מאמר שיטה

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

DOI:

10.3791/50586

⸱

10 ביולי 2013

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמצים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנויטרופילים הם תאי מפעיל קריטיים של מערכת החיסון המולדת. הם גויסו במהירות באתרים של דלקת חריפה והשפעות המגנות או פתוגניים בהתאם לסביבה הדלקתית. יחד עם זאת, על אף התפקיד החיוני של נויטרופילים בחסינות, הבנה מפורטת של הגורמים המולקולריים המתווכים השפעות מפעיל וimmunopathogenic 'נויטרופילים במחלות זיהומיות שונות ומצבים דלקתיים עדיין חסר, גם בגלל זמן מחצית החיים הקצר שלהם, את הקשיים בטיפול באלה תאים והעדר פרוטוקולי ניסוי אמינים להשגת כמות מספקת של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם וניסויים העברת מאמצת. לכן, שיטות פשוטות, מהירות, חסכונית ואמינות הן רצויות מאוד לקציר בכמות מספקת של נויטרופילים עכבר להערכת פונקציות כגון phagocytosis, הרג, ציטוקינים ייצור, degranulation וסחר בנשים. לשם כך,אנו מציגים פרוטוקול לשעתק צפיפות שיפוע מבוסס צנטריפוגה, אשר יכולה להיות מותאם בכל מעבדה לבודד מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר וכדאיות גבוהים. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט שמשתמש בצבעי CellTracker לתייג את נויטרופילים הבודדים, אשר לאחר מכן ניתן להעביר adoptively לעכברים נמען ולעקוב אחריו בכמה רקמות להעברה לאחר לפחות 4 שעות באמצעות cytometry זרימה. שימוש בגישה זו, תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברי wild-type והגן לקויים עם צבעי CellTracker שונים יכול להיות מועסק בהצלחה לבצע מחקרי Repopulation תחרותיים להערכת התפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם אל רקמות יעד in vivo .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנויטרופילים הם לויקוציטים הנפוץ ביותר בבני אדם. הם המרכיב התאי העיקרי של מערכת החיסון המולדת ולפעול כקו הגנה ראשון נגד הפולשים מיקרואורגניזמים. חולים עם נויטרופניה רכשה וimmunodeficiencies העיקרי המשפיעים על מספרים ו / או פונקצית נויטרופילים לפתח זיהומים, המדגישים את החשיבות של תאים אלה בשורת 1 הגנת חיידקים ופטריות פולשניות מסכנות חיים. הכרה חיסונית של פלישת פתוגנים באתר הזיהום על ידי תוצאות זיהוי ההכרה הקולטנים מאותו המקור שלהם באינדוקציה של תגובה חיסונית מולדת מתוזמרת, מה שמוביל להפרשת chemoattractants שיוצרים שיפוע chemotactic מסוגלים נויטרופילים גיוס ממחזור הדם לתוך הרקמה הדלקתית 2 . לאחר נויטרופילים להיכנס לאתר הזיהום, הם הופכים להיות פעילים, מה שמוביל לציטוקינים וchemokine ייצור, ספיגת הפתוגן, והרג דרכי חמצוני והלא חמצוניchanisms 3. חוץ מזה התפקיד שלהם המוכר היטב בחסינות מולדת, נויטרופילים יש גם הוכחו לאחרונה לתפקיד חשוב כיוזמי תגובות חיסוניות אדפטיבית יעילות 4. מצד השני, מלבד התפקידים המגן שלהם בחסינות, נויטרופילים עשויים גם לתווך פגיעה ברקמות וimmunopathology בשל צבירה ו / או הפעלה באתרים של דלקת מוגזמת, כפי שמוצגים במגוון רחב של מחלות זיהומיות ומחלות אוטואימוניות 5-7.

למרות התפקיד החיוני של נויטרופילים בתגובות חיסוניות מולדות הרכבה יעילות ופונקציות מפעיל pleiotropic בכמה מחלות זיהומיות ומצבים דלקתיים, בעיות טכניות בטיפול בתאים אלה וחוסר פרוטוקולי ניסוי אמינים עכב מחקר עם נויטרופילים בעשורים האחרונים. לכן, שימוש במבחנים לשעתק לבידוד של נויטרופילים צריכים להקל על מחקר נוסף על immunolo נויטרופילים בתיווךvivo gical הפונקציות לשעבר וin vivo. נכון להיום, מספר שיטות שתוארו לבידוד של נויטרופילים כגון צנטריפוגה צפיפות שיפוע של דם אדם ודם עכבר או מח עצם 8,9, העשרת immunomagnetic חיובית או שלילית של נויטרופילים מדם עכבר או מח עצם 10,11, וקציר של נויטרופילים מחלל הצפק של עכברים לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate או סוכנים דלקתיים אחרים 12. למרות שיכולים להיות מבודד בקלות נויטרופילים במספרים גדולים מדם אנושי, שיטה זו היא הכי מוצלח בעכברים, בשל הכמות המוגבלת של דם עכבר שמונע בידוד של נויטרופילים מספיקים ללימודים תפקודיים או ניסויי העברת מאמצת 13. בנוסף, למרות שהתשואה של thioglycollate-הושרה התאים מחלל הצפק הוא גדולים יותר בהשוואה לזה של דם עכברים, טוהר של נויטרופילים בשטיפת הצפק הדלקתי משתנה בין60-90%, ונויטרופילים המבודדים תערוכת פנוטיפ הופעל. לכן, התאים שנאספו בשיטה זו ניתן להשתמש רק לביצוע מחקרים תפקודיים של הופעל אך לא של נויטרופילים unstimulated, כחלל הצפק העכבר יש כמה נויטרופילים במצב היציב 12. במקום זאת, מח העצם הוא מאגר נוח לקצירת מספרים גדולים של שני unstimulated או הופעלו נויטרופילים 11,14, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בם ללימודי המשך, פונקציונליים, כגון phagocytosis, הרג וdegranulation, או להעברת מאמצת לעכברים נמען.

בזאת אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (~ 2 שעות), המספק תשואה גבוהה (6-12 ~ 10 × 6 נויטרופילים / עכבר נגוע, או עד 30-40 × 10 6 נויטרופילים / עכבר נגוע) של (80 טהורים -95%) נויטרופילים עם> כדאיות 95% ממח העצם. שיטה זו משתמשת Histopaque זמין באופן מסחרי, שהם נפרדים תא שיפוע צפיפותתקשורת מזון בהיקף של Ficoll וdiatrizoate נתרן, כדי להפריד בין נויטרופילים ממח העצם של עכברים. שיטה זו מניבה מספרים גדולים יותר באופן משמעותי של נויטרופילים לכל עכבר בהשוואה לדם או חלל הצפק, זה יכול לשמש כדי לאסוף נויטרופילים מעכברים הן במצב יציב או לאחר הדבקה, וזה קל יותר לשכבה בהשוואה לשיטת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות המשתמשת רציף הדרגתיים Percoll בהיקף של 55% / 65% / 75% בPercoll PBS 9. בנוסף, הזמן והמשאבים הנדרשים לאיסוף נויטרופילים טהורים הם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לבידוד נויטרופילים באמצעות מיון תא הקרינה המופעל. כמו כן, מכיוון ששיטה זו אינה כרוכה בצעד העשרת immunomagnetic, זה יותר יעיל וחסכוני, וזה ימנע את החשיפה של תאים לעמודה ונוגדנים מגנטיים, וכך להקטין את הסבירות להפעלת נויטרופילים.

בנוסף לביצוע מחקרים תפקודיים של neutroph המבודדILS לשעבר vivo והעברת מאמצת של תאים לעכברים נמען, פרוטוקול זה גם מתאר שיטה לתיוג של נויטרופילים המבודדים באמצעות צבעי CellTracker שונים. תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברים של רקע גנטי שונים יכול להיות מותאם במחקרי Repopulation התחרותיים למעקב אחר נויטרופילים שהועברו ברקמות של עכברי נמען באמצעות cytometry זרימה, אשר יכול לספק תובנה מכניסטית בתפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם ליעד איברים מודלקים 6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד של תאים במח עצם עכבר

  1. להרדים עכברים תוך שימוש בפרוטוקול הטיפול בבעלי החיים של המוסד אישרה ועדה ולרסס את פני השטח החיה עם 70% אתנול.
  2. עושה חתך בעור באמצע הבטן, ולהסיר את העור מחלק הדיסטלי של העכבר כולל העור המכסה את הגפיים התחתונים.
  3. חותכים את השרירים מהגפיים התחתונים באמצעות מספריים ולנקוע זהירות מרחשת ממפרק הירך, תוך הימנעות מלשבור את ראש עצם הירך.
  4. הסר את השרירים שנותרו מעצם הירך ועצם השוק באמצעות אזמל ומספריים ולהפריד את עצם הירך מעצם השוק בטיפול בפעילות גופנית מפרק הברך לא לשבור את קצות העצם. מניחים את העצמות בצלחת פטרי המכילה RPMI קר כקרח 1640 1X בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
  5. להמשיך לשלבים הבאים מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה. לנקוט אמצעי זהירות נוסף כדי לשמור על טכניקות סטריליות מחמירות כדי להימנע מneutrophiהפעלת ליטר.
  6. יש לשטוף את כל עצמות עם אתנול 70% (בתוך צלחת פטרי) ואחרי שלושה שוטף הבאים בPBS סטרילי קר כקרח (בתוך צלחות פטרי) כדי לשטוף את אתנול מפני השטח של העצמות.
  7. בתוך צלחת פטרי סטרילית נקיות, לחתוך את אפיפיזות של העצמות ולשמור אותם בצד.
  8. שימוש במחט 25 מד ומזרק 12 סמ"ק מלאים RPMI השלים עם FBS 10% ו2 מ"מ EDTA, ולשטוף את תאי מח העצם משני הקצוות של פירי העצם על שפופרת 50 מיליליטר בורג עליון פלקון מצוידת עם 100 מיקרומטר לסנן. כדי להסיר ביעילות את כל התאים, לגרד את פני השטח הפנימיים של העצמות באמצעות מחט 25 מד.

הערה: חליטה של ​​עצמות מצביעה על כך שהתאים כבר גרד מספיק.

הערה: השתמש כ 10 מ"ל של תקשורת כדי לשטוף זוג שוקה ירך /. הוספת EDTA למדיום היא חיונית כדי למנוע יצירת גושים של התאים.

  1. חותכים את עצם אפיפיזותב 3 חתיכות קטנות 0.5-1 מ"מ עם אזמל ולנפץ אותם דרך מסנן 100 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של 2.5 מ"ל אפנדורף Combitip פלוס קצה פיפטה Biopur.
  2. צנטריפוגה ב -1,400 סל"ד במשך 7 דקות ב 4 ° C.
  3. Lyse את כדוריות הדם האדומים על ידי resuspending התא גלולה ב 20 מ"ל של 0.2% NaCl לכ 20 שניות אחריו תוספת של 20 מ"ל של 1.6% NaCl. (קריטי: לא יעלה על 20-30 שניות של תמוגה hypotonic כדי למנוע מוות של תאי מוח עצם השימוש בhypotonic NaCl לתמוגה מומלץ על חיץ lysing ACK משום שהאחרון יש הפוטנציאל להפעיל את נויטרופילים.).
  4. צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 1400 סל"ד ב 4 ° C כדי לאסוף את התאים.
  5. שטוף תאים עם RPMI 1X 1640 בתוספת 10% FBS ו 2 מ"מ EDTA וצנטריפוגות כמו בשלב 1.12.
  6. התשואה של תאים במח עצם בשיטה זו היא כ 60-80,000,000 לC57BL בן שבוע 8-12 נגוע / 6 עכבר.

2. הפרדה של נויטרופיליםעל ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות

  1. ספירת תאי מח העצם וresuspend ב 1 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח.
  2. הוסף 3 מ"ל של Histopaque 1119 (צפיפות, 1.119 גרם / מ"ל) בצינור חרוטי 15 מ"ל.
  3. שכבת 3 מ"ל של Histopaque 1077 (צפיפות, 1.077 גרם / מ"ל) ב 3 מ"ל של Histopaque 1119.

הערה: Histopaque 1119 וHistopaque 1077 יש לחמם ל18-26 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

שלב קריטי: הכן הדרגתיים מייד לפני שימוש כהכנת השיפוע מראש יגרום לדיפוזיה בין שתי השכבות וטוהר נויטרופילים הכי מוצלח והתאוששות.

שלב קריטי: כיסה Histopaque 1077 על 1119 שצריכים להיעשות באיטיות על מנת להימנע מערבוב שתי הצפיפויות, אשר ימנעו הפרדת תא במהלך צנטריפוגה.

  1. כיסוי ההשעיה תא מוח העצם על גבי Histopaque 1077.

שלב קריטי: Overlaying ההשעיה תא מוח העצם מעל 1077 הצרכים Histopaque להיעשות באיטיות על מנת למנוע הפרעה לממשק בין התאים וHistopaque 1077.

הערה: resuspending תאי מח עצם מעכבר נגוע ב1 מ"ל של PBS מניב טוהר של נויטרופילים> 90%. עם זאת, איגום דגימות מח עצם רבים פוגע בטוהר נויטרופילים, למשל, resuspending 300 x 10 6 תאים ב3 מ"ל PBS מפחית טוהר נויטרופילים מ> 90% ל ~ 80%. לכן, חוקרים צריכים לבצע ניסויי פיילוט על מנת לזהות את התנאים לספור / נפח התא האידיאלי עבור הניסויים הספציפיים שלהם

  1. צנטריפוגות במשך 30 דקות ב -2,000 סל"ד של 25 מעלות צלזיוס, ללא בלם.

הערה: צנטריפוגה של הצבע בטמפרטורת חדר היא קריטית וחיונית להפרדה יעילה של נויטרופילים.

  1. לאסוף את הנויטרופילים בממשק של 1119 Histopaque וHistopaque 1077 שכבות.

  2. שטוף את הנויטרופילים נאספו פעמיים עם RPMI 1640 1X בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ו צנטריפוגות ב -1,400 סל"ד במשך 7 דקות ב 4 ° C.
  3. לספור את הנויטרופילים ולקבוע הכדאיות שלהם.

הערה: נויטרופילים הם בדרך כלל> 95% קיימא ו> 90% טהורים, כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS. התשואה הטיפוסית של נויטרופילים ממח העצם (עצם ירך 2 כלומר 2 ועצמות שוקה) של C57BL בן שבוע 8-12 נגוע / 6 תאי עכבר היא ~ 6-12,000,000. מספר זה הוא באופן משמעותי יותר כאשר נויטרופילים נקצרים ממח עצם של בעלי חיים נגועים. לפיכך, ~ מיליון נויטרופילים / עכבר 30-40 התגלו כאשר עכברים נגועים בקנדידה שמשו לקצירת תא 6.

3. תיוג של נויטרופילים באמצעות צבעי CellTracker

  1. Resuspend את הנויטרופילים ב5 x 10 6 תאים / מ"ל PBS prewarmed על 37 ° C.
  2. הוסף צבע CellTracker בconcent סופימנה של 5 מיקרומטר.

הערה: CellTracker גרין (CMFDA (diacetate 5 Chloromethylfluorescein) וCellTracker אורנג' (CMTMR (5 - (ו- 6)-4-Chloromethyl Tetramethylrhodamine אמין בנזואיל) היה בשימוש בפרוטוקול זה כדי לתייג נויטרופילים באופן דיפרנציאלי מהסוג פרוע וגן לקוי עכברים.

הערה: הכן פתרון המניות של 10 מ"מ של גרין CellTracker וCellTracker אורנג', aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד היום של הניסוי.

  1. דגירה נויטרופילים עם 5 מיקרומטר של צבע CellTracker המקביל למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועדים בחושך.
  2. שטוף פעמיים עם תאי RPMI 1X 1640 קר כקרח בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.

הערה: כביסה יעילה של התאים לאחר צעד התיוג עם צבע CellTracker הוא חיוני, כדי למנוע זיהום צולב צבע לפני ערבוב אוכלוסיות נויטרופילים דיפרנציאלי שכותרת לירידותמחקרי Repopulation תחרותיים tream.

4. העברת מאמצת של נויטרופילים בעכברים ובניתוח של נויטרופילים המועברים באמצעות cytometry זרימה

  1. נויטרופילים Resuspend ב קר כקרח PBS בריכוז של 25 x 10 6 תאים / מ"ל ולהזריק 200 μl של ההשעיה לוריד הזנב לרוחב כך ש5 x 10 6 נויטרופילים מועברים לכל עכבר. ללימודי נויטרופילים Repopulation תחרותיים, לערבב נויטרופילים wild-type והגן לקויים בביחס 1:1 ולהזריק כולל של 5 x 10 6 נויטרופילים לכל עכבר כאמור לעיל.

הערה: לפחות עד 10 x 10 6 נויטרופילים ניתן להעביר adoptively לכל עכבר ללא רעילות מיידית ברורה לבעלי החיים.

  1. בזמנים שונים לאחר העברת מאמצת (למשל 1, 2, 3 או 4 שעות שלאחר העברה), להרדים עכברים ודם קציר, ו / או מח עצם ו / או איבר המטרה אחר (ים) של עניין.
  2. הכן את siהשעיות ngle סלולריים מרקמות אלה לניתוח כמותי ואיכותי של נויטרופילים הועברו adoptively כותרתו תוך שימוש בפרוטוקולים שפורסמו 6,15.
  3. בעקבות צביעה חי / מת כדאיות וסגר FC, תאי תווית עם CD45 (שיבוט 30-F11), Ly6G (שיבוט 1A8) וCD11b (שיבוט M1/70) ושער בשידור החי בCD45 + + Ly6G CD11b + נויטרופילים. נויטרופילים בשער זה כוללים נויטרופילים ילידים של עכבר הנמען, כמו גם את נויטרופילים שהכותרת הועבר adoptively, שהם + FITC (אם מסומן עם CellTracker הירוק) או PE + (אם תווית עם מעקב הסלולרי אורנג').

הערה: נויטרופילים עשויים להיות במעקב בדם, מח עצם וכליה של עכברים נגועים בקנדידה להעברה לאחר לפחות 4 שעות.

הערה: קיבוע עם paraformaldehyde 2% ב-PBS אינו משפיע על עוצמת הקרינה הממוצעת של נויטרופילים שכותרתו עם Gr CellTracker רעהeen או CellTracker אורנג' לפחות 48 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא מותאם לקציר של תאים במח עצם מעכברים וההפרדה הבאה של נויטרופילים מתאי אלה על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות באמצעות מדיה הפרדת תא Histopaque זמינה מסחרי. נויטרופילים מבודדים באמצעות שיטה זו יכולה לשמש למגוון רחב של מחקרי vivo לשעבר התפקודי במורד הזרם ולניסויים בהעברת מאמצת עכברי נמען.

התשואה אופיינית לאוסף של תאים במח עצם משני עצמות ירך ועצם שוק לכל עכבר 8-12 C57BL / 6 בן שבוע נגוע היא ~ 60-8...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזאת אנו מציגים פרוטוקול אמין, פשוט, מהיר וחסכוני לבידוד של מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר גבוה וכדאיות באמצעות גישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות. כאשר פרוטוקול זה מתבצע בצורה נכונה, יכולים להיות התאוששו ~ 6-12 × 10 6 נויטרופילים מעכבר נגוע ורבים כמו 30-40 ~ × 10 6 נויטרופילים עשויים להיות מבודדים מעכבר לאחר זיהום 6. את נויטרופילים הבודדים הם 80-95% טהורים ו> 95% בת קיימא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר העירוני של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID), המכון הלאומי לבריאות (NIH) בארה"ב.

כל העכברים נשמרו על האגודה אמריקנית להסמכה של מתקן בעלי החיים טיפול בבעלי חיים מוכר מעבדה במכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) ושוכנו בבהתאם לנהלים המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה תחת חסותו של פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש של NIAID.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
 <ריאגנטים חזקים>
RPMI 1640 1X עם L-גלוטמין ו-25 מ"מ HEPESCellgro10-041-CV 
סרום בקר עוברי (מנוטרל בחום)GemCell100500 
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות פניצילין / 10,000 מ"ג/מ"ל סטרפטוק)GIBCO15140 
0.5 מ' EDTAאיכות ביולוגית בע"מ351-027-101 
0.2% ו-1.6% נתרן כלוריJT Baker3624תמיסות נתרן כלורי שהוכנו באמצעות מים מזוקקים ומסוננים סטריליים
מסוננים סטריליים Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077 צריך להיות מובא ל-18-26 & deg; C לפני השימוש
Histopaque 1119 מסונן סטרילי 1119Sigma11191Histopaque 1119 ל-18-26 & deg; C לפני השימוש
תמיסת מלח חומצה פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיוםCellgro210-40-CV 
אלכוהול אתילי (200 הוכחה)חברת וורנר גרהאם64-17-5 
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)InvitrogenC-7025הכינו פתרונות מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, שימו לב ואחסנו ב-80 מעלות; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(ו-6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)InvitrogenC-2927הכינו פתרונות מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, שימו לב ואחסנו ב-80 מעלות; C
נגד עכבר CD45 (שיבוט 30-F11)eBioscience170451-82 
נגד עכבר Ly6G (שיבוט 1A8)BD Pharmingen551461 
נגד עכבר Ly6G (שיבוט 1A8)BD Pharmingen560599 
נגד עכבר CD11b (שיבוט M1/70)eBioscience47-0112-82 
נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD FC Block)BD Pharmingen553141שימוש ב-1:100 דילול
חי/מת ערכת כתמי תאים מתים כחולים ניתנים לתיקוןבדיקות מולקולריותL-23105שימוש ב-1:1000
דילול דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma67-68-5 
תמיסת פרפורמלדהיד, 4% ב-PBSUSB Corporation19943 
 <חזק>טבלה 1. ריאגנטים לבידוד, תיוג ומעקב אחר נויטרופילים שהועברו באימוץ.
 <חזק>חומרים
C57BL/6 עכבריםTaconic 
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לקורנינג430053 
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לBD Falcon352070 
25 מ"ל פיפטות סרולוגיותCelltreat229225B 
10 מ"ל פיפטות סרולוגיותCelltreat229210B 
5 מ"ל פיפטות סרולוגיותCelltreat229205B 
פיפטות פסטר (3 מ"ל)בז BD357575 
מזרקים 12 מ"לקנדל מונוגז'ט512878 
25 גרם x 5/8 אינץ' מחטים (מחטי החלקה מדויקות)BD305122 
מסנני תאים 100 מ"מBD Falcon352360 
צלחות פטרי חיידקיותBD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
מכשירי ניתוח עכברים (מספריים, מלקחיים, אזמל)מכשירי מחקר ביו-רפואיים10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000מכשירים מעוקרים לפני השימוש
 <חזק>ציוד
קולט אדים לתרבית רקמותThe Baker CompanySG403 
צנטריפוגה בקירורThermo Fischer Scientific75004521 
37 מעלות; אמבט מים רועדים CThermo Fischer Scientific3166721 
 <חזק>טבלה 2. רשימת החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
יש להביא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
  4. Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
  5. Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  6. Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  7. Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
  8. Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  9. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  10. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  11. Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  12. Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
  13. Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
  14. Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
  15. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
  16. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  18. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  19. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658(2012).
  20. Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
  21. Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
  22. Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
  23. Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell TrackerHistopaque

מאמרים קשורים