במחקר זה, המטרה העיקרית הייתה לנטר את הספיגה התאית ובסופו של דבר אקסוציטוזיס של ננו-צינורות פחמן (CNTs). מנקודת מבט זו, הצענו כאן שיטה ייחודית המשתמשת בציטומטריית זרימה של הדמיה מולטי-ספקטרלית המאפשרת כימות ולוקליזציה של CNTs במספר תאים רלוונטי סטטיסטית.
מאמר שיטה
לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ננו-חומרים מבוססי פחמן, כמו ננו-צינורות פחמן (CNTs), שייכים לסוג זה של ננו-חלקיקים שקשה מאוד להבחין בינם לבין מבני תאים עשירים בפחמן ודה פקטו עדיין אין שיטה כמותית להעריך את תפוצתם ברמת התא והרקמה. מה שאנו מציעים כאן הוא שיטה חדשנית המאפשרת זיהוי וכימות של CNTs בתאים באמצעות ציטומטר זרימת הדמיה מולטי-ספקטרלי (ImageStream, Amnis). מכשיר זה שפותח לאחרונה משלב הן תפוקה גבוהה של תאים והן הדמיה ברזולוציה גבוהה, ובכך מספק תמונות עבור כל תא בזרימה ישירה ולכן ניתוח תמונה רלוונטי מבחינה סטטיסטית. כל תמונת תא נרכשת בערוצים של שדה בהיר (BF), שדה כהה (DF) ופלואורסצנטי, מה שנותן גישה בהתאמה לרמה ולהתפלגות של ספיגת האור, האור המפוזר והפלואורסצנטי עבור כל תא. הניתוח מורכב מהשוואה של פיקסל אחר פיקסל של כל תמונה, של 7,000-10,000 התאים שנרכשו עבור כל תנאי של הניסוי. לוקליזציה וכימות של CNTs מתאפשרים הודות לכמה תכונות מהותיות מסוימות של CNTs: ספיגת אור ופיזור חזקים; אכן CNTs מופיעים ככתמים כהים נספגים חזק ב-BF וכתמים בהירים ב-DF עם קו-לוקליזציה מדויקת.
למתודולוגיה זו יכולה להיות השפעה ניכרת על מחקרים על אינטראקציות בין ננו-חומרים ותאים בהתחשב בכך שפרוטוקול זה ישים עבור מגוון גדול של ננו-חומרים, ככל שהם מסוגלים לספוג (ו/או לפזר) את האור בצורה חזקה מספיק.
מבוא
במהלך העשורים האחרונים, מקומם של ננו-חלקיקים צבר חשיבות במגוון רחב של יישומים. בפרט, ננו-צינורות פחמן (CNTs) נחקרים יותר ויותר כננו-כלים ליישומים אבחנתיים וטיפוליים מגוונים; הודות לתכונות החשמליות, התרמיות והספקטרוסקופיות המיוחדות שלהם, CNTs יכולים לשמש ככלי משלוח לתרופות מגוונות או חומרי ניגוד, או יכולים להיות מעורבים גם בהנדסת רקמות1.
עם זאת, חששות לגבי הרעילות הפוטנציאלית של ננו-חומרים כאלה עדיין נמצאים במחלוקת, בעיקר מכיוון שגורלם של CNTs באורגניזם נותר שנוי במחלוקת מאוד. אכן חסרות שיטות מתאימות לאיתור וכימות שלהם בתאים ורקמות חיים: לדוגמה, הוצעו טכניקות כמו ספקטרוסקופיה של ראמאן, פוטו-אקוסטית והדמיית פוטו-לומינסנציה קרובה לאינפרא אדום, אך כל שיטה מראה מגבלות בהתאם לסוג הננו-צינוריות ו/או סביבתן2-8.
כאן, השיטה המוצעת יכולה להיות ישימה לזיהוי וכימות של ננו-חלקיקים בתאים. זה התאפשר הודות לשימוש ב-ImageStream, מכשיר המשלב גם זרימה ציטומטרית וגם הדמיה ברזולוציה גבוהה. הוא משלב את היתרונות של רכישת תאים גדולים (עד 5000 אירועים לשנייה) - והיתרונות של נתונים סטטיסטיים ותמונות ברזולוציה גבוהה של כל תא בו זמנית (רזולוציה מרחבית של 0.5 מיקרומטר). בדרך כלל, תמונות נאספות באמצעות מצלמת CCD והן ייצוג דו-ממדי בקנה מידה אפור של התא. האור מכומת עבור כל פיקסל בתמונה ומזהה הן את העוצמה והן את המיקום של הקרינה או רכיבים בעלי גודל תת-תאי (ב-BF למשל), מה שמאפשר בכך יכולת רבת עוצמה להבחין בין תאים על סמך המראה שלהם9,10.
המטרה כאן הייתה לתכנן שיטה ננומטרולוגית שתאפשר הערכה כמותית של התפלגות והתנהגות CNTs בתאים. בפרט, שיטה זו פותחה כדי לחקור קליטה תאית, עיבוד ואקסוציטוזיס של CNTs על ידי תאים. הוכחנו תחילה את הסחר התאי המורכב של CNTs ושנית את ההעברה של ננו-חומרים אלה בין תאים: CNTs מופנמים בתאים בורחים מתאי המארח שלהם כאשר הם בלחץ, מתפשטים לחו"ל בחלל החוץ-תאי ומופנמים מחדש על ידי תאים נאיביים, בין אם הם הומוטיפיים או הטרוטיפיים11
.
מחקר קודם הראה כי מנגנונים שונים של קליטת תאים, אקטיביים או פסיביים, יכולים להתרחש בהתאם לתפקוד CNT ומצב צבירה12. כאן ה-CNTs מרובי הקירות פונקדו באמצעות ציקלו-הוספה ואמידציה של 1,3-דו-קוטבי ולאחר מכן נגזרו עם בדיקה פלואורסצנטית, פלואורסצנטית באיזותיוציאנט (FITC). במיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, נראה שהם מופנמים על ידי תאים בנפרד עם לוקליזציה ציטוזולית או כצרורות, הנמצאים בעיקר בתאים אנדוזומיים וליזוזומליים11. ב-ImageStream, ה-CNTs המקובצים מופיעים עם מתאם גבוה ככתמים כהים על BF וכתמים בהירים על DF, מה שמאפשר הבחנה ברורה בין תאים המסומנים ב-CNT לתאי בקרה. מצד שני, התפלגות האות הפלואורסצנטי הנפלט על ידי הסמן הפלואורסצנטי הפונקציונלי עם CNTs לא הייתה כל כך מקומית: ואכן, ככל הנראה עקב תופעת מרווה, הכתמים הפלואורסצנטיים הירוקים אינם תואמים בהכרח את הכתמים ב-BF ו-DF. זה מצביע על כך שראשית, בדיקה פלואורסצנטית אינה חובה לזיהוי CNTs עם ImageStream, ושנית - קל וחומר - שהיא אינה מייצגת באופן מלא הן לכימות והן ללוקליזציה של CNTs.
מעבר לכימות יחסי סטטיסטי של ננו-חלקיקים, שיטה זו מספקת גם מידע הנוגע ללוקליזציה של CNTs בתאים, כלומר היא מבחינה, למשל, CNTs בחלק הפנימי של התא לעומת אלה הקשורים לקרום הפלזמה. היכולת למקם CNTs בתמונות תאים מתגברת בבירור על המגבלה של ניתוח ציטומטריית זרימה קונבנציונאלי13. ההליך פותח כאן באמצעות יצירת מסכות המתאימות לאזורים ספציפיים בתא ובחירת הכתמים הכהים המתאימים ל-CNT טעונים.
באופן כללי, שיטה זו יכולה להיות מיושמת עבור מגוון רחב של ניסויים הכרוכים בצורך בהדמיה, או כמות, בתאים, בתנאי שהננו-חלקיקים המשמשים מסוגלים לספוג חזק (ו/או לפזר) את האור.
פרוטוקול
1. הכנת ננו-צינורות פחמן לפיזור מים (CNTs)
- פזרו את ה-CNT הראשונים במי תרבית תאים, לפני סוניקציה למשך 20 דקות בסוניקטור מי אמבטיה ב-20 מעלות צלזיוס. אם CNTs מתפקדים עם בדיקה פלואורסצנטית, הגן עליהם ככל האפשר מפני אור לאורך כל הניסוי.
2. תיוג תאים עם CNTs
- לגדל תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVEC) (למשל) על צלחות של 25 סמ"ר במדיום DMEM, המכילים 10% סרום בקר עוברי ו-1% סטרפטומיצין פניצילין.
- הכן תמיסות של CNTs בריכוז של 0, 10, 20 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל במדיום שלם ותאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות או ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות (2 מ"ל של תרחיף CNT לצלחת של 25 ס"מ).
3. קיבוע תאים
- הסר את מדיום הדגירה לאחר מכן; שטוף תאים עם PBS, נסה והשהה מחדש תאים במדיום DMEM שלם. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,200 סל"ד.
- החלף את המדיום תחילה ב-paraformaldehyde 4% למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ב-PBS כדי לשמר אותם. במידת הצורך ניתן לאחסן תאים בשלב זה של התהליך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים עד לניתוח הציטומטריה.
- כל דגימה צריכה להכיל כ-106 תאים המרוכזים ב-50 מיקרוליטר של PBS. השעו אותם בצורה נכונה כדי למנוע אגרגטים במהלך הניתוח וסנן אותם דרך מכתים רשת של 50 מיקרומטר.
הערה: יש לבצע כל שלב בעדינות רבה כדי לשמר תאים.
4. רכישת ImageStream
השתמש בציטומטר זרימת ההדמיה הרב-ספקטרלית ImageStream כדי לרכוש תמונות של תאים.
יש לכבד כמה נקודות:
- בחר הגדלה מותאמת (כאן נעשה שימוש במטרה של פי 40).
- אם משתמשים בפלואורוכרום:
- הכן דגימת בקרה ללא פלואורוכרום.
- הכן תאים עם בקרה חיובית בצבע יחיד לכל פלואורוכרום המשמש ב
בנוסף לדוגמאות שלך. - השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לעורר את ה-FITC ובערוץ 02 כדי לאסוף את פליטת הקרינה (פס פס 480-560 ננומטר). בנוסף, השתמש גם בערוצים 01 ו-06 עבור השדה הבהיר (BF) והשדה הכהה (DF) בהתאמה.
5. לאחר עיבוד - תוכנת ניתוח IDEAS (גרסה 4.0)
- מבין כל האירועים שנרכשו, יש להגביל תחילה את הניתוח לאוכלוסיית התאים הבודדים: השתמש בתרשים נקודות דו-פרמטרי המייצג 'יחס גובה-רוחב' (כלומר רוחב/גובה) לעומת 'שטח תא' (פרמטרים המיושמים על תאים ב-BF) (איור 1). תאים בודדים הכלולים באזור העניין עם שטח סטנדרטי ויחס גובה-רוחב קרוב ל-1 מופלים לאחר מכן מאירועים רב-תאיים (שטח גדול ויחס גובה-רוחב קטן) ופסולת (שטח קטן במיוחד).
- כדי לבחור תאים במישור הממוקד, השתמש בתרשים נקודות דו-פרמטרי המותאם לתאים המסומנים ב-CNTs עם ניגודיות גבוהה: התווה את ה'ניגודיות' לעומת 'שיפוע RMS' (המודד את איכות החדות של תמונה) בתמונת BF - זה מאפשר הוצאה של תאים לא ממוקדים המציגים הן שיפוע RMS נמוך והן ניגודיות נמוכה בתמונות ה-BF שלהם (איור 1).
-
- קבע את הפרמטר המספק את ההפרדה הסטטיסטית הטובה ביותר בין תאים מסומנים לתאים ללא תווית באמצעות "מצא את התכונה הטובה ביותר". במחקר שלנו, תכונת אובייקט הפיקסל הממוצע היא הפרמטר המתאים ביותר (איור 2).
- עקוב אחר היסטוגרמה באמצעות פרמטר זה לעומת התדר המנורמל כדי להשוות את כמות ה-CNTs שנקלטו עבור ריכוזים שנבדקו (איור 3).
- עקוב אחר הגרף הדו-פרמטרי 'אובייקט פיקסל ממוצע על BF' (סימון: ממוצע Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) לעומת 'עוצמה על DF' (Intensity_MC_Ch06), על מנת לחקור את המתאם בין שני הפרמטרים הללו (איור 4).
- הכימות מוערך גם באמצעות מסכות:
- מכיוון ש-CNTs מופיעים ככתמים כהים הסופגים בעוצמה על BF, צור תחילה מסיכת סף המתאימה להם במדויק על ידי בחירת טווח מוגבל של פיקסלים בעוצמה נמוכה המורכב בין 0-533 במחקר זה (מסכה 1, סימון: עוצמה (M01, BF, 0-533)) (איור 5). הבחירה בעוצמת הסף נעשית על תאים מסומנים בהשוואה לתאי הבקרה.
- לעומת זאת, צור גם מסכה המתאימה לפיקסלים בעוצמה גבוהה (150-4095 במקרה זה) של ה-DF (מסכה 2, סימון: עוצמה (M06, DF, 150-4095)) (איור 6).
- התוויית גרף באמצעות שטח המסיכה (1 או 2; (סימון: Area_Intensity(M01, BF, 0-533) עבור מסכה 1): זה יספק כימות יחסי של הפנמת CNTs בריכוזים שונים (איור 7).
- בדוק את מידת המתאם בין שתי המסכות הללו (הודות לתרשים הדו-פרמטרי 'שטח מסכה 1' לעומת 'שטח מסכה 2') (איור 7).
- צור מסיכות אחרות כדי למקם CNTs בתאים:
- מסכה המתאימה לחלק הפנימי של התא: Erode(M01, 7) - המקבילה למסכה של התא כולו (M01) (איור 8), שנשחקת עוד יותר מ-7 פיקסלים (איור 9).
- מסכה המתאימה לממברנה רק באמצעות המשוואה הבוליאנית: M01 ולא Erode (M01,7) - מסכה של התא כולו (M01) מופחתת מהפנים (Erode(M01,7)) (איור 10).
- כדי לקחת בחשבון את הפיקסלים הכהים על הממברנה (המתאימים ל-CNTs), צור אז את המסכה: עוצמה(M01 ולא Erode(M01, 7), BF, 0-533) (איור 11).
- דמיין את המסיכות השונות המוחלות על אוסף תאים כדי לבדוק את הרלוונטיות שלהן (איור 12) עבור תאים מסומנים וללא תווית.
- החל את אזור התכונה על המסכה ובחר את הפיקסלים השחורים על הממברנה 'Area_עוצמה(M01 ולא Erode(M01, 7), BF, 0-533)' מה שנקרא אזור שחור. זה יאפשר לכמת את ה-CNTs על הממברנה.
כדי להבחין סופית בין CNTs שהופנמו מאלה שנספחו רק על הממברנה, שרטטו את האזור השחור על הממברנה לעומת האזור השחור על התא כולו (כלומר 'עוצמת Area_ (M01 ולא שחיקה (M01, 7), BF, 0-533' לעומת 'עוצמת Area_ (M01, BF, 0-533)').
הערה: אותו סוג של נוהל מיושם עם האות הפלואורסצנטי FITC: השווה את העלייה בעוצמת הקרינה של FITC לעומת ירידת אות הפיקסלים הממוצע ב-BF, או את הקו-לוקליזציה בין כתמים כהים בעוצמת הקרינה BF ו-FITC. במקרה שלנו, סוג זה של ניתוח אינו רלוונטי מכיוון שאות הקרינה אינו תואם נכון לכתמים כהים ב-BF מצד אחד ולשדה בהיר ב-DF מצד שני, מה שמראה שתכונות מהותיות של CNTs (ספיגת אור ופיזור) מתאימות יותר מהאות הקשור לבדיקה הקרינה.
- לאחר יצירת כל העלילות בתנאי ניסיוני אחד, צור "תבנית דוח סטטיסטי", שמור את התבנית כקובץ .ast ואצווה את כל קבצי הנתונים.
תוצאות
סקירה כללית של עקרון הפעולה של מכשיר ה-ImageStream מוצגת באיור 1. המכשיר מייצר מספר תמונות ברזולוציה גבוהה של כל תא בזרימה, כולל שדה בהיר (BF), שדה כהה (DF או אור מפוזר הצידה), וערוץ או ערוצים של פלואורסצנציה, כפי שמוצג באיור 2 עם שלושה תאים שונים המסומנים ב-CNTs. מוצגות גם תמונות חפיפה (overlays) של ערוצים אלו, הממחישות במבט ראשון את המתאם.
היות שכל ניתוח העיבוד הבא (post-processing) מבוסס על דימות תאים, בחירת תאים ממוקדים היא קריטית למחקר (איור 3). למעשה, נוכחותם של CNTs גורמת לשינויים הן בניגודיות והן במדרג (gradient) בהשוואה לתאים שאינם מסומנים: תאים ממוקדים, אשר הפנימו כמות משמעותית של CNTs, נוטים להציג מדרג rms נמוך (שהוא בדרך כלל הפרמטר היחיד המשמש להבחנה של תאים ממוקדים מול תאים שאינם ממוקדים) אך גם ניגוד חשוב, המסביר מדוע תרשים דו-פרמטרי הוא חיוני. ב- איור 3 מוצגת ההבחנה בין אזור לא ממוקד (שטח צהוב) מול תאים ממוקדים (אזור כחול).
CNTs שהפנימו לתוך התאים ניתנים להבחנה בבירור - במיוחד בתצפית BF שבה הם מופיעים כנקודות כהות בעלות בליעה חזקה (ראו את השפעת ריכוזי סימון שונים, איור 4). יתרה מכך, נותח אות הפיקסל הממוצע ב-BF, מה שסיפק כימות יחסי של הקליטה: הגרפים באיור 5 מראים עלייה משמעותית שלו עם ריכוז הסימון של ה-CNTs (תוצאות עבור כ-7,000 תאים לכל תנאי ניסויי).
שנית, כימות של CNTs אפשרי גם באמצעות שימוש במסכות, המוחלות או על טווח מוגבל של פיקסלים כהים ב-BF או על פיקסלים בעוצמה גבוהה ב-DF (ראו דוגמאות ב-איור 6), המתאימים לנקודות הנובעות מנוכחותם של CNTs. לפיכך, שרטוט של שטח מסכות אלו מאפשר להדגיש, כמו גם להראות את העלייה בספיגה (מודגם ב-איור 7 עם שטח המסכה ב-BF, בבחירת פיקסלים בטווח של 0-533).
בנוסף, ניתן להעריך את המתאם בין הנקודות ב-BF וב-DF על ידי שרטוט עצימות ה-DF מול אות הפיקסלים הממוצע של ה-BF (כפי שמוצג ב-איור 8) (ניתוח שאינו תלוי במסכה) או שטח המסכה ב-BF (מסכה 1) מול השטח ב-DF (מסכה 2).
בנוגע לנוהל שנוצר לצורך לוקליזציה של CNTs בתוך התאים, איור 9A מציג את המסכות השונות שנוצרו. יש לשים לב כי יש לבדוק ויזואלית את היציבות של מסכות הלוקליזציה (המבוססות על שחיקה של מסכת התא כברירת מחדל) על אוסף של תאים מסומנים ותאים שאינם מסומנים. אותן מסכות משמשות עבור כל הדגימות.
שרטוט השטח הכולל של הכתמים השחורים על ממברנת התא לעומת השטח על התא כולו מספק מדד להפנמה (internalization) עבור תאים שדגרו במשך 20 hr ב-37 °C בהשוואה לדגירה של 2 hr ב-4 °C (ראה איור 9B); נתון זה מעיד כי ב-4 °C ה-CNTs ממוקמים בעיקר על הממברנה, בעוד שב-37 °C ה-CNTs מופנמים ביותר מ-90% מהתאים.
לבסוף, בנוגע לפלואורסצנציה, פרמטר זה לא שימש כאינדיקטור לכימות של CNTs בשל מתאם נמוך מדי בין הנקודות הפלואורסצנטיות לנקודות ב-BF (וב-DF). למעשה, המתאם בין עוצמת ה-FITC לבין ממוצע הפיקסלים בשדה בהיר מעיד על מקדם מתאם פירסון של -0.2. באיור 10 מוצגים שני מקרים שבהם אות הפלואורסצנציה תואם כראוי או לא תואם לנקודה השחורה בשדה בהיר.
איור 1. סקירה כללית של פעולת ה-ImageStream.מערכת הדימות הרב-ספקטרלית רוכשת עד 12 תמונות לתא בשלושה מצבים שונים: שדה בהיר (brightfield), שדה חשוך (darkfield) ופלואורסצנציה. המערך מורכב מ-5 לייזרי עירור, הכוללים 405, 488, 560 ו-658 nm. האור נאסף מהתאים הזורמים בקוובט באמצעות עדשות אובייקטיב שונות (במחקר זה, נעשה שימוש בעדשת אובייקטיב 40X) ומועבר לאלמנט הפירוק הספקטרלי, המורכב מקבוצה של מסנני longpass במערך זוויתי. מצלמת ה-CCD האוספת את תמונות התאים מופעלת באמצעות טכניקה הנקראת time-delay-integration כדי למנוע מריחה של התמונה. קיימת אפשרות לעומק שדה מורחב (EDF).
איור 2. גלריית תמונות של תאים המסומנים בננו-צינוריות פחמן (50 μg/mL) שצולמו ב-ImageStream דרך ערוצים שונים (שדה בהיר (BF), שדה כהה (DF), פלואורסצנציה (FITC), והחפפות ביניהם). CNTs המצויים בתוך ליזוזומים תוך-תאיים נראים כנקודות שחורות גדולות בתמונות בשדה בהיר. לעומת זאת, הם יוצרים נקודות בהירות בתמונות בשדה כהה ובתמונות פלואורסצנטיות.
איור 3. בחירת תאים במבט ממוקד. תרשים נקודות דו-משתני המייצג את ה-root mean square (rms) gradient לעומת ניגודיות (contrast) בתמונות BF מאפשר את הדרת תאים שאינם במבט ממוקד. כאן, האזור הצהוב מייצג תאים שאינם ממוקדים, בעוד שתאים ממוקדים מיוצגים בכחול. תאים שאינם ממוקדים מאופיינים הן בניגודיות נמוכה והן ב-gradient rms נמוך בתמונת השדה המואר. בנוסף ל-rms gradient, נדרש מאפיין הניגודיות כדי להבדיל בין תאים ממוקדים לאחר סימונם ב-CNTs.
איור 4. ספיגה תלוית-מינון של CNTs כפי שנוצפת ב-ImageStream. מספרן ושטחן של הנקודות השחורות בתמונות השדה המואר עולים עם מינון ה-CNTs במהלך דגירה עם תאים (בטווח של 0-50 µg/ml). שימו לב כי תאי הביקורת נקיים מנקודות שחורות.
איור 5. כימות יחסי של ספיגת CNT בהתבסס על תמונות שדה בהיר. היסטוגרמות של מאפיין הפיקסלים הממוצע שיושם על המסכה "object" המייצגת את התא כולו מראות בבירור התנהגות תלויית-מנה, שניתן להשתמש בה לצורך כימות. טווח R9 כולל את התאים החיוביים ל-CNT.
איור 6. יצירת מסכות לבחירת נקודות שחורות בתמונות BF ונקודות בהירות בתמונות DF. מכיוון ש-CNTs מופיעים כנקודות כהות בעלות בליעה חזקה בתמונת BF, נוצרה מסכת סף כדי לבחור טווח מוגבל של פיקסלים בעלת עוצמה נמוכה שבין 0-533 במחקר זה (Mask 1, סימון: Intensity(M01, BF, 0-533)). לעומת זאת, מסכה התואמת לפיקסלים בעלי עוצמה גבוהה (150-4095 במקרה זה) בתמונת DF (Mask 2, סימון: Intensity (M06, DF, 150-4095)) משמשת לבחירת נקודות בהירות ב-DF, המתאימות לאזורי פיזור גבוהים.
איור 7. ספיגה תלוית-מינון של CNTs מודגמת על ידי כימות שטח הנקודות השחורות בתמונות BF. באמצעות מסכת סף (mask 1) שהוחלה על ה-BF, ניתן לכמת את שטח הנקודות השחורות עבור כל תא, מה שמראה התפלגות תלוית-מינון.
איור 8. שיטות כימות של CNT המבוססות על תמונות BF (בליעה) ו-DF (פיזור) נמצאות במתאם. משמאל, ערך פיקסל ממוצע בתמונת ה-BF לעומת עוצמה בתמונת ה-DF, מראה מתאם טוב עבור תאים המסומנים ב-CNTs (50 µg/ml(מקדם מתאם פירסון r = -0.68). מימין, שטח המסכה המתאימה לכתמים כהים ב-BF לעומת שטח המסכה להתאמת נקודות בהירות ב-DF לתאים המסומנים ב-CNTs (50 µg/ml). מקדם המתאם של פירסון הוא r = -0.83. מוצגים ערכים מ-7,000 תאים.
איור 9. לוקליזציה של CNTs בתאים באמצעות מסכות ספציפיות. (A) מסכות נוצרו כדי להתאים למיקום מסוים בתא, דהיינו משמאל לימין - התא כולו, הממברנה בלבד, ופנים התא. מסכה נוספת מתאימה לנקודות שחורות הודות לסף עוצמה (מסכה 1, סימון: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) ניתן להעריך את הלוקליזציה של CNTs על ידי מדידת שטח הנקודות השחורות בלוקליזציות שונות של התאים תוך שימוש במסכות הלוקליזציה המתוארות ב-A. אינקובציה עם CNTs (בריכוז 50 µg/ml) בוצעה הן ב-37 °C והן ב-4 °C כדי לעכב את נתיב ההפנמה (internalization). הגרף המייצג את השטח השחור על הממברנה לעומת השטח השחור בכל התא מראה ספיגה תלוית-מינון של CNTs על הממברנה ב-4 °C, בעוד שהפנמה מלאה של CNTs אפקטיבית ב-37 °C.
איור 10. קולוקליזציה של נקודות שחורות המושרות על ידי CNT ב-BF עם נקודות בהירות פלואורסצנטיות בתמונת FITC. הנקודות הבהירות הפלואורסצנטיות אינן תמיד נמצאות בקולוקליזציה עם הנקודות השחורות ב-BF. הן תואמות כראוי עבור שני התאים הראשונים המוצגים, אך לא עבור שני התאים האחרונים.
דיון
1. שינוי ופתרון בעיות
במחקר זה, המטרה הראשונה הייתה להעריך את הכמות והלוקליזציה של CNTs בתאים. המיקרוסקופיה הקונפוקלית יכולה הייתה להיות אפריורי שיטת הזהב להערכת ההתפלגות התוך-תאית של CNTs המתפקדים עם הסמן הפלואורסצנטי FITC8,14. עם זאת, החיסרון העיקרי הוא המגבלה להדמיה של תא בודד ולכן היעדר נתונים רלוונטיים מבחינה סטטיסטית. ה-ImageStream מאפשר עבודה מעבר למכשולים הללו: ואכן, על ידי סינון מספר רב של תאים (5,000-10,000) בזמן קצר (<דקות), הוא מניב תוצאות חזקות סטטיסטית, המשופרות גם על ידי הדמיה ברזולוציה גבוהה המספקת תמונות לכל תא ברזולוציה תת-תאית (0.5 מיקרומטר). לאחר מכן זה מאפשר לנתח כמות גדולה של נתונים על סמך ניתוח תמונה בודדת.
בהשוואה לציטומטריית זרימה קונבנציונלית, היתרון הייחודי של ImageStream הוא לספק תמונות מולטי-ספקטרליות של כל תא והשוואה של פיקסל אחר פיקסל של עוצמת האות. לפיכך, ImageStream משלב את הכוח הסטטיסטי של ציטומטריית זרימה בתפוקה גבוהה עם היתרונות האנליטיים של הדמיה קונפוקלית עבור כל תא מנותח. זה חיוני לכימות יחסי ללא תווית ולוקליזציה של CNTs בתאים.
2. שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
השלב הקריטי מורכב מבחירת הפרמטרים המתאימים ביותר לכל מחקר. במקרה שלנו, הדרך הטובה ביותר הייתה לבסס את הניתוח על תכונות הספיגה והפיזור של הננו-צינורות: המתאם הטוב בין לוקליזציה של כתמים כהים על BF וכתמים בהירים על DF תומך בכך שהשיטה שפותחה רלוונטית ואמינה - וייתכן שלא הייתה אפשרית ללא הדמיית תאים.
3. מגבלות הטכניקה
יש להדגיש כי הדמיה של CNTs בתאים התאפשרה רק מכיוון שהם נוטים להצטבר בשלפוחיות תוך-תאיות אנדוזומליות, ואז להופיע כנקודות ספיגה ופיזור חזקות. אין לזהות ננו-צינוריות בודדות על סמך שיטה זו, בעוד שבסופו של דבר ניתן לזהות אותן בפלואורסצנטיות, מה שמהווה מגבלה ברורה. שנית, הכימות אינו 'מוחלט' אלא יחסי לריכוזי תיוג שונים ובהשוואה לתאי הביקורת הלא מסומנים. חלק מהמאפיינים הכמותיים (פיקסל ממוצע, עוצמה וכו') הם פרמטרים מוחלטים, בעוד שאחרים תלויים בבחירת המסכות (מסכת סף, מסכות לוקליזציה).
4. משמעות ביחס לשיטות הקיימות
בכל הנוגע לפלואורסצנטיות, ניתוח ImageStream מדגיש את הקולוקליזציה הלקויה של אשכולות CNT בין אות בהיר של FITC לכתמים בערוצים האחרים. לכן, נראה כי הקרינה לא הייתה אינדיקטור אמין לכימות ולוקליזציה של CNTs. עם זאת, תוך התגברות על המגבלה של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית, המבוססת בעיקר על כימות פלואורסצנטי, התפוקה הגבוהה המולטי-ספקטרלית של ImageStream סוללת את הדרך לכימות סטטיסטי ללא תוויות , תוך מתן לוקליזציה של ננו-צינורות פחמן בתוך התאים.
5. יישומים עתידיים
ניתן להכליל את שיטת הננומטרולוגיה הסטטיסטית הזו בתפוקה גבוהה לכל ננו-חומרים, המראים ספיגה ופיזור גבוהים של אור בעת אינטראקציה עם תאים. לכן, עשויים להיות לו יישומים חשובים לחקר הננו-ביו-ממשק, ננוטוקסיקולוגיה וננו-רפואה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי ANR P2N (פרויקט Nanother 2010-NANO-008-04), על ידי אזור איל דה פראנס (חוזה מס' E539) ועל ידי CNRS. הגישה הפתוחה שולמה על ידי EMD Millipore.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ImageStream |  Amnis |
מקורות
- Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
- De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
- Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
- Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
- Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
- Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
- Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
- Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
- Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
- Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
- Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
- Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).
הדפסות חוזרות והרשאות
