מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

סיכום

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

תקציר

יעילות קביעת המונים של חלבונים היא קריטית להרבה מחקרים ביולוגיים (למשל לחקירות ביולוגיה מבניות). קביעת מסה מדויקת מאפשרת לאדם להעריך את נכונות רצפים עיקריים חלבון, הנוכחות של מוטציות ו / או לאחר translational שינויים, השפלה ניתן חלבון, הומוגניות המדגם, ואת מידת שילוב איזוטופ במקרה של תיוג (תיוג C למשל ¹³ ).

ספקטרומטריית מסת יינון electrospray (ESI) (MS) היא בשימוש נרחב לקביעת מסה של חלבונים מפוגלים, אבל היעילות שלה מושפעת מהרכבו של חיץ המדגם. בפרט, נוכחותם של מלחים, חומרי ניקוי, ומזהמים פוגעת קשה ביעילותו של ניתוח חלבון על ידי ESI-MS. MS desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) הוא חלופה אטרקטיבית, בשל סובלנות מלחה והפשטות של רכישת נתונים וinterpretation. יתר על כן, קביעת המסה של חלבונים הטרוגנית גדולים (גדול יותר מ100 KDA) היא קלה יותר על ידי MALDI-MS בשל היעדר חפיפת הפצות מדינת תשלום גבוהות אשר נמצאות בספקטרום ESI.

כאן אנו מציגים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר 100 kDa ידי MALDI פעמי של טיסה (TOF). אנו מדגימים את היתרונות של שימוש בתערובת של שתי מטריצות (חומצה כלומר 2,5-dihydroxybenzoic וחומצת α-Cyano-4-hydroxycinnamic) ואת התועלת של שיטת השכבה דקה גישה לתצהיר מדגם. כמו כן נדונונו בתפקיד הקריטי של המטריצה ​​וטוהר ממס, של הסטנדרטים המשמשים לכיול, של אנרגיית הלייזר, וזמן הרכישה. בסך הכל, אנו מספקים מידע הכרחי למתחילים לניתוח חלבונים שלמים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מבוא

ביולוגיה מבנית מסתמכת על הייצור של חלבונים באיכות גבוהה ^1, ולכן צריכה להיות בשילוב עם טכניקות יעילים ואמינות ^ל2,3 ניתוח חלבון. בספקטרומטריית מסת מעבדה (MS) במכון לביולוגיה מבנית שאנחנו צריכים לאשר את הרצף ראשוני של חלבונים, להעריך את הנוכחות של מוטציות ושינויי posttranslational, הפירוק של חלבונים, את ההומוגניות המדגם, ואת האיכות של תיוג איזוטופי (למשל deuterated חלבונים ללימודי תהודה מגנטיים גרעיניים ^4). מאז ביולוגים מבניים להשתמש proteolysis המוגבל להבחין תחומים מבני נוקשה מחלקים גמישים, אנחנו צריכים לאפיין באופן מהימן חלבונים קטומים כגון שימוש בטרשת נפוצה.

כאשר ביומולקולות מנותחות על ידי MS, שתי גישות אפשריות מנוצלים לionise ברכות מולקולות כבדות ויציבות כזה. יינון electrospray (ESI) ionises מולקולות ישירותשלב ⁵ נוזלי; יינון בסיוע מטריקס desorption הלייזר (MALDI) דורש כי ביומולקולות הן שיתוף התגבש עם מולקולות סופג אולטרה סגול אורגניות (כלומר מטריצת מולקולות) ^6.

(TOF) MS ESI הזמן של הטיסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית הפכה טכניקה שגרתית לניתוח חלבונים שלמים, משום שהיא מאפשרת קביעת מסה ברמת דיוק גבוהה (≤ 50 עמודים לדקה). עם זאת, הוא די רגיש להרכב של חיץ המדגם (בפרט למלחים וחומרי ניקוי) ומזהמים (כלומר פולימרים) שהם לפעמים קשים כדי לחסל, וגרמו לדיכוי של אות אנליטי.

MALDI-TOF MS מייצג אלטרנטיבה יעילה לESI-MS כי ביצועיה מושפעים פחות רכיבי חיץ, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים, ומאפשר קביעת מסת חלבון שלם עם דיוק מספיק (≤ 500 עמודים לדקה) לאימות רצף. לאחר protein עיכול, MALDI-TOF MS יכול להיות מנוצל גם כדי לנתח את הפפטידים שהושגו לאישור רצף העיקרי עוד יותר על ידי מה שנקרא "טביעת האצבע ההמונית פפטיד".

בידיים שלנו, קביעת המסה של חלבונים שלמים, שהם גדולים יותר מ100 kDa והטרוגנית (עקב שינויים או truncations), היא קלה יותר על ידי MALDI-MS מאשר על ידי ESI-MS. זאת בשל המחסור בהפצות מדינת תשלום חופפות הווה בספקטרום ESI. יתר על כן, מאז תהליך MALDI אינו תלוי בגודל אנליטי ^7, הרגישות גבוהה תשואות שיטה כזו כאשר מסת biomolecule היא מעל 100 kDa. ניתוחים מופלאים של חלבונים שלמים בוצעו באמצעות מכשירים מתוצרת בית בין סוף -1980 ותחילת 1990 של ^8-11.

MALDI-TOF יכול לשמש גם ככלי מיון כדי להעריך את האיכות של דגימות חלבון מכיוון שהיא דורשת פחות זמן להכנת מדגם, והוא פחות רגיש לinterferenCES בשל זיהומים נפוצים (למשל מלחים). לאחר הערכה ראשונה, מהירה ידי MALDI-MS, מדגם ניתן לנתח עוד יותר על ידי ESI-TOF לקבוע המסה שלו עם דיוק גבוה יותר. יתר על כן, MALDI מייצר יונים המכילים פחות חיובים מאשר ESI ולכן רכישה ופרשנות הנתונים MALDI הוא יותר פשוט. זה מאפשר לסטודנטים לעבוד בביולוגיה מבנית לניתוח החלבונים רקומביננטיים שלהם רק לאחר הכשרה קצרה.

גורמים מרכזיים שני משפיעים על איכות ספקטרום MALDI: מטריקס ואת הטכניקה המשמשת לתצהיר המטריצה ​​(אגל למשל מיובש ⁸ ושכבה דקה ^{12-16,17,18).} מטריצה ​​אורגנית אחת [לדוגמא: חומצת sinapinic (SA) ^19-21 או α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (α-CHCA) ^14,22,23] משמש לעתים קרובות לבחינת הטרשת הנפוצה של חלבונים שלמים וקומפלקסי חלבונים צולבים . באמצעות α-CHCA, קבוצת חייט הציגה פרוטוקול מפורט עבור p בעברreparing שכבה דקה במיוחד לפני ניתוח MALDI של חלבונים מסיסים וקרום ^14,15. לאחרונה, גורקה et al. מאויר ציפוי היעד מבוסס גרפיט כדי לשפר את ניתוח MALDI של פפטידים וחלבונים באמצעות α-CHCA כמטריצה ^​​24.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לניתוח חלבונים שלמים על ידי MALDI-TOF MS, ניצול תערובת של שתי מטריצות: חומצת 2,5-dihydroxybenzoic (DHB) וα-CHCA ^25. אנחנו באופן שיטתי הערכנו את הביצועים של תמהיל DHB-CHCA לעומת מטריצות SA ו α-CHCA, לבקרה של חלבונים שלמים. תערובת המטריצה ​​מאפשרת רזולוציה טובה יותר (כלומר פסגות החלבון הן הרבה יותר חדות). יתר על כן, נוכחותם של יוני חיובים מרובים אינטנסיביים (כלומר M ⁺² H ^{2 +,} M +3 H ^{3 +,} וכו ') מאפשר קביעת מסה מדויקת יותר בגלל הרזולוציה של מכשירי MALDI-TOF הצירי היא גבוהה יותר במסה נמוכה יותר על פני תשלום (מ '/ z) ^26. התכונה זו שימושית במיוחד לקביעת המשקל המולקולרית של חלבונים גדולים יותר מאשר 100 kDa.

רגישות גבוהה יותר גם הגיעה באמצעות תערובת DHB-CHCA (0.5 pmoles של חלבון הבחין ביעד MALDI).

כפי שהזכרנו לעיל, גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​השימוש במכשיר MALDI הוא בתצהיר המטריצה. Laugesen et al. הציע את השימוש בתערובת DHB-CHCA בפעם הראשונה ^25, תוך ניצול תצהיר הטיפה היבש. עם זאת, ראו תוצאות טובות יותר (לדוגמא: רגישות גבוהה בהרבה) כאשר אנו מנוצלים בשיטת השכבה דקה שבו השכבה הראשונה נוצר על ידי α-CHCA מומס באצטון. ^12,27 שיטת השכבה דקות מרמז על היווצרות תשתית הומוגנית של גבישי מטריקס על יעד MALDI, שתואר בוידאו יופיטר בעבר ^15. ואז, המדגם הוא שהופקד על תשתית זו, ובסופומטריצה ​​נוספת שהופקדה (ראה להלן). במאמר זה, אנחנו גם מדגימים כיצד להפקיד את המדגם על יעד MALDI, אלא גם איך לנקות היעד ^15, לrecrystallize, ולהכין את המטריצות.

לסיכום אנו שואפים לספק את כל המידע הדרוש לניתוח חלבונים שלמים למדענים (בפרט, ביולוגים מבניים) שצריך כדי להעריך את האיכות של חלבונים המיוצרים באופן מהיר ופשוט ושלא כל כך מכיר את MALDI-TOF MS. כפי שחזה באמצע 1990 ^28, MS יש לו השפעה מוגברת על מחקר ביולוגי, כמו הנגישות שלה לביולוגים גדלה. אנו מקווים כי את המידע שהעברנו יהיה שימושי כדי להפוך MALDI-TOF נגיש לביולוגים ומדענים שרוצים להתחיל להשתמש בספקטרומטריית מסה.

פרוטוקול

1. לדוגמא הכנת חלבון: הצפת ערך (אופציונאלי)

5-25 μl של ריכוזי מייקרו של חלבון (1-20 מיקרומטר) הם הכרחיים. חילופי חיץ יכולים להתבצע באמצעות מכשירי אולטרה הצנטריפוגלי (למשל Vivaspin, סארטוריוס) או עמודות סינון ג'ל microcentrifuge (למשל, 6 עמודות כרומטוגרפיה Bio-ספין מיקרו, Bio-Rad) ^29,30. ניתן לחזור על צעדי חילופי חיץ 2-3x. תיאור מפורט של חילופי חיץ הוצג בעבר ^29,30. לדוגמא, אנו מנצלים 20 טריס מ"מ pH aminomethane (hydroxymethyl) (כלומר טריס) 8 כחיץ סופי.

הערה: שלב זה יכול להיות מושמט במקרים רבים. צריכה להתבצע זה החוצה כאשר מדגם חלבון מכיל מולקולות או מאגרים שיכולים מאוד להפריע לגילוי טרשת נפוצה [לדוגמא: גליצרול; 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה, HEPES]. זה גם שימושי כדי לשפר את quality של הספקטרום.

2. גיבוש מחדש של מטריצות על מנת לשפר את הטוהר שלהם (אופציונאלי)

1. יוצקים 10 מיליליטר של 40% אתנול (EtOH) לתוך בקבוק פיירקס.
2. הוספת 600 מ"ג של מטריקס.
3. שימוש באמבט מים ותנור התנגדות, לחמם את פתרון המטריצה ​​ומערבבים אותו עד שהוא נמס לגמרי המטריצה ​​באמצעות מוט זכוכית או בוחש מגנטי.
4. חזור על שלב 2 עד שיש לך פתרון רווי.

הערה: שימוש בכמויות גדולות מדי של ממס או המסת המטריצה ​​הרבה מתחת לנקודת רתיחת הפתרון תגרום תשואה ירודה של גבישים או לא גבישים בכלל.

5. אפשר הפתרון להתקרר באיטיות. אתה יכול להשאיר אותו בטמפרטורת חדר במשך כמה שעות ולאחר מכן ב 4 ° C למשך לילה. הערה: אם לא נוצרים גבישים, התגבשות יכולה להיגרם על ידי מגרד את החלק הפנימי של הכוס (ממש מתחת לפני השטח הפתרון) באמצעות מוט בחישת זכוכית.
6. לאסוף את גבישי מטריצה ​​על ידי סינון.
7. יש לשטוף את הגבישים עם כמות מינימאלית של ממס קר כקרח ותסנין אותם.
8. לאפשר את הגבישים לייבוש. אתה יכול להשתמש בואקום לצעד זה.

3. ניקוי של MALDI נירוסטה יעד

1. יש לשטוף את צלחת MALDI עם מתנול (MeOH) ולנגב בעדינות עם רקמת ניקוי שנעשתה במיוחד עבור יישומים במעבדה (למשל Kimwipe).
2. יש לשטוף את היעד עם H ₂ O ולנגב אותו עם רקמת ניקוי.
3. הכנס את צלחת MALDI בכוס 600 מ"ל ולכסות אותו עם 50% EtOH.
4. Sonicate היעד בפתרון EtOH עבור 10 דקות באמבטיה קולי.
5. אם יש שאריות שנותרו על הצלחת, חזור על השלבים 1-4 שוב.
6. לבסוף, יש לשטוף את היעד עם MeOH (או במים, ראה הערה בהמשך), להטות אותו באופן שכל הנוזלים שנאספו ברקמות ניקוי. בואו יבש היעד בטמפרטורת חדר או באמצעות חנקןזרימת גז.

הערה: הליך דומה תואר ¹⁵ בעבר.

הערה: הממס (MeOH או מים) המשמש לשטיפה האחרונה של היעד קובע כמה תכונות יעד. אם המטרה היא שטף עם MeOH, המדגם מתפשט על המטרה הרבה יותר מאשר בעת שימוש במים.

4. פתרון שכבת α-CHCA דק: הכנה והפקדה על יעד MALDI

1. ממיסים α-CHCA באצטון על מנת להפוך את הפתרון רווי.
2. ביד (ללא כל פיפטה) טובל את קצה μl 10 (למשל GELoader עצה, Eppendorf) בתמיסה רוויה α-CHCA: כמות קטנה של הפתרון תזרום בקצה (בשל נימיות).
3. לגעת בקצב מהיר מאוד (1 שניות כלומר) יעד MALDI עם קצה פיפטה ולהפקיד את פתרון אצטון α-CHCA על יעד MALDI. זה יהווה השכבה דקה מטריקס, שבו החלבוןמדגם יופקד. נסה ליצור נקודה קטנה ככל האפשר שכבה דקה.

הערה: בעת שימוש בSA כמטריצה, אנחנו מכינים את שכבה דקה באמצעות תמיסה רוויה של SA באצטון.

5. הכנה של פתרונות natrix: SA, α-CHCA, DHB ותערובת CHCA_DHB ²⁵

1. הכן פתרון 20 מ"ג / מיליליטר SA בACN, 0.1% TFA (70:30, כרך / כרך).
2. הכן 20 פתרון מ"ג / מיליליטר α-CHCA בACN ו5% חומצה פורמית (70:30, כרך / כרך) [בשם כמו "פתרון α-CHCA"].
3. הכן 20 מ"ג / מיליליטר פתרון DHB בACN ו0.1% חומצת trifluoroacetic (TFA) (70:30, כרך / כרך) [בשם כמו "פתרון DHB"].
4. מערבבים את "פתרון α-CHCA" ו "פתרון DHB" ב1:1 (כרך / כרך), כדי לקבל את "פתרון CHCA_DHB".

הערה: אפשר לערבב "פתרון α-CHCA" ו "פתרון DHB" ביחסים שונים, בעת ניתוח חלבונים עם המסה פחות מ 100 kDa. לexample יחס של 40:60 בין α-CHCA וDHB (כרך / כרך) מניב ברזולוציה טובה יותר, אבל פחות רגישה (ראה דיון).

6. הפקדת לדוגמא על יעד MALDI

1. μl 0.5 ההפקדה של מדגם החלבון על השכבה דקה α-CHCA שהוכנה קודם לכן. מייד לאחר מכן, להוסיף 0.5 μl של פתרון המטריצה ​​(כלומר פתרון SA או פתרון α-CHCA או "תערובת CHCA_DHB"). משמעות הדבר הוא ערבוב המדגם ומטריקס על המטרה.

הערה: בדרך כלל אחד מערבב את דגימת החלבון עם מטריצת ביחס של 1:1. יחס זה הוא קריטי לאיכות טובה של ספקטרום MALDI. אם אתה רוצה לבדוק את ריכוזי מדגם שונים, אתה יכול להשתמש בפתרון ACN_formic החומצה (כמתואר לעיל) כדי לדלל את המדגם.

הערה: אם אתם מעדיפים, אתם יכולים לערבב את המדגם ומטריקס בצינור ולאחר מכן להפקיד מעורב "sample_matrix solution "בשכבה דקה.

שים לב: אנו ממליצים לך לבדוק ריכוזי מדגם שונים בגלל דילול המדגם מאפשר לך להפחית את ההתערבות של חומרים מזהמים. כדי לדלל את המדגם, אתה יכול להשתמש בפתרון ACN_formic החומצה (כמתואר לעיל) כדי לדלל את המדגם.

7. Calibrant הפקדת

1. הפקדה 0.5 μl של תקן calibrant (למשל "סטנדרטי חלבון השני", ברוקר Daltonics, ברמן) ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl של פתרון המטריצה.

הערה: טעינת calibrant על ​​צלחת MALDI ליד כתמי חלבון המדגם (ראה דיון).

8. MALDI ספקטרה רכישת Calibrant ודגימות חלבון

לאחר הדגימות וcalibrant הם מיובשים, אתה יכול לראות את "כתמים" תחת מיקרוסקופ. תצפית זו היא אופציונלית ועשויה להיות מעניינת בעיקר למשתמשים חדשים. כדי לרכוש את ספקטרום המדגם, הכנס היעד דואר במכשיר MALDI-TOF ולבחור את הפרמטרים המתאימים אינסטרומנטלי שהם שונים עבור כל סוג של ציוד. כדי לקבל את ההגדרה המתאימה ביותר אחד צריך לעקוב אחר המלצות יצרן. כשיקולים כלליים בעת ניתוח חלבונים שלמים, יש להשתמש במכשיר במצב ליניארי (לא במצב רפלקטור, שהוא מתאים לפפטידים מנתח). בדרך כלל אנו מנצלים המכשיר שלנו במצב חיובי יון. יתר על כן, פרמטר מרכזי הוא "חילוץ יון פעם" אשר משפר את הרזולוציה אינסטרומנטלי ^{ביום 31.} במילים פשוטות, "חילוץ יון פעם" יכול להיות מוגדר כהפסקה בין הדור של יוני המדגם והזמן שבו היונים מואצים לכיוון הגלאי. בעת ניתוח חלבונים שלמים, יש מנוצל "מיצוי פעמו יון" (למשל 500 NSEC) גדול יותר מאשר בעת התבוננות פפטידים (למשל 80 NSEC).

בחר הטווח מ '/ z המתאים, לרכוש את o הספקטרוםו calibrant, ולכייל את המכשיר. כאשר אתה רוכש את הספקטרום של הדגימות שלך, השתמש בעוצמת הלייזר המתאימה (ראה דיון).

תוצאות

ניתחנו חלבון שלם (חלבון אזור כרומוזום תחזוקת 1, Crm1; משקל מולקולרי: 123,386 דא) באמצעות שתי מטריצות שונות, שתי שיטות בתצהיר, ואת אותו עוצמת הלייזר (איור 1). SA ותערובת CHCA_DHB נוצלו כמטריצות. התערובת הניבה ספקטרום המוני של איכות גבוהה יותר במונחים של יחס אות לרעש ורגישות (איורים 1 א 'וב'). בפרט, אנו יכולים לזהות 0.5 pmoles של חלבון שהופקד על יעד MALDI (תרשים 1C). אותה הכמות של חלבון הייתה בקושי לזיהוי באמצעות SA (1D איור). יתר על כן, שימוש בתערובת המטריצות, שיטת בחירה של תצהיר המטריצה ​​הייתה הגישה "שכבה דקה" (איור 1 א). תוך שימוש בשיטת "יבש טיפה", אנחנו לא מזהים כל חלבון עם מסה גבוהה יותר מאשר 100 kDa (מידע לא מוצג). ניצול תערובת CHCA_DHB (איורים 1 א ו 1 ג), מתרבים טעון יון של protein נצפו, המאפשר קביעת המסה עם דיוק גבוה יותר בגלל הרזולוציה השיא במכשירי MALDI-TOF הצירי היא ביחס הפוך למ '/ z ^26.

אנחנו גם ניתחנו בטא galactosidase monomeric (116,300 דא) (איור 2). ספקטרום CHCA_DHB היה טוב יותר מספקטרום SA במונחים של רגישות ורזולוציה. יתרה מזאת, הנוכחות של יונים טעונים להכפיל (ז ^{2 +, 3 +} M ^ו4 M ⁺⁾ אפשרה לנו לאשר את המסה של החלבון עם דיוק גבוה יותר (2A דמויות ו2C). שימוש בגישת השכבה דקה, השווינו את הביצועים של תערובת CHCA_DHB, SA ו α-CHCA לבד לניתוח של אימונוגלובולינים, IgG (148,500 דא) (איור 3). כאשר אנו לתאם את הנתונים השונים, אותות חלבון היו גבוהים יותר ועם רזולוציה טובה יותר בספקטרום CHCA_DHB. לסיכום, השימוש בתערובת CHCA_DHB והשיטה בתצהיר שכבה דקה הפגין שיפור משמעותי באיכות של ספקטרום מסת חלבון הגדול בשלמותה רכש באמצעות מכשיר MALDI TOF.

איור 1. ניתוח MALDI-TOF של חלבון אזור כרומוזום שלם תחזוקת 1, (Crm1), משקל מולקולרי: 123,386 דא. א) pmole 1 של Crm1 נותח באמצעות תמהיל DHB_CHCA כסכום מטריצת B):. Pmole 1; מטריקס: כמות SA ג):. 0.5 pmole; מטריקס: כמות DHB_CHCA D): 0.5 pmole; מטריצה:. SA. האות של הפסגות, המתבטאת בקנה מידת יחידת עוצמת שרירותית, הוא מנורמל לערך הנוכחי המרבי בכל ספקטרום.

pg "src =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/>
איור 2. ניתוח MALDI-TOF של בטא galactosidase שלם (116,300 דא). א) כמות: 20 pmoles; סכום DHB_CHCA המטריצה ​​B):. 20 pmoles; מטריקס: כמות SA ג):. 5 pmoles; מטריקס: כמות DHB_CHCA ד '):. 5 pmoles; מטריקס: SA.

איור 3. ניתוח MALDI-TOF של אימונוגלובולינים שלמים, IgG (148,500 דא); סכום:. 1.7 pmoles הספקטרום שהושג באמצעות תערובת CHCA_DHB היה הרבה יותר אינטנסיבי (מקסימום: 8200 יחידה שרירותית, au) מאשר ספקטרום SA (מקסימום: 1,200 au) וספקטרום α-CHCA (מקסימום: 4500 au)

דיון

הצגנו פרוטוקול פרט לרכישת ספקטרום המוני באיכות גבוהה של חלבונים שלמים גדולים עם משקולות מולקולריות גדולות יותר מאשר 100 kDa, באמצעות מכשיר MALDI-TOF. מספר ההיבטים הקריטיים הנוגעים להכנת המדגם יש לשקול בזהירות על מנת לשפר את האיכות של הספקטרום ההמוני. מטריצות וממסים של טוהר גבוה הם בעלי חשיבות קריטית משום שכל המזהמים המצויים במטריצות והממיסים מרוכזים על מטרת MALDI לאחר אידוי ממס. על מנת לשפר את הטוהר של מטריצות MALDI אפשר לטהר אותם באמצעות שיטות recrystallization קלאסיות (ראה לעיל). אנו ממליצים גם להכנת פתרונות מטריצות טריות (לפחות פעם בשבוע) כדי לשפר את התגבשות המטריצה ​​וכדי למנוע השפלה מטריקס.

גישת תצהיר המטריצה ​​היא קריטית מאוד לאיכות הסופית של הספקטרום. כפי שתואר לעיל, שיטת השכבה דקה היא o השיטה שלנובחירת f ^12. יתר על כן, אנו מותאמים הגישה להפקדת הרובד הראשון. כאשר המטריצה ​​היא מומס באצטון כדי להשיג פתרון רווי, propanone מאפשר אידוי מהיר של הממס, אלא גם עושה את הגודל של השכבה הראשונה קשה מאוד לשלוט. אנו מציעים באמצעות קצה GELoader כמברשת קטנה שאתה טובל בפתרון matrix_acetone כדי לקבל נפח מינימאלי שבו אתה להפקיד במהירות על המטרה. גודלה של השכבה הראשונה איכשהו שולט בגודל הסופי של מקום MALDI: נקודה קטנה (כלומר 0.5-0.75 מ"מ בקוטר) היא עדיפה כי במקרה זה ריכוז המדגם הוא גבוה יותר מאשר במקרה של כתם גדול. קבלת נקודה קטנה שונה מהגישה השכבה דקה במיוחד שהוצעה בעבר בוידאו יופיטר ^15. בFenyo et al. פתרון השכבה הדק היא התפשטה בכל רחבי יעד MALDI באמצעות הצד של קצה פיפטה. גישה זו מחייבת בדיקת השכבה דקה שצריכה לעמוד בקריטריונים מסוימים(למשל מהירות של אידוי ממס). אם הקריטריון הוא לא נפגש, יעד MALDI יש לשטוף וצריכה להיות מוכן בשכבה דקה חדשה. זה הופך את ההכנה מייגע למדי לטירון. יתר על כן, בתצהיר של תערובת מדגם / מטריצה ​​על הצלחת דורש השאיפה של הממס העודף באמצעות קו ואקום ושלב כביסה באמצעות ¹⁵ TFA הוא הכרחי, מה שהופך Fenyo et al. הכנה קצת קשה יותר מהגישה שלנו.

יחס הנפח בין מטריקס לבין המדגם הוא חשוב מאוד עבור ניתוח מוצלח של חלבונים שלמים על ידי MALDI-TOF. לאחר בדיקת יחסים שונים אנו ממליצים להשתמש ביחס של 1:1. מטריצה ​​שונה: חלקם מדגם יכול להתפשר על האיכות של הספקטרום, ככל הנראה בשל התגבשות הומוגניות. הסדר שבו מטריצה ​​ומדגם מופקדים הוא גם קריטי. לאחר הפקדת השכבה דקה מטריקס, המדגם הוא מופקד, ומייד לאחר מכן (לפני sampנקודת le הופכת יבשה) את תערובת CHCA_DHB הוא הוסיף. הליך זה כבר מוגדר "שיטת כריך" ^27, שבו המדגם לבד מופקד בין שתי שכבות מטריצה. כחלופה, פתרון CHCA_DHB והמדגם יכולים להיות מעורב ב0.5 צינור מיליליטר ולאחר מכן הבחינו בשכבה דקה CHCA ^12. זה מניב נקודה בשכבה אחידה של גבישים וכתוצאה מספקטרום באיכות גבוהה. בעת ניתוח חלבונים עם מסה נמוכה מ100 kDa, הריכוז של DHB יכול להיות מוגבר (DHB למשל 60:40: CHCA), זה יכול לייצר שיא חדים, אך עלול לסכן את רגישות המדידה (כלומר, פסגות פחות אינטנסיבית).

לכיול מכשיר נכון, זה הכרחי כדי להפקיד את הסטנדרטים calibrant קרובים מאוד לכתמי מדגם, המאפשר אחד כדי להשיג דיוק מסה טוב יותר. "הליך כיול פסאודו פנימי" הוצע בעבר ^15: לאחר הרכישה של ספקטרום מדגם, אני מקום calibrantירייה של הלייזר והאות של calibrant מתווספות לספקטרום המדגם. זה מאפשר לך באופן פנימי לכייל את ספקטרום המדגם באמצעות פסגות calibrant.

אנרגיית הלייזר צריכה להיות מבוקרת בקפידה גם במהלך רכישת הספקטרום. ברוב המקרים, אנרגיה גבוהה יותר מגבירה את הרגישות, אבל מורידה את הרזולוציה. אנו ממליצים להשתמש באנרגית לייזר המינימום אפשרית מבלי להתפשר על הרגישות של הרכישה. יתר על כן, כדי לשפר את איכות רפאים, אפשר לרכוש יותר יריות על כל נקודת מדגם. בדרך כלל יריות יותר אתה רוכש (1,000-2,000 יריות), גבוה יותר את עוצמת האות. כאשר להכות את המקום עם הלייזר, צריך למצוא את המיקום הנכון (כלומר, "נקודה מתוקה"), שכן המדגם לא מופץ homogenously. אתה יכול לירות באותו האזור עד האות הולכת וגדל, ולאחר מכן לנסות למצוא אזור אחר המכיל את המדגם.

לסיכום, טוהר גבוה של מטריצות וsolvהאנטים, שיטות המשמשות למדגם ומטריצות בתצהיר על המטרה, העמדה בסטנדרטים המשמשים לכיול, את עוצמת אנרגיית לייזר, בעת רכישה (מספר יריות / מקום) הם גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ניתוח חלבונים שלמים על ידי MALDI-TOF MS.

מחבר תרומות

LS וEBE עיצבו את הניסויים, ביצעו ניסויי ספקטרומטריית המסה, ניתחו את הנתונים, וכתבו את כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
טריזמה הידרוכלוריד	סיגמא	T3253
טריזימה	סיגמא	T6066
מיקרו ביו-ספין 6 עמודות כרומטוגרפיה	Bio-Rad	732-6221
Vivaspin 500	Sartorius	VS0122	משקל מולקולרי שונה מנותק
מתנול	פלוקה	14262
אתנול	פלוקה	02860
KIMTECH SCIENCE מגבונים מדויקים מגבי רקמות	קימברלי קלארק	05511
α-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית	סיגמא אולדריץ'	C8982
אצטון	סיגמא אולדריץ'	650501
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית	פלוקה	39319
GELoader Tips	Eppendorf	0030 001.222
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
חומצה פורמית	Fluka	09676
חומצה טריפלואורואצטית	Sigma Aldrich	302031
חלבון Standard II	Bruker Daltonics	207234	הוא מכיל טריפסינוגן, חלבון A, סרום אלבומין-בקר
אימונוגלובולין G	ABSciex	GEN602151
[header]
<חזק>ציוד
מטהר מים PURELAB אולטרה אנליטי	ELGA LabWater	89204-052
מכשיר Autoflex MALDI-TOF	Bruker Daltonics
יעד MALDI-TOF	Bruker Daltonics