מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

סיכום

הקלטות תיקון מהדק Multi-אלקטרודה מהוות משימה מורכבת. כאן אנו מראים כיצד, על ידי אוטומציה של רבים מהשלבים הניסיוניים, זה אפשרי כדי להאיץ את התהליך מוביל לשיפור איכותי בביצועים ומספר ההקלטות.

תקציר

טכניקת התיקון-clamp היא כיום השיטה הכי המבוססת היטב להקלטת פעילות חשמלית מנוירונים בודדים או תאי subcellular שלהם. עם זאת, להשגת הקלטות יציבה, גם מהתאים בודדים, נותר הליך מורכב למדי זמן רב. אוטומציה של שלבים רבים בשילוב עם תצוגת מידע יעילה יכולה מאוד לסייע experimentalists בביצוע מספר רב יותר של הקלטות עם אמינות גבוהה יותר ובפחות זמן. על מנת להשיג את הקלטות בקנה מידה גדולה שסכמנו את הגישה היעילה ביותר היא לא automatize באופן מלא בתהליך, אבל כדי לפשט את הצעדים הניסיוניים ולהפחית את הסיכוי לטעויות אנוש תוך שילוב ניסיונו של הנסיין ומשוב חזותי ביעילות. עם מטרות אלה בחשבון שפיתחנו מערכת ממוחשבת המרכזת את כל הבקרות הנדרשות לניסוי רב האלקטרודה תיקון מהדק בממשק יחיד, commercgamepad האלחוטי זמין ially, תוך הצגה ברמזי מידע והדרכה ניסוי קשורות במסך המחשב. כאן אנו מתארים את המרכיבים השונים של המערכת שאפשרה לנו להפחית את הזמן הנדרש להשגת את תצורת ההקלטה ולהגדיל באופן משמעותי את הסיכוי להקלטה בהצלחה מספר גדול של תאי עצב בו זמנית.

מבוא

היכולת להקליט ולעורר מספר אתרים עם דיוק מיקרומטר היא מאוד שימושית עבור ניסוי השגת הבנה טובה יותר של מערכות עצביות. טכניקות רבות פותחו למטרה זו אבל אף מאפשרות הרזולוציה submillivolt מושגת על ידי טכניקת תיקון מהדק, חיונית ללימוד פעילות התת ופוטנציאלי postsynaptic בודדים. כאן אנו מכסים את פיתוחה של מערכת התיקון-clamp שנתי עשר האלקטרודה בעזרת מחשב שמטרתה הקלטה בו זמנית ומגרה מספר רב של תאים בודדים בדייקנות מספיק ללימוד קישוריות עצבית. אמנם יכולים להיות יזום יישומים רבים אחרים למערכת כזו, זה משאיל את עצמו במיוחד גם ללימוד קישוריות הסינפטית בהתחשב בעובדה שמספר חיבורים אפשריים בתוך קבוצה של נוירונים גדל באופן פרופורציונלי לריבוע מספר הנוירונים בשאלה. לכן, בזמן שמערכת עם שלוש אלקטרודות מאפשרת בדיקהמופע של עד שישה חיבורים ולרוב הקלטה אחת, הקלטת עשרה נוירונים מאפשר בדיקת ההתרחשות של עד 132 קשרים ולעתים קרובות התבוננות למעלה מתריסר (איור 1). התצפית של עשרות חיבורים בו זמנית מאפשרת לנתח את הארגון של רשתות קטנות ולהסיק מאפיינים סטטיסטיים של מבנה הרשת שלא יכול להיות נחקר אחר ^1. יתר על כן, גירוי מדויק של תאים רבים גם מאפשר כימות של גיוס של תאי postsynaptic ^2.

פרוטוקול

1. הכנת ציוד

1. מניפולטורים שליטה ממחשב
   1. חברו כל תיבת בקר micromanipulator למחשב באמצעות יציאות טוריות (RS-232).
   2. ליישם את הפקודות למיצוב, ביצוע שאילתות ולהתאים את הגדרות לשליחה באמצעות היציאה טורית. בעיות מהירות ותאימות חומרה לאור C / C + + מומלצת כשפת תכנות.
   3. סטנדרטיזציה של מערכת ההתייחסות של מניפולטורים כך שאפס הוא המיקום הקרוב ביותר האפשרי ביחס למנועים והתנועה חיובית מופנה הרחק מהמנועים.
   4. מקם את המיקרוסקופ במיקום המרכזי שלו 2 מ"מ מעל מישור מוקד הדגימה (קואורדינטות [0, 0, 2000]).
   5. חנות, לכל מניפולטור, הקואורדינטות המקומיות המאפשרות את קצה פיפטה להיות שנצפה במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ. זוהי נקודת ההתייחסות הראשונית לכל אלקטרודה.
2. Visuaעמדות אלקטרודה ליזה. זה מאוד שימושי כדי להיות מסוגל לעקוב אחר המיקום של כל אלקטרודה במהלך ניסוי. ייצוג גרפי הוא הדרך האינטואיטיבית ביותר להשיג זאת. לשם כך מערכות ההתייחסות של כל אלקטרודה וזו של המיקרוסקופ חייבת להיות מתאים. דרך פשוטה לבצע זאת היא:
   1. להביא את הקצה של אלקטרודה למרכז שדה הראייה.
   2. אחסן את העמדה בכל ציר של מניפולטור וכל ציר של המיקרוסקופ.
   3. Execute עם ציר ה-x של מניפולטור תנועה גדולה יחסית (1 מ"מ).
   4. אתר את הקצה פעם נוספת נע רק במיקרוסקופ.
   5. חישוב ההפרש בעמדת מיקרוסקופ שכן הוא נמדד אחרון. אלו הן התחזיות של תנועת ציר האלקטרודה על גבי צירי מיקרוסקופ.
   6. חזור על שלבים 2.3-2.5 עבור Y ו-Z צירים של מניפולטור האלקטרודה. זה מאפשר מטריצה ​​של תחזיות על מיקרוסקופ גרזנים שייקבע ( איור 2) המכונה גם מטריצת קוסינוס:
      
   7. הפוך את המטריצה ​​הזאת כדי להפוך אותו ניתן לחשב את התנועות, בשלושת ממדים, הנדרשות על ידי מניפולטור האלקטרודה להגיע למיקום נתון במיקרוסקופ מערכת קואורדינטות:
      
   8. שימוש בנקודת ההתייחסות הראשונית ומטריצת קוסינוס לקבוע את המיקום של כל אלקטרודה במיקרוסקופ קואורדינטות.
   9. להציג באופן גרפי, המבוסס על מיקרוסקופ קואורדינטות, את עמדתו של כל אלקטרודה במרווחי זמן קבוע. אנחנו בחרנו להשתמש C / C + + וספריות ציור (GDI +) לצייר עמדות אלקטרודה כל 40 msec.
   10. חזור על השלבים 1.2.1 - 1.2.7 בכל פעם שזוויות מניפולטור משתנות או אם שינויי עמדתו של מספר מילימטרים יש צורך, למשל, כאשר הסוג של אלקטרודה הוא שונה.
3. לאפשר אחסון positioNS של תכונות רלוונטיות ברקמה, כגון תאים או נקודות התייחסות אנטומיים, במיקרוסקופ קואורדינטות.
4. לרכוש וידאו ותצוגת מידע רלוונטי.
   1. מכאני ליישר את ציר x של תנועה של מיקרוסקופ עם הציר האופקי של המצלמה מיקרוסקופ.
   2. התקן במחשב framegrabber עם וידאו חי ויכולת כיסוי וערכת פיתוח תוכנה (SDK).
   3. ליישם פעולת תצוגת וידאו חי עם SDK.
   4. המרת מיקרוסקופ מערכת קואורדינטות למערכת התייחסות מצלמה על ידי התרגום ואת קנה המידה המתאים.
   5. צייר את התכונות הרלוונטיות בקואורדינטות מצלמה וכיסוי על הווידאו החי התמונה הנוצרת במרווחי זמן קבועים של כ -40 אלפיות שניים (איור 3).
5. מגברי שליטה.
   1. השתמש בתוכנת המגבר לשלוט בהגדרות המגבר מהממשק.
6. שיתוףntrol oscilloscopes.
   1. חבר את אוסצילוסקופ למחשב באמצעות יציאות טוריות.
   2. לקבוע את קנה המידה אוסצילוסקופ, צימוד והחלטה זמנית לשלבים השונים של הליך תיקון מהדק במתח-clamp (למשל האלקטרודה באמבטיה, היווצרות חותם, תצורת כל התא) ונוכחי מהדק.
   3. שלח את פקודות הגדרת אוסצילוסקופ המתאימות בכל פעם שפקודות מגבר מונפקות מהממשק.
7. לחץ פיפטה שליטה.
   1. להרכיב מערכת בקרת לחץ פי איור 4.
      1. השתמש בספק כוח 12 V / 5 V כדי לספק לכל רכיב אלקטרוני כראוי.
      2. חברו את היציאה של משאבת קרום אחד למאגר החיובי לחץ (מיכל מיליליטר 100).
      3. חבר את ההזנה של משאבת קרום אחד למאגר השלילי לחץ (מיכל מיליליטר 100).
      4. חבר את צינורות בעל פיפטה לחיישן לחץ בpressuמחדש מערכת בקרה וסתום פנאומטי המתחבר לתא הלחץ העיקרי.
      5. חברו כל אחד ממאגרי הלחץ לשסתום המחובר לתא הלחץ העיקרי.
      6. חבר שסתום בין תא הלחץ העיקרי ואת האווירה.
      7. חבר חיישן לחץ לתא הלחץ העיקרי.
      8. חבר חיישן לחץ לכל מאגר.
      9. חבר את מערכת בקרת לחץ ללוח רכישת נתונים.
      10. לחבר כל חיישן לחץ לאחד קלט אנלוגי.
      11. חברו כל שסתום ליציאה דיגיטלית.
   2. הסר את לחץ אטמוספרי לקזז מכל החיישנים על ידי פתיחת כל השסתומים, למעט אלו מתחברים למשאבות הקרום והפחתת הלחץ שנמדד.
   3. ליישם שליטה בלחץ
      1. להגדיר בממשק שליטה להפעלה או ביטול הפעלת שליטת לחץ חיובי עבור כל פיפטה.
      2. הגדרת לחץ חיובי מינימאלי לפיפטהים של כ -70 mbar.
      3. מעת לעת (בכל שנייה 0.5) לזהות בכל פעם שהלחץ בטפטפות תחת שליטה בלחץ פעילה יורד מתחת לסף שנקבע.
      4. עם מעבר סף לפתוח את חיץ לחץ החיובי לתא הראשי לחץ ותא זה לכיוון פיפטה בשאלה במהלך פרקי זמן קצרים (20 אלפיות שנייה) עד שלחץ בטפטפות הוא מעל לסף. סגור את כל שסתומים אחרים.
      5. De-להפעיל לחץ שליטה נוספת כמו הגישה הסופית לכיוון תא של עניין היא יזמה.
   4. החל לחץ שלילי להיווצרות חותמת
      1. סגור את כל השסתומים ולפתוח את שסתום חיץ לחץ השלילי כלפי התא הראשי לחץ ותא זה לכיוון פיפטה בשאלה למשך הנסיין דורש על ידי שמירה על כפתור נלחץ.
8. רכז את הפקודות על גבי מכשיר ממשק אדם.
   1. חבר wirele זמין מסחריgamepad ss למחשב.
   2. ליישם readout מעמד ג'ויסטיק. לדוגמא, השתמש בספריות DirectX עבור C / C + + לבצע קריאות כל 5 אלפיות שניים.
   3. להשוות את מצב הנוכחי עם מצב קודם כדי לזהות אילו כפתורים כבר נלחצו, שוחררו או שמרו נלחצו מאז צעד בפעם האחרונה.
   4. להקצות פונקציות לכל כפתור בgamepad. דוגמא למיפוי זה מוצגת באיור 5.

2. נוהל תיקון מהדק

1. הכן את פרוסות המוח של האזור של עניין.
2. מניחים פרוסת מוח של עניין, עם האזור של עניין במרכז טווח התזוזה של מיקרוסקופ.
3. בחירת תא
   1. לזהות תאים של עניין על ידי גלישה עם מיקרוסקופ. לאחסן את המיקום של התאים בהתבסס על מיקרוסקופ מערכת קואורדינטות עם קליק ימני בעכבר על תצוגת וידאו בשידור החי בחלקו העליון של התא של עניין.
   הממשק הגרפי יציג את התאים שנבחרו, כמו גם micropipettes לסקירה ותוכנה גלובליות יוסיף סמן על מיקום התא שיהיה מעולף על התמונות. בנוסף תמונה של התא הוא נתפס לשימוש עתידי בקובץ 'תא #. Jpg'.

ייחוס של תאים לטפטפות

1. לאחר בחירת התאים של עניין, להקצות שפיפטה תתעד כל תא. הממשק הגרפי מספק בקרות משימה שצריכה להיות מוגדרת. דמיין תצוגה מקדימה של התצורה הסופית על ידי בחירת 'פוזיציות סופיות הצג "תיבת הסימון.
2. בחר כל פיפטה שלתצוגה המקדימה עמדתו הסופית היא רצויה או סמן את התיבה 'בחר הכל'. השבת את תצוגת המיקום הנוכחית להדמיה טובה יותר במידת הצורך.

הכן את פיפטות

1. מלא טפטפות (6 - 8 MΩ הם בדרך כלל הכי טוב אם טפטפות רבים משמשות) wiה פתרון תאית ומעלה אותם לבעליהם. הנח את headstages בקיבעונות שלהם, אבל לא להחליק אותם קדימה כדי להימנע מלגעת באמבטיה עם קצה פיפטה.
2. אפשר לשלוט בלחץ החיובי ולבחור את כל טפטפות, כדי להבטיח שהעצות תישאר נקיות. חלק בעדינות כל headstage במקום.

איתור הטיפים פיפטה

1. מקם את המיקרוסקופ למיקום מרכזי עם פוקוס 3 מ"מ מעל הפרוסה על ידי לחיצה על כפתור R2 תוך כדי לחיצה על כפתור 'A'. השתמש במיקום המתאים לכל מניפולטור כפי שהוא מאוחסן מהניסוי הקודם על ידי לחיצה על כפתור L2 תוך כדי לחיצה על כפתור א
   הערה: בשלב זה לא אמור להיות או צל ייחודי של פיפטה בתצוגה או תנועה קטנה לאורך הציר של פיפטה צריכה להיות מספיק כדי להתבונן בה ברוב המקרים. פיצויים להבדלים קלים בצורת פיפטה צריכה להתבצע באופן ידני.
2. להביא את קצה פיפטה אל מוקד. הנח את הקצה בנקודה המרכזית האדומה של תצוגת וידאו מבלי להזיז את המיקרוסקופ (זה עדיין צריך להיות במיקום [0, 0, 2000]).
3. ליידע את התוכנה שפיפטה היא במרכז התצוגה על ידי לחיצה על Z כפתור תוך כדי לחיצה על כפתור C. לאחר כל קצה פיפטה ממוקם, לשלוח פיפטה שאחורה, כך שהפעולות הבאות יכול להיות ממוקם על ידי לחיצה על כפתור L1 אחד תוך כדי לחיצה על כפתור א

מתקרב לתאים

1. ברגע שכל הטיפים פיפטה אותרו במדויק וכל פיפטה מיוחסת לתא, באופן אוטומטי למקם טפטפות הקרובה לתאים שלהם. פשוט לחץ לחיצה ימנית במרכז הקבוצה של תאים ובחר את 'האשכול' האפשרות בתפריט הקופץ. בחלון אפשרויות אשכול שיופיע, בחר את כל טפטפות שברצונך למקם בשלב זה ולחץ על "לכו עם כל טפטפות בדקה '. חזור על פעולה זו עבור כל מקבץ של תאים של עניין.
2. פrform הגישה הסופית באופן ידני. עמדתו של טפטפות ביחס לתאים יכולה להיות מוגדרת באופן שונה, אך בדרך כלל היא פשוט 200 מיקרומטר הרחק מהתא בציר של פיפטה ו200 מיקרומטר מעליו בכיוון האנכי, וזה מספיק כדי לשמור על הקצה של פיפטה מחוץ לרקמה . חכה עד שהמיצוב של טפטפות הוא סיים ולהעביר את המיקרוסקופ כלפי טפטפת על ידי לחיצה על כפתור R1 תוך החזקת הכפתור C.
3. לכייל מחדש כל עמדת פיפטה על ידי התמקדות מיקרוסקופ על קצהו בכל מקום בתצוגת הווידאו ולחיצה על כפתור B תוך החזקת הכפתור ג רשת רבועה אמור להופיע לזמן קצר המציין את המיקום המזוהה של טפטפת. אם המיקום אינו נכון, למקם את הקצה בנקודה של Z תצוגת וידאו ולחץ על הלחצן המרכזי תוך כדי לחיצה על כפתור C.

לקבוע את התצורה המצורפת התא

1. ודא שהתא של עניין לפיפטה הנוכחית הוא בצורה נכונהמסומן. אחרת להזיז את המיקרוסקופ כך שיתאים לתא של עניין עם הנקודה האדומה המרכזית. מארק התא על ידי לחיצה על כפתור Y תוך כדי לחיצה על כפתור C. לחץ על כפתור L2 תוך החזקת C כפתור למצב את פיפטה 200 מיקרומטר הרחק מהתא שהוקצה לו, את המיקרוסקופ באופן אוטומטי לעבור למיקום המתאים.
2. התאם את מיקום פיפטה כך שיתאים לנקודה האדומה. התאם את פיפטה קוזזה על ידי לחיצה על כפתור R1 תוך כדי לחיצה על כפתור X.
3. הפעל את דופק הבדיקה על ידי לחיצה על כפתור L1 תוך כדי לחיצה על כפתור X. לאט לאט מתקרב לפיפטה לתא המיוחס שלו.
4. לאחר התבוננות ביצירת גומה על פני הממברנה של התא להחיל דופק קצר של לחץ שלילי על ידי לחיצה על כפתור Y תוך כדי לחיצה על כפתור Z כדי לאפשר ללחץ מופעל כדי להגיע לתא. פוטנציאל החזקה של כ-65mV צריך שהוקם בשלב זה על ידי לחיצה על כפתור L2 תוך כדי לחיצה על כפתור X.

תצורת כל התא

1. ברגע Giga-חותם נוצר עבור כל תא, להתחיל פקיעת הקרומים על ידי הפעלת לחץ שלילי.

לבצע הקלטות

1. השתמש במערכת גירוי / הרכישה לבצע ההקלטות שלך. החל פולסים או רכבות של פולסים בתא אחד בודד בכל פעם ולבחון את תגובות בתאים שנותרו למפה קישוריות בין התאים המוקלטים.

נסוגים טפטפות

1. ברגע שהקלטות שתסיים, נסוגים טפטפות לאט מהרקמות על ידי לחיצה ימנית ברדיו בלחיצת הכפתור בלוח. בחר 'מיקרומטר לסגת-> פיפטות 500' יש טפטפות לסגת מרחק קצר לאורך הצירים שלהם. שים לב להיסחף בפוטנציאל של התאים (ניקוי הטיפים על ידי יישום כמה לחץ חיובי עשויים לעזור).
2. לסגת טפטפות כל הדרך חזרה, לקבוע את מהירות מיצוב ל'מהיר 'ולחזור על אותה הפעולה, אבל לבחור את' הכול '. הסר את השימושטפטפות בעדינות על ידי הזזה את headstages ופותח את טפטפות מהמחזיקים. זה שימושי כדי למנוע מסובב את המחזיקים בארובות שלהם מאז זה יכול מאוד להפריע לעמדת קצה פיפטה.

תוצאות

בעקבות השיטות שתוארו לעיל הצלחנו בביצוע הקלטת כל התא של עד שנים עשר נוירונים בו זמנית, כמעט ואכפיל את המספר הגדול ביותר של תאי עצב בו זמנית ובכך מרחיק הידק התיקון. דוגמאות לרשתות של קשרים סינפטיים ישירים בין פירמידת נוירונים נרשמו בשכבת V של הקליפה החושית של חולדות מוצגות באיור 6.

קביעת פרופילי הסתברות חיבור כפונקציה של מרחק בין גופני לתאים מסוג מסוים היא מדידה אופיינית של עניין שניתן לבצע ביעילו...

דיון

שאלה מיידית שעולה בדרך כלל בדבר שיעור הצלחה של ההליך שתארנו מ. לשיעורי הצלחה גבוהים הכנה היא חיונית. טפטפות חייבת להיות פתחי קצה שנחשבים כמספיקים לאדם התאים שנרשם. סינון הפתרון תאיים, כדי למנוע טפטפות הסתומה הוא גם חשוב. טפטפות מאוד נקייה, טרי משכה הן דרישה אחרת. התפלגות הבינומית היא הדגם הפשוט ביותר שניתן להשתמש בם כדי להבין כיצד נושאים אלה משפיעים על התשואה הסופית. זה סביר לצפות הנסיין עם ניסיון וציוד מתאים כדי להשיג שיעור הצלחה של 80% או יותר בהקלטת נוירונים בודדים עם משוב חזות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ	אולימפוס	BX51WI	40X מניפולטורים אובייקטיביים טבילה
	Luigs Neumann	SM-5	פרוטוקול טורי בשימוש
מגברים	אקסון	MultiClamp 700B	SDK משומש
מצלמה	עד פוטוניקה	VS 55	BNC פלט אנלוגי
תופס מסגרת	תרגום נתונים	DT3120	SDK בשימוש
אוסצילוסקופים	Tektronix	TDS 2014	תקשורת טורית
רכישת נתונים	InstruTECH	ITC 1600
רכישת נתונים	National Instruments	PCI-6221	ספרייה בשימוש (.dll)
שסתום לחץ	SMC	SMC070C-6BG-32
חיישן לחץ	Honeywell	24PCDFA6G
ממברנה משאבת	Schego	אופטימלית