מאמר שיטה

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

DOI:

10.3791/50618

⸱

15 באוקטובר 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים מכשיר microfluidic המאפשר קביעת כמותית של ביומולקולות תאית בתאים בודדים מרובים במקביל. לצורך כך, התאים לכודים באופן פסיבי באמצע microchamber. עם ההפעלה של שכבת הבקרה, התא מבודד מהנפח שמסביב בחדר קטן. הנפח המקיף לאחר מכן ניתן להחליף מבלי להשפיע על התאים המבודדים. עם זאת, על פתיחה וסגירה קצרות של החדר, הפתרון בתא יכול להיות מוחלף בתוך כמה מאה אלפיות שנייה. בשל ההפיכות של התאים, יכול להיחשף לתאים ברצף פתרונות שונים באופנה לשליטה מאוד, למשל עבור דגירה, כביסה, ולבסוף, תמוגה תא. Microchambers הסגור היטב יאפשר השמירה של lysate, למזער ולשלוט בדילול לאחר תמוגה תא. מאז תמוגה וניתוח להתרחש באותו המיקום, רגישות גבוהה נשמר משום שאין ד נוסףilution או אובדן analytes מתרחש במהלך הובלה. עיצוב microchamber לכן מאפשר ניתוח אמין לשחזור של מספרי עותק קטנים מאוד של מולקולות תאיים (attomoles, zeptomoles) שוחררו מהתאים בודדים. יתר על כן, ניתן לארגן microchambers רבים בפורמט מערך, המאפשר הניתוח של תאים רבים בבת אחת, בהתחשב בעובדה שמכשירים אופטיים מתאימים המשמשים לניטור. יש לנו כבר השתמשתי בפלטפורמה למחקרי הוכחה של הקונספט לנתח חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors ושליחים שני באופן כימות או יחסי או מוחלט.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים רבים בעבר חשפו הבדלי תא אל התא בתוך אוכלוסיית תאים גדולה 1-3, בפרט איתות מעבדת 4, או הכמויות של ביומולקולות תאית כגון חלבונים 5,6, מטבוליטים, וcofactors 7,8. heterogeneities אלה נחשבים חשובים ביסודו להסתגלות תאים והתפתחות 9, אבל גם לשחק תפקיד מרכזי בהופעתה וטיפול במחלות כגון סרטן 10-13. לכן, מחקרים ברמת התא הבודד הם עניין גבוה במחקר ביולוגי ותרופתי, במיוחד אם מחקרים אלה חושפים את תגובות תאים השונות לאחר טיפול עם חומרים כימיים ביו.

בשנים האחרונות, רבות פלטפורמות אנליטיים פותחו המאפשרות ניתוח של תאי חיים בודדים או את ההרכב הכימי של התוכן הסלולרי. בעוד תא ניאון מיון מופעל (FACS) הוא הזהב standard לניתוח מאוד תפוקה גבוהה של תאי חיים בודדים, השיטה לא יכולה להיות מועסק לכימות של תרכובות תאיים או מופרשים. הופעתה של פלטפורמות microfluidic הבטיחה אסטרטגיות אנליטיות חדשניות למיצוב, טיפול ומעקב של תאים בודדים. אבן דרך במיקרופלואידיקה הושגה עם השילוב של שסתומים PDMS גמישים הבינו ידי Quake ועמיתים לעבודה 14,15. שסתומים אלו יעילים מכיוון שהם יכולים לבודד אזורים בשבב, לדוגמא להפריד בין שתי תרבויות 16. יתר על כן, הם רלוונטיים במיוחד לניתוח תא בודד, ולכן לעזור להפחית בעיות דילול אנליטי. כוחה של גישה זו לניתוח תא בודד הודגם לאחרונה על ידי הנסן ועמיתים לעבודה, שניתח את ביטוי גנים ממאה תאים בודדים ב17 מקבילים.

כאשר מיקוד חלבונים ומטבוליטים, הניתוח קשה מאוד עקב חוסר המתאיםשיטות mplification, המספר הגדול של תרכובות שונות בהווה ובווריאציות שלהם בטבע כימי. יתר על כן, רוב ביומולקולות תאית צפויות להיות נוכח במספרים נמוכים עותק בסדר הגודל של כמה עשרות אלף 18, ולכן השיטה אנליטית המשמשת חייבת להיות רגישות גבוהה. מבחני יותר חזקים כגון immunoassays וimmunoassays צמודת אנזים (ELISA) קשים להשתלב במכשירי microfluidic כי הם דורשים כמה כביסה ושלבי דגירה, כמו גם חוסר תנועת פני השטח.

בשל אתגרים אלה, אין זה מפתיע שרק כמה דוגמאות שדווחו בו חלבונים או מטבוליטים היו לכמת ברמת התא הבודד. לדוגמא, מחקרים על ההפרשה של תרכובות ניאון דווחו 19,20. לאחרונה, היישום עם ELISA הוצג לניתוח חלבונים מופרשים (nonfluorescent) מתרבית תאים (THP-1 תאים) 21 ויחידה (immune) תאים 10. מיקוד חלבונים תאיים, שי et al. פיתח מכשיר microfluidic שאפשר זיהוי של חלבונים תאיים לניתוח של מסלולי איתות בתאים סרטניים באמצעות immunoassay 11. עם זאת, רק כמויות יחסי של חלבונים שהיו נחושות ולא הגברה אנזימטית שימשה כדי להגדיל את האות לחלבוני שפע נמוך.

לאחרונה, הצלחנו לשלב microdevice השמנה תא בודד עם מבחני הקרינה 8 וimmunoassays 22 (איור 1). תאים לכודים באופן פסיבי במבני משוכת microsized, המאפשרים אספקה ​​והחלפה (מהירה) של מדיום וחומרים כימיים אחרים ללא כל תנועה של התאים. שסתום בצורת טבעת סביב כל מלכודת מאפשר בידוד של התא בנפח קטן מאוד ("microchamber"). שסתום זה מונע מייד לאחר החדרת חיץ תא lysing (hypoosmolar), שהואNCE מניעת מולקולות תאיים או מולקולות מופרשים כדי לפזר משם. והכי חשוב, בשל גודלו הקטן של הנפח (625 pl) דילול גדול של המולקולות הוא התחמק. יתר על כן, מאז תמוגה וניתוח מבוצעים באותה התנוחה בשבב, אין אובדן של analytes בשל תחבורה. תכנון השבבים המתוארים כאן כולל 8 שורות לסירוגין של או 7 או 8 microchambers, בהיקף של 60 microchambers. התאים הם מופעלים בשורות, כך שזיהום צולב לאורך קו מנועה.

הפלטפורמה יכולה לשמש בשילוב עם מבחני הקרינה, כמו גם מבחני חיסוניים (1D איור). באפשרות השנייה, הקמנו פרוטוקולים לחוסר תנועה של הנוגדנים, אשר עולים בקנה אחד עם ייצור השבבים ותהליך ההרכבה. לפיכך הפלטפורמה פותחת את הדרך למבחנים רגישים, אמינים וכמותיים ברמת התא הבודד. עד עכשיו, יש לנו השתמשתי במכשיר לניתוח של iאנזימי ntracellular והמופרשים (כימות יחסי על ידי מבחני האנזימטית), cofactors תאיים, חלבונים ומולקולות קטנות (כימות מוחלטת על ידי מבחני נקודת סיום או ELISA). בחלק הבא, אנו מתארים את תהליך ייצור שבבים באמצעות יתוגרפיה רב שכבתית רכה והפרוטוקולים לדפוסים של הנוגדנים באמצעות הדפסת microcontact וכימיה של פני השטח. בנוסף, כמה דוגמאות לשימוש בשבב ופעולות מקבלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SU-8 ייצור מאסטר

הכן שני תבניות ההורים לערוצים (fluidic ובקרה, לשרטוטים וממדים ראו איור 2) עם הפרוטוקול הבא אבל עם דפוסי מסכה שונים. התהליך מוצג באיור 3 א.

  1. התחל על ידי חימום פרוסות סיליקון 4 אינץ 10 דקות ב 180 ° C. טען את רקיק מיובש על ספין coater ולהשתמש בפרוטוקול לציפוי ספין SU-8 שינה 2015:
    1. ספין רקיק ב100 סל"ד 20 שניות (מכסה פתוח של ספין coater, לוותר SU-8 במהלך השלב, מיכסה קרובה זאת לאחר מחלק).
    2. רקיק ספין ב500 סל"ד 10 שניות (זה יתפשט להתנגד על פני כל רקיק).
    3. רקיק ספין על 1,750 סל"ד במשך 30 שניות (מגדיר את הגובה של להתנגד ל20 מיקרומטר).
  2. הסר להתנגד מהקצה של פרוסות סיליקון עם אצטון (להשתמש בספוגית) כמו זה אחרת ידבק פלטה חשמלית בשלב הבא. מעביר את פרוסות לאהotplate ב 95 מעלות צלזיוס וחום למשך 4 דקות. לאחר softbake, לחשוף את להתנגד באמצעות photomask מודבק sodalime זכוכית בaligner מסכה עם אור האולטרה סגול (150 mJ / 2 סנטימטר, הנמדד ב365 ננומטר).
  3. לאחר החשיפה, לחמם את פרוסות שוב על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על פלטה חמה. לצנן את רקיק RT ולאחר מכן לטבול אותו לתוך אמבטיה של SU-8 מפתח למשך 4 דקות. ללחוץ בעדינות כדי להסיר SU-8 שלא נחשפו. שטוף את רקיק עם isopropanol הכיתה חדר הנקי ומכה יבשה עם חנקן. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הפיתוח היה מוצלח (במיוחד מלכודות התא). אם מלכודות התא מפותחות לחלוטין, ההשתקפות של פרוסות סיליקון צריכה להיות גלויה. במידת צורך, לפתח את רקיק שוב במשך כמה דקות.
  4. אופים את פרוסות בתנור במשך שעה 2 ב 180 ° C כדי להסיר את כל הממס שיורית. בדוק את הגובה של הערוצים עם מאבחן אחר צעד. אם הגובה שונה מהגובה הרצוי, חזור על פרוטוקול זה מתחיל בשלב 1.1 עם רקיק חדש ולשנות את הספין במהירות (1.1.3 צעד). לסיים את הייצור של עובש האב ידי silanizing רקיק עם 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane בייבוש למשך הלילה.

2. ייצור אב להדפסת microcontact

  1. על מנת להכין תבניות הורים להדפסת microcontact, מייבש את פרוסות סיליקון עבור 10 דקות ב180 ° C. ספין מעיל 1 HDMS מיליליטר גבי פרוסות סיליקון זה ב7,500 סל"ד 30 שניות (להתנגד שומרת טוב יותר על משטח silanized). ספין מעיל 2 מיליליטר של AZ1518 חיובי להתנגד עם פרוטוקול זה:
    1. לוותר סטטי של להתנגד לרקיק.
    2. ספין רקיק למשך 5 שניות ב500 סל"ד.
    3. ספין רקיק ל60 שניות ב 4,000 סל"ד.
  2. לאחר softbake שניות 50 ב100 ° C על פלטה חמה, לחשוף את להתנגד לקרינת UV-אור (21 mJ / 2 סנטימטר ב365 ננומטר) דרך photomask ועל aligner מסכה. לפתח להתנגד באמבט של AZ 726 ל75 שניות. שוטפים את פרוסות פיתחו עם DI-מים וד המכהר"י עם חנקן. הסר ממס שיורי על ידי חימום רקיק ב115 מעלות צלזיוס במשך 50 שניות. Silanize רקיק תחת ואקום הלילה.

3. ייצור של השבב microfluidic

עיצוב מכשיר דו שכבתי המשמש לניסויים אלה. שתי שכבות מוכנות בנפרד ומחוברות יחד, לפני שהשבב סוף הסוף מלוכדים על גבי זכוכית (3 ב איור). שלב זה מתאר את הייצור של שכבות PDMS וחותמת PDMS להדפסת microcontact.

  1. הכן תערובת 10:01 של PDMS וסוכן ריפוי. הכן כ 80 PDMS גרם בסך הכל (באמצעות העיצובים שלנו, זה יגרום 10 שבבים). מערבבים את שני החלקים במרץ והדגה PDMS עד לקבלת תערובת בועה חופשית (~ 30 דקות).
  2. מניחים את פרוסות בשכבה מלאה בתוך צלחת פטרי וקלטת אותו על התחתית. , הבא לשפוך ~ 50 גרם של PDMS על גבי והכניס את רקיק לפחות 2 שעות בתנור בחום של C ° 80 כדי להבטיח מלאריפוי של PDMS. חזור על אותו התהליך עבור רקיק הדפסת microcontact, בשביל זה ~ יש צורך 20 PDMS גרם.
  3. ספין המעיל PDMS על פרוסות סיליקון עם שכבת fluidic במהירות סיבוב של 2,000 סל"ד ליצירת כ 40 מיקרומטר שכבה הגבוה PDMS. Cure PDMS בתנור במשך שעה לפחות 1 ב 80 ° C.
  4. כאשר שני החלקים נרפאים, להסיר את שכבת השליטה מהרקיק ולחתוך לחתיכות בסכין גילוח. אגרוף חורי חיבור לחץ באמצעות אגרופן ביופסיה 1 מ"מ. לאחסון, מומלץ לשים חתיכת הסרט על הערוצים.
  5. האג"ח שתי שכבות, קח רקיק הספין מצופה ואת החלק העליון ומניח אותם בשואב פלזמה 23. לאחר טיפול פלזמה, ליישר את שני החלקים במהירות תחת מיקרוסקופ עם מרחק עבודה גדול. הוסף כמה PDMS חילוף סביב החלקים העליונים ממוקמים. שלב זה אינו חובה, אבל זה מקל על הסרת PDMS מפרוסות סיליקון. מניחים את פרוסות בתנור על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.
  6. השתמש באזמל כדי להסיר בזהירות את PDMS מהרקיק ולחתוך את השבבים. אגרוף חורי גישה לחיבורי fluidic עם אגרופן ביופסיה 1.5 מ"מ.
  7. שבב PDMS הוא עכשיו סיים והוא יכול להיות מאוחסן במשך חודשים. אופציונאלי: אם השבב משמש עם מאגר, לחתוך את החלק העליון של קצה פיפטה 200 μl ולהשתמש בחלק החילוף, PDMS נרפא למחצה כדי להדביק אותו על גבי. שים את השבב בתנור שוב ב80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.

4. מליטה לשקופיות זכוכית

כדי להשתמש במכשיר עבור מבחני האנזימטית ישירים, הצעד היחיד שנדרש לאחר המליטה הוא החסימה של משטחים. עבור פרוטוקול זה, המשך א עם זאת, כדי להשתמש בשבב microfluidic לimmunoassays או ELISAs, עיין בפרוטוקול B כדי להגביל את האתרים מחייבים רק לשקופית הזכוכית (כלומר למיקרוסקופיה TIRF או SPR). אם מגבלה זו אינה חשובה, עיין, אבל להשתמש conjugates biotinylated בשלב 4.3 והמשיכו בשלב 4.8בפרוטוקול B כדי ליצור משטח מתפקד במלואה.

קודם לביצוע הפרוטוקול A ו-B: מומלץ לסנן את כל פתרונות חלבון בשימוש לפני החדרתם לשבב. אגרגטים פסולת וחלבון אחרים עלולים לחסום את מלכודות תא, ובכך להפחית את מספרם של תאים שיכולים לשמש לצורך הניתוח. לצורך כך, יש להשתמש ביחידת מסנן adsorbing nonprotein כדי לסנן את כל הפתרונות לפני שמציג אותם לערוצים.

פרוטוקול (מבחני האנזימטית)

  1. כדי לסיים את מכשיר microfluidic, אג"ח חלקי PDMS על גבי זכוכית. כדי לעשות זאת, לנקות ראשון שקופיות זכוכית עם סבון, מים מזוקקים ואתנול. ייבש את השקופית באמצעות זרם חנקן. נקה את חלק PDMS עם נייר דבק.
  2. לשים את חלק PDMS ושקופיות הזכוכית ניקו לתוך שואב הפלזמה ל45 שניות ב18 וו כדי להבטיח מליטה חזק, לשים את השבב על פלטה חשמלית (100 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
  3. לאחר מליטה, למלא את השבב עם fluids. דרך קלה ביותר להשיג זאת היא להשתמש בכוח הצנטריפוגלי. חותכים את החלק התחתון של 200 קצה פיפטה μl. עבור ערוצי fluidic, למלא אותם בפתרון החסימה (אלבומין בסרום שור (4% w / v) או פולי-L-ליזין) פוליאתילן גליקול מורכב (0.05% w / v) ולמקם את הטיפים לפתחי הכניסה. מלא את פתחי הכניסה שכבה מלאה עם מים או עם פתרון מליחות, למשל PBS. הנח את השבב לצנטריפוגות (800 XG) במשך 5 דקות. הערוצים צריכים להיות החברה מלאים בנוזל לחלוטין. אם לא, חזור על שלב זה.
  4. דגירה פתרון החסימה לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. שטוף את הפתרון מחוץ לשכבת הנוזל עם PBS בקצב זרימה של 10 μl / דקה באמצעות משאבת מזרק. המכשיר מוכן לניסויי תא עכשיו.

פרוטוקול B (immunoassays)

לסקירה מלאה של שינוי פני השטח מצעד 4.7 ואילך מלאה, אנא עיינו בטבלת 1.

  1. בתוךבולי PDMS cubate להדפסת microcontact עם פתרון bBSA / BSA (למשל 1-100). לאחר 30 דקות, לנקות את החותמות ביסודיות עם מים מזוקקים ולייבש את החותמת תחת זרם של חנקן. במהירות למקום החותמות בשקופית זכוכית ניקתה (איור 4).
  2. לחשוף את שקופיות זכוכית עם החותמת יחד עם החלק העליון של השבב microfluidic לפלזמת חמצן במשך 45 שניות בכוח מרבי (18 W) בשואב פלזמה. לאחר טיפול פלזמה, להסיר את החותמת וליישר את המשטח המודפס מתחת microchambers של המכשיר. הנח את השבב ל30 דקות על פלטה חשמלית ב50 ° C.
  3. כדי לחסום את פני השטח שנותר, להציג פתרון מסונן סטרילי BSA (4% (w / v) ב-PBS) לתוך השבב עם צנטריפוגות (ראה שלב 4.2). דגירה עבור שעה 1 ולשטוף את הפתרון מחוץ לשכבת הנוזל עם PBS (ראה שלב 4.3). השבב לאחר מכן ניתן להשתמש בם ישירות או לאחסן עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס בתיבה לחה.
  4. לsurfac מחייב מתפקד במלואהדואר, להציג avidin (0.025% (w / v) ב-PBS) לתוך המאגר. השתמש בקצב זרימה של 5 μl / min למשך 30 דקות למשוך את פתרון avidin דרך ערוצי נוזל. לאחר מכן, שטוף את PBS עבור 10 דקות. יש לשטוף את המאגר באופן יסודי.
  5. לאחר מכן, להוסיף חלבון G (0.0025% (w / v) ב-PBS) וסומק ל30 דקות נוספות. לשטוף עם PBS עוד 10 דקות לאחר מכן. לאחר מכן, להוסיף את הנוגדן של עניין (0.0001% (w / v) ב-PBS) במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לעצור את הזרימה ל15 דקות, כדי לאפשר מחייב. בשלב בא, לשטוף עם PBS עבור 10 דקות.

5. ניסויי תא

הפרוטוקול כתוב באופן כללי בגלל המגוון של מבחני אפשריים. כדוגמא ניתנים ריאגנטים דרושים עבור assay רעילות G6PDH. יעילות תא לכידה הראשונית של המכשיר היא סביב 2.5%, כלומר 5 מתוך 200 תאים יהיו לכוד. התפוסה הסופית של מלכודות התא מאוד תלויה בקו הסלולרי בשימוש, בפרוטוקול להשעותשורת התאים וזמן התאים נשטפים דרך התעלה. לתאים הגדלים באופן טבעי בהשעיה (כגון U937), ניתן למצוא תאים בודדים בכ 75% מהתאים אחרי כמה דקות. התאים האחרים או לא מלאים, או שנכבשו על ידי שני תאים או יותר. באופן כללי, תפוסת התא הבודד היא קטנה יותר עבור שורות תאים חסיד. בעת שימוש בפרוטוקול מתלה קל למדי שהוצג כאן, האחוז יורד ל% כ -30 (HEK, תאי MLT). תפוסת התא הבודד ניתן לשפר על ידי טיפול טריפסין של התאים, אבל זה יכול גם לשנות את התוצאות של הניסויים.

בהתאם למולקולת המטרה, ספיחה או ספיגה לPDMS יכולה להשפיע על התוצאות. ספיחה יכולה להיות מופחתת על ידי חסימת המשטחים עם BSA או PLL-G-PEG. הקליטה היא סבירה עבור רוב ביומולקולות הידרופילי, אבל זה צריך להיבדק על מרכיבי תא (קטנים) lipophilic.

  1. הכן את התאים בהתאם לפרוטוקול הספציפי (לדוגמא: בנוסף לסמים). לתאי השעיה, להוסיף תאים ישירות לשבב. לשורות תאים מודבקות, השתמש חיץ ניתוק ללא אנזים לייצר השעיה תא. סנן את התאים לפני שהוא מציג אותם לשבב כדי להפחית את הכמות של אשכולות תא.
  2. טען את התאים על גבי השבב באמצעות משאבת מזרק וזרימה קדימה, ולא למשוך את ההשעיה התא. השתמש בקצב זרימה של 5 μl / min לשורות תאי השעיה וספיקות גבוהות של 10-20 μl / min לתאי דבק מאז להפחית קובץ מצורף לא ספציפי של התאים על גבי קירות הערוץ.
  3. כאשר המלכודות מלאות, סגור את הלשכה. אם תאים רבים לדבוק nonspecifically אל פני השטח, נסה לשטוף אותם עם חיץ ניתוק תא בקצב זרימה של 10-30 μl / min.

פרוטוקול (מבחני האנזימטית)

  1. לסגת מאגר תמוגה דרך השבב. בדוגמה זו, החיץ הזה הוא חיץ hypoosmolar עם Tween הוסיף 20 (10 מ"מ טריס-HCl, 10מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1% (v / v) Tween 20). להתפרקות תאים במהירות פתיחה וסגירה (כלומר 500 אלפיות שני עבור ספיקות של 10-50 μl / min 7,21). עבור assay G6PDH, להוסיף 2 מ"מ glucose-6-phosphate, 0.5 מ"מ NADP, 0.5 U / diaphorase מיליליטר ו0.3 מ"מ resazurin למאגר תמוגה. התחל ניטור התגובה הקינטית מייד לאחר תמוגה.

הערה: בחר בכל חיץ אשר מתאים לassay, לעומת זאת חשוף לזכור כי בדטרגנטים חזקים (כמו טריטון, SDS) תאי lyse מייד ויובילו לאובדן של אנליטי בתא פתיחה.

פרוטוקול B (immunoassays)

לתיאור קצר של ניסויי ELISA תא (ספיקות, חדר מצב, וכו '), אנא עיין בטבלת 1.

  1. לELISA, מוסיף את המגיב נדרש זיהוי (נוגדן למשל המשני אנטיגן שכותרתו,) ישירות למאגר תמוגה. במסמך זה הוסיף Tween 20 מפחית את ספיחה לא הספציפית. Lyse התאים פי צעד 5.4. דגירה את תערובת ל10-15 דקות כדי לאפשר מחייב (זמן דגירה בהתאם לאנטיגן ונוגדן בשימוש).
  2. conjugates אנזים נוגדן שadsorbed nonspecifically לקירות הערוץ יכול להוביל להמרה של מגיב לגילוי כבר בתוך המאגר והערוצים. לצמצום בעיות מספיחה זה, שטוף את מעכב קבוע של האנזים המשמש לזיהוי דרך השבב בזמן הדגירה (תאים סגורים, לפני הוספה מגיב לגילוי). לHRP, השתמש 20 מ"מ HCl במים כדי להשבית באופן קבוע אנזימי adsorbed nonspecifically.
  3. לאחר זמן דגירה, להציג מגיב לגילוי (לדוגמא Amplex האדומה ומי חמצן לHRP) לשבב. פתח את תאי זמן קצר שוב כדי לשטוף את הנוגדנים משני nonbound משם ולהוסיף מגיב לגילוי. התחל ניטור התגובה קינטית באופן מיידי.
  4. כיול: לשתקהנוגדנים נגד היעד של ריבית. תאים סגורים. הכן ריכוזים שונים של חומר אנליטי במאגר או בתא lysate את השבב. החל ריכוז לשבב ובמהירות להחליף את הנפח בתוך התאים (500 msec פתיחת זמן). זמן פתיחה זו הוא קצר מספיק כדי לוודא ששום הצטברות נוספת מתרחשת משטיפת אנליטי, ומספר מסוים בלבד של מולקולות מהיקף microchamber מזוהים. מהריכוז הידוע של האנטיגן בתוך הפתרון והנפח של החדר (625 pl), לחשב את הסכום בתוך החדר. לאחר מכן, המשך בשלב 5.5 ולהציג מחצית זיהוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפלטפורמה שלנו היא מסוגלת לנתח מגוון של תאיים, כמו גם מולקולות מופרשים בהווה באו המיוצר על ידי תאים בודדים. כאן, אנו רוצים להציג מחקרי ירושלים שונים כדי להדגיש את המגוון של מבחני אפשריים. אנו נותנים דוגמא לאנזים מופרש (איור 5 א), כמו גם אנזים תאיים (איור 5) וחלבון (5c דמויות וד). לדוגמאות נוספות, כגון cofactors או מולקולות קטנות, עיינו Eyer et al. (2012) וEyer et al. (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגית מיקרופלואידיקה פתחה אפשרויות חדשות ומרתקות לניתוח תא בודד. בפרט, את האפשרות למלכודת ולשתק את התאים בנפרד על ידי כלים microfluidic אפשרה מחקרים לטווח קצר וארוך שיטתיים על מאפייני תא בודד ותגובה. בנוסף, אנקפסולציה של תאים בmicrodroplets תדירות גבוהה, שנוצר על שבב אלקטרוני, אפשרה מחקרי הפרשת תא בודדים, שלא ניתן לבצע עם מכשירי cytometry קונבנציונליים. גישת microdroplet, לעומת זאת, יש כמה מגבלות, כאשר שלבי דגירה ושטיפה נדרשים לפרוטוקול אנליטית. הגישה שלנו משלבת את שני המושגים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בתודה טום רובינסון לקריאה הוכחה של כתב היד, ג Bärtschi וה 'בנץ להקמת מערכת בקרת לחץ שהותקן. אנחנו רוצים גם להכיר בשימוש במתקן חדר הנקי הראשון ומרכז האור מיקרוסקופית (LMC), שניהם במכון הטכנולוגי של ציריך. העבודה מומנה על ידי חברת מרק סרונו והמועצה האירופית למחקר (ERC) תחת תכנית המסגרת ה -7 (ERC החל גרנט, פרויקט לא. 203,428, nμLIPIDs).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים:
שם חברת הריאגנטיםהערות מספר קטלוגי(אופציונלי)
SU-8 2015MicroChem Corp. (Netwon, MA)
ABCR (קרלסרוהה, גרמניה)AB103608
4-methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrateSigma AldrichM9763
AcetoneMerck VWR (דרמשטדט, גרמניה)100014
AvidinAppliChem (Axon Lab AG)A-2568
AZ 1518AZ Electronic Materials (ויסבאדן, גרמניה)n.a.AZ
726 מפתחAZ Electronic Materials (ויסבאדן, גרמניה)n.a.
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A-4503
אלבומין סרום בקר, ביוטיןסיגמא אולדריץ'A-8549
מאגר דיסוציאציה של תאיםInvitrogen13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)Sigma Aldrich40215
חומצה הידרוכלוריתFluka84422
איזופרופנולMerck VWR (דרמשטדט, גרמניה)109634
מגנזיום כלוריד הקסהידראטFluka63068
MR מפתח 600Microresist technology GmbH (ברלין, גרמניה)n.a.PBS
Invitrogen10010-031
PLL-g-PEG מושתלSuSoS, (Dü bendorf, שוויץ)n.a.PLL-g-PEG
ביוטין מושתלSuSoS, (Dü בנדורף, שוויץ)n.a.אשלגן
כלוריFluka60132
חלבון G, ביוטיןSigma Fine Chemicals41624
פרוסת סיליקוןSi-Mat (Kaufering, גרמניה)n.a.Sylgard
184 ערכת אלסטומר סיליקון (PDMS)Dow Corning39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethanBiorad
Tween 20Biorad1706531
<חזק>ציוד:
שם חומרקטלוגיהחברההערות (אופציונלי)
0.22 µ מסנן מזרק m PESTRP99722
1/1.5 מ"מ מנקב ביופסיהMiltex, York PA33-31AA/33-31A
מסנן תאים 20 ומיקרו; mPartec04-004-2325
צנטריפוגה Sigma 3-18KKuehnern.a.Hotplate
HP 160 III BMSawatec, סאקס, שוויץn.a.MA-6
מיישר מסכותקארל סוסn.a.Multizoom
AZ100M מיקרוסקופNikon Corporationn.a.Photomask
Microlitho, אסקס, בריטניהn.a
מנקה פלזמה PDC-32GHarrickn.a.Spin
coater Modell WS-400 BZ-6NPP / LITELaurelln.a.Spin
Modules SM 180 BMSawatec, Sax, שוויץn.a.Step
profiler Dektak XT AdvancedBrukern.a.משאבת
מזרק ו- MESYSCetonin.a.
n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane 1610716 מספר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microfluidic ChipSingle Cell AnalysisCell LysisFluorescence MicroscopyImmunoassay DetectionFluidic ControlPDMS FabricationChamber TrappingSolution ExchangeBiomolecule Quantification

מאמרים קשורים