במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנו מציגים מכשיר microfluidic המאפשר קביעת כמותית של ביומולקולות תאית בתאים בודדים מרובים במקביל. לצורך כך, התאים לכודים באופן פסיבי באמצע microchamber. עם ההפעלה של שכבת הבקרה, התא מבודד מהנפח שמסביב בחדר קטן. הנפח המקיף לאחר מכן ניתן להחליף מבלי להשפיע על התאים המבודדים. עם זאת, על פתיחה וסגירה קצרות של החדר, הפתרון בתא יכול להיות מוחלף בתוך כמה מאה אלפיות שנייה. בשל ההפיכות של התאים, יכול להיחשף לתאים ברצף פתרונות שונים באופנה לשליטה מאוד, למשל עבור דגירה, כביסה, ולבסוף, תמוגה תא. Microchambers הסגור היטב יאפשר השמירה של lysate, למזער ולשלוט בדילול לאחר תמוגה תא. מאז תמוגה וניתוח להתרחש באותו המיקום, רגישות גבוהה נשמר משום שאין ד נוסףilution או אובדן analytes מתרחש במהלך הובלה. עיצוב microchamber לכן מאפשר ניתוח אמין לשחזור של מספרי עותק קטנים מאוד של מולקולות תאיים (attomoles, zeptomoles) שוחררו מהתאים בודדים. יתר על כן, ניתן לארגן microchambers רבים בפורמט מערך, המאפשר הניתוח של תאים רבים בבת אחת, בהתחשב בעובדה שמכשירים אופטיים מתאימים המשמשים לניטור. יש לנו כבר השתמשתי בפלטפורמה למחקרי הוכחה של הקונספט לנתח חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors ושליחים שני באופן כימות או יחסי או מוחלט.
מבוא
מחקרים רבים בעבר חשפו הבדלי תא אל התא בתוך אוכלוסיית תאים גדולה 1-3, בפרט איתות מעבדת 4, או הכמויות של ביומולקולות תאית כגון חלבונים 5,6, מטבוליטים, וcofactors 7,8. heterogeneities אלה נחשבים חשובים ביסודו להסתגלות תאים והתפתחות 9, אבל גם לשחק תפקיד מרכזי בהופעתה וטיפול במחלות כגון סרטן 10-13. לכן, מחקרים ברמת התא הבודד הם עניין גבוה במחקר ביולוגי ותרופתי, במיוחד אם מחקרים אלה חושפים את תגובות תאים השונות לאחר טיפול עם חומרים כימיים ביו.
בשנים האחרונות, רבות פלטפורמות אנליטיים פותחו המאפשרות נית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. SU-8 ייצור מאסטר
הכן שני תבניות ההורים לערוצים (fluidic ובקרה, לשרטוטים וממדים ראו איור 2) עם הפרוטוקול הבא אבל עם דפוסי מסכה שונים. התהליך מוצג באיור 3 א.
- התחל על ידי חימום פרוסות סיליקון 4 אינץ 10 דקות ב 180 ° C. טען את רקיק מיובש על ספין coater ולהשתמש בפרוטוקול לציפוי ספין SU-8 שינה 2015:
- ספין רקיק ב100 סל"ד 20 שניות (מכסה פתוח של ספין coater, לו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפלטפורמה שלנו היא מסוגלת לנתח מגוון של תאיים, כמו גם מולקולות מופרשים בהווה באו המיוצר על ידי תאים בודדים. כאן, אנו רוצים להציג מחקרי ירושלים שונים כדי להדגיש את המגוון של מבחני אפשריים. אנו נותנים דוגמא לאנזים מופרש (איור 5 א), כמו גם אנזים תאיים (איור 5) וחלבון (5c דמויות וד). לדוגמאות נוספות, כגון cofactors או מולקולות קטנות, עיינו Eyer et al. (2012) וEyer et al. (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכנולוגית מיקרופלואידיקה פתחה אפשרויות חדשות ומרתקות לניתוח תא בודד. בפרט, את האפשרות למלכודת ולשתק את התאים בנפרד על ידי כלים microfluidic אפשרה מחקרים לטווח קצר וארוך שיטתיים על מאפייני תא בודד ותגובה. בנוסף, אנקפסולציה של תאים בmicrodroplets תדירות גבוהה, שנוצר על שבב אלקטרוני, אפשרה מחקרי הפרשת תא בודדים, שלא ניתן לבצע עם מכשירי cytometry קונבנציונליים. גישת microdroplet, לעומת זאת, יש כמה מגבלות, כאשר שלבי דגירה ושטיפה נדרשים לפרוטוקול אנליטית. הגישה שלנו משלבת את שני המושגים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מודים בתודה טום רובינסון לקריאה הוכחה של כתב היד, ג Bärtschi וה 'בנץ להקמת מערכת בקרת לחץ שהותקן. אנחנו רוצים גם להכיר בשימוש במתקן חדר הנקי הראשון ומרכז האור מיקרוסקופית (LMC), שניהם במכון הטכנולוגי של ציריך. העבודה מומנה על ידי חברת מרק סרונו והמועצה האירופית למחקר (ERC) תחת תכנית המסגרת ה -7 (ERC החל גרנט, פרויקט לא. 203,428, nμLIPIDs).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים: | |||
| שם חברת הריאגנטים | הערות מספר קטלוגי | (אופציונלי) | |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | ||
| ABCR (קרלסרוהה, גרמניה) | AB103608 | ||
| 4-methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (דרמשטדט, גרמניה) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (ויסבאדן, גרמניה) | n.a.AZ | |
| 726 מפתח | AZ Electronic Materials (ויסבאדן, גרמניה) | n.a. | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא אולדריץ' | A-4503 | |
| אלבומין סרום בקר, ביוטין | סיגמא אולדריץ' | A-8549 | |
| מאגר דיסוציאציה של תאים | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| חומצה הידרוכלורית | Fluka | 84422 | |
| איזופרופנול | Merck VWR (דרמשטדט, גרמניה) | 109634 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידראט | Fluka | 63068 | |
| MR מפתח 600 | Microresist technology GmbH (ברלין, גרמניה) | n.a.PBS | |
| Invitrogen | 10010-031 | ||
| PLL-g-PEG מושתל | SuSoS, (Dü bendorf, שוויץ) | n.a.PLL-g-PEG | |
| ביוטין מושתל | SuSoS, (Dü בנדורף, שוויץ) | n.a.אשלגן | |
| כלורי | Fluka | 60132 | |
| חלבון G, ביוטין | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| פרוסת סיליקון | Si-Mat (Kaufering, גרמניה) | n.a.Sylgard | |
| 184 ערכת אלסטומר סיליקון (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | ||
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| <חזק>ציוד: | |||
| שם חומר | קטלוגי | החברה | הערות (אופציונלי) |
| 0.22 µ מסנן מזרק m PES | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 מ"מ מנקב ביופסיה | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| מסנן תאים 20 ומיקרו; m | Partec | 04-004-2325 | |
| צנטריפוגה Sigma 3-18K | Kuehner | n.a.Hotplate | |
| HP 160 III BM | Sawatec, סאקס, שוויץ | n.a.MA-6 | |
| מיישר מסכות | קארל סוס | n.a.Multizoom | |
| AZ100M מיקרוסקופ | Nikon Corporation | n.a.Photomask | |
| Microlitho, אסקס, בריטניה | n.a | ||
| מנקה פלזמה PDC-32G | Harrick | n.a.Spin | |
| coater Modell WS-400 BZ-6NPP / LITE | Laurell | n.a.Spin | |
| Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, שוויץ | n.a.Step | |
| profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a.משאבת | |
| מזרק ו- MESYS | Cetoni | n.a. |
מקורות
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
