3. Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
  4. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
  5. Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
  6. Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
  7. Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
  8. Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
  9. Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
  10. Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
  11. Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
  12. Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
  13. Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
  14. Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageStream

מאמרים קשורים