דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
לאחר מיקרוגליה שבץ המוחי / מקרופאגים (ז / ז) עובר שפעול מהיר עם שינויים מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים הכוללים ביטוי של פני השטח אנטיגנים רומן וייצור של מתווכים כי לבנות ולתחזק את התגובה הדלקתית. ראיות מצביעות על כך שמתעוררים M / M הם תאי פלסטיק מאוד שיכול להניח הפעלה קלאסית פרו דלקתית (M1) או חלופית אנטי דלקתית (M2) לאחר פגיעה מוחית חריפה. עם זאת אפיון של ביטוי M / M סמן פנוטיפ, colocalization והתפתחות הטמפורלית במוח נפגע מלא עדיין חסר.
פרוטוקולי Immunofluorescence במיוחד מכתימים סמנים רלוונטיים של הפעלת M / M יכולים להתבצע במוח איסכמי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הדפוס של לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M כגוןCD11b, CD68, Ym1, במודל של עכברים של איסכמיה מוקד הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי (pMCAO). ניתוח דו ממדי של האזור המוכתם מגלה כי כל סמן קשור למורפולוגיה M / M מוגדר ויש לו לוקליזציה נתון בנגע איסכמי. דפוסים של שיתוף ביטוי סמן פנוטיפ M / M ניתן להעריך על ידי confocal הדמיה תלת ממדית באזור איסכמי. ניתן לרכוש תמונות על נפח מוגדר (10 מיקרומטר Z-ציר וגודל צעד 0.23 מיקרומטר, המקביל ל 180 x 135 x 10 מיקרומטר נפח) עם מצב סריקה רציף כדי למזער את ההשפעות לדמם דרך ולהימנע מגל חופף. אז תמונות מעובדות להשיג הדמיות תלת ממדיות באמצעות תוכנת Imaris. השקפה מוצקה של שלוש הדמיות ממדיות מאפשרת ההגדרה של ביטוי סמן באשכולות של תאים. אנחנו מראים שיש לי M / M היכולת להבדיל כלפי מספר רב של פנוטיפים, תלוי במיקום באתר הנגע וtiשלי אחרי פציעה.
מבוא
לאחר פגיעה מוחית חריפה, מיקרוגליה במהירות מופעלים ולעבור מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים משתנים 1-3. תגובה מהותית זה קשור לגיוס של מקרופאגים יליד דם אשר נודדים לתוך 4,5 parenchyma המוח נפגע. התפקיד של מיקרוגליה ומקרופאגים אשר antigenically לא להבחין (המכונה מעתה כז / ז) בפגיעה מוחית עדיין במחלוקת. מספר גדל והולך של מחקרים מצביע על כך, באופן דומה למה שתאר למקרופאגים היקפיים, מיקרוגליה ומוח מגויסים מקרופאגים יכולים להניח פנוטיפים שונים קיצוניות שמתאימה לרעיל קלאסי הפרו דלקתי (M1) או הפנוטיפ אנטי דלקתי מגן (M2). מצבי ההפעלה השונים, כולל הפרשה של גורמים פרו או אנטי דלקתיים, שחרורו של מולקולות נוירוטרופי ופעילות l....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. Immunofluorescence
הפרוטוקול הבא מבוצע על cryosections מוח העטרה שהתקבל בעכברים perfused transcardially (20 מיליליטר של PBS, 0.1 mol / ליטר, pH 7.4, ואחריו 50 מיליליטר של paraformaldehyde המצונן 4% ב-PBS). לאחר זלוף, המוח יוסרו בזהירות והועבר לסוכרוז 30% PBS ב 4 ° C למשך הלילה לcryoprotection. אז המוח מוקפא במהירות על ידי טבילה בisopentane ב-- 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לפני שנחתם לתוך צלוחיות ומאוחסנים ב -70 ° C עד לשימוש. cryosections העטרה המוח (20 מיקרומטר) נחתכים באופן סדרתי וכפוף לפרוטוקול immunofluorescence 11, 6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דוגמא לתוצאות המתקבלות כאשר פרוטוקולי תיוג ורכישות confocal מתבצעים לאזור איסכמי מתוארת באיורים 1 א ו-1B. צפו בשני ממדים של תמונות שנרכשו עולה כי בעשרים וארבע שעות לאחר איסכמיה (א '), CD68 סמן lysosomal (הירוק) בא לידי ביטוי בתאי hypertrophic ameboid CD11b (אדום) נמצאים בליבת איסכמי. באזור גבול תאים החיוביים (B) CD11b להציג גופי תא עגולים ותהליכים מסועפים חיוביים לCD68. תחזיות ציר ה-Z (חלק ימני ותחתון של A ו-B)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מציגים כאן פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי (לניתוח מפורט יותר ראה נ"צ 6). שיטה זו משלבת מכתים ספציפי של סמן הרלוונטי של הפעלת M / M עם confocal הדמיה תלת ממדית. הכוונון העדין של נוגדנים, סרום וfluorconjugated דילולים עובדים מאפשר אות אופטימלית יחס רעש של הסמנים הנחקרים. עיבוד תמונה כדי להשיג שלוש הדמיות ממדיות מאפשר הגדרה של ביטוי סמן באשכול של ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש מחברים אין לחשוף.
תודות
סטפנו פומגלי הוא עמית של קרן Monzino.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | סופק באדיבות על ידי Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H– CHST 33342 | Life Technologies | H21492 | |
| עכבר גרעינים אנטי-עצביים (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| נוגדן נגד חולדות עז ביוטית | ג'קסון מחקר חיסוני | 112-065-143 | |
| TSA ציאנין 5 מערכת | פרקין אלמר | NEL705A001KT | |
| להאריך זהב | Invitrogen | P36930 | |
| נגד חולדות אלקסה 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| אנטי עכבר Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| אנטי ארנב Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| פוספט חוצץ מלח | Sigma | P4417-100 | |
| <חזק>ציוד | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 מיקרוסקופ קונפוקלי | Olympus | ||
| AnalySIS תוכנה | אולימפוס | ||
| אימריס תוכנה 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| חבילות תוכנה GraphPad Prism גרסה 4.0 | תוכנת GraphPad בע"מ |
מקורות
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 37....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
