מאמר שיטה

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

10.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50639

⸱

10 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

תקציר

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) הוא כלי רב עוצמה לחקר ביופילמים. מעט מאוד מחקרים כימתו בהצלחה התפלגות בו-זמנית של יותר משני רכיבים בתוך ביופילמים כי: 1) בחירה של צבעים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מינימלית היא מסובכת, ו-2) כימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. מטרות: דווח על מתודולוגיה לכימות והשוואה של התפלגויות תלת מימדיות במקביל של שלושה רכיבים תאיים/חוץ-תאיים של ביופילמים הגדלים על מצעים רלוונטיים. שיטות: השיטה מורכבת משלבים נפרדים ומחוברים זה לזה הכוללים צמיחת ביופילם, צביעה, הדמיית CLSM, ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם וניתוח סטטיסטי של פרמטרים מבניים. ביופילמים של Streptococcus mutans (זן UA159) גודלו במשך 48 שעות על דגימות סטריליות של חומרים מרוכבים של שרף Point 4 ו-TPH3. הדגימות הוטבלו לאחר מכן למשך 60 שניות במי פה של Biotène PBF (BIO) או Listerine Total Care (LTO), או במים (קבוצת ביקורת; n=5/קבוצה). ביופילמים נצבעו בפלואורוכרומים עבור חומרים פולימריים חוץ-תאיים, חלבונים וחומצות גרעין לפני הדמיה עם CLSM. הפרמטרים המבניים של ביופילם שחושבו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ISA3D היו נפח ביולוגי ועובי ממוצע של ביופילם. מודלים מעורבים ניתוחים סטטיסטיים השוו פרמטרים מבניים בין מי פה לקבוצת ביקורת (תוכנת SAS; α=0.05). תוכנת Volocity אפשרה הדמיה של הפצות תלת מימד של רכיבי ביופילם (פלואורוכרומים). תוצאות: שטיפת פה BIO ייצרה מבני ביופילם השונים באופן משמעותי מהביקורת (p<0.05) על שני מרכיבי השרף, בעוד ש-LTO לא ייצר הבדלים (p>0.05) באף אחד מהמוצרים. מסקנות: מתודולוגיה זו כימתה והשוותה ביעילות ובהצלחה התפלגויות תלת-ממדיות בו-זמניות של שלושה רכיבים עיקריים בתוך ביופילמים של S. mutans על מצעים רלוונטיים, ובכך התגברה על שני אתגרים להערכה בו-זמנית של רכיבי ביופילם. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לקבוע את יעילותם של חומרים אנטיבקטריאליים/נוגדי עכירות כנגד רכיבי ביופילם מרובים, כפי שמוצג באמצעות מי פה. יתר על כן, לשיטה זו יש יישום רחב מכיוון שהיא מאפשרת השוואה של מבנים תלת מימדיים/ארכיטקטורה של ביופילמים במגוון דיסציפלינות.

מבוא

ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות מובנות העטופות במטריצה חוץ-תאית המיוצרת בעצמה, ומחוברות למשטחים ביולוגיים או אינרטיים1. ביופילמים מייצגים אורח חיים נפוץ עבור חיידקים רבים, ונוצרים על ידי מעבר בשלבים מתאים צפים חופשיים (פלנקטוניים) לקהילות מורכבות מרובות מינים. העמידות המובנית של ביופילמים לחומרים אנטי-מיקרוביאליים היא השורש לזיהומים חיידקיים מתמשכים וכרוניים רבים1,2, כפי שמודגם על ידי ביופילמים אוראליים (רובד שיניים). מיקרואורגניזמים קריוגניים כגון מוטנס, סטרפטוקוק מעבדים סוכרוז ופחמימות אחרות כדי לייצר מטריצה חוץ-תאית וליצור חומצות שעלולות לפרק את מבנה השן ולגרום לעששת. רוב מטריצות הביופילם הן ביופולימרים המורכבים מרכיבים תאיים וחוץ-תאיים כגון אקסופוליסכרידים (EPS), חלבונים וחומצות גרעין3,4.

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), הטכניקה הנפוצה ביותר להדמיה פלואורסצנטית, שינתה באופן קיצוני את ההדמיה האופטית בביולוגיה מכיוון שיש לה את היכולת לאסוף תמונות תלת מימד של מבנים ביולוגיים מיובשים ללא קיבוע5,6,7. טכניקה לא הרסנית זו כוללת איסוף תמונות של חתכים דקים בתוך אזור עניין על הדגימה באופן שמסירים את התרומה של אור לא ממוקד. האיכות והרזולוציה של התמונות שצולמו על ידי CLSM הן מעבר למה שניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבה. חיסרון מרכזי אחד של CLSM הוא שסריקת תמונות מתרחשת בקצב איטי יותר מאשר בטכניקות מיקרוסקופיה רחבות, בהן תמונות שלמות נאספות בו זמנית5. עם זאת, עם מבחר הולך וגדל של פלואורוכרומים, לייזרים ומסננים, CLSM הפכה לאחת הטכניקות הרווחות להדמיה מולטי-ספקטרלית5,7.

מחקרים קודמים הראו ש-CLSM הוא כלי שימושי לבחינת המבנה או הארכיטקטורה של ביופילמים על ידי שימוש בתג פלואורסצנטי אחד או שניים או כתמים כדי לספק הבנה טובה יותר של התפלגות ה-EPS והתאים בתוך ביופילמים, ובמיוחד בתוך המטריצה החוץ-תאית7,8. בתיאוריה, צביעה/תיוג פלואורסצנטי של רכיבים מרובים רצוי לחקר המבנה המפורט והקו-לוקליזציה של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. עם זאת, ניתוח בו-זמני של רכיבים שונים בתוך ביופילמים יכול להיות מאתגר מכיוון ש: 1) בחירה של צבעים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מינימלית היא מסובכת, ו-2) כימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. קולוקליזציה באמצעות מספר פלואורוכרומים מחייבת שימוש בכתמים ספציפיים ביותר עם הפרעות ספקטרליות מינימליות כדי למנוע השפעות דימום, המתרחשות כאשר לשני פלואורוכרומים יש חפיפה משמעותית בשיא הספקטרלי שלהם, מה שגורם לאחד להתרגש חזק יותר מהשני9. באופן אידיאלי, פלואורוכרומים בעלי ספקטרום עירור שאינם חופפים יספקו את התוצאות הטובות ביותר, אולם קשה מאוד למצוא כתמים העומדים בקריטריון זה. במקום זאת, בחירת הכתמים מותאמת על ידי בחירת פלואורוכרומים שספקטרום הפליטה שלהם הוא בעל חפיפה מינימלית, מה שמאפשר לראות את הכתמים בזה אחר זה בתוך פס אורך גל תצפית מוגבל9.

סופר-אימפוזיציה של תמונות פלואורסצנטיות היא כנראה השיטה הנפוצה ביותר להערכת התפלגות בו-זמנית של פלואורוכרומים. קולוקליזציה של הרכיבים השונים מופיעה כחפיפה של צבעים שונים דרך ערוצים מרובים שנוצרו על ידי הפלואורוכרומים הנבדקים10. הכלים להצגת תמונות פלואורסצנטיות מרובות ערוצים כתמונות צבעוניות ממוזגות זמינים ברוב תוכנות CLSM ותוכנות ניתוח תמונות ביולוגיות. למרות שסופר-אימפוזיציה של תמונות שימושית להערכה מרחבית של קו-לוקליזציה, ניתן לבחון את התמונות באופן איכותי רק על ידי ניתוח חזותי. זה מספק כמות מוגבלת של מידע, מכיוון שייצוגים אלה בדרך כלל אינם מועילים לכימות קולוקליזציה בתנאי ניסוי שונים ואינם קובעים אם הקולוקליזציה חורגת מצירוף מקרים אקראי11. מעט מאוד מחקרים עד כה השתמשו בשיטות כמותיות כדי לנתח את המבנה התלת-ממדי של ביופילמים ורכיבי ביופילם, ומעטים עוד יותר כימתו את ההשפעה של טיפולים אנטיבקטריאליים או אמצעים נוגדי עכירות על רכיבי ביופילם.

מטרת מחקר זה הייתה לדווח על מתודולוגיה לכימות והשוואה של ההתפלגות התלת-ממדית בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים. השיטה מורכבת משלבים נפרדים אך קשורים זה בזה הכוללים צמיחת ביופילם, צביעה, הדמיית CLSM של ביופילמים, ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם וניתוח סטטיסטי של פרמטרים מבניים. בדיקת גידול הביופילם מאפשרת גידול ביופילם על מצעים רלוונטיים, ומייצרת מבני ביופילם הניתנים לשחזור. השילוב של צביעה סימולטנית חדשה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין עם מדידת פרמטרים מבניים של ביופילם תלת מימדי מביא להתפלגות ניתנת לכימות של רכיבים בתוך ביופילמים. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם מאפשר הערכה של ביופילמים בתנאי ניסוי ספציפיים (למשל לאחר טיפול במי פה), כפי שיתואר בסעיף הבא.

פרוטוקול

1. הכנת מצעים וריאגנטים

  1. הכינו 300 ml של מצע גידול לתרבית לילה (THY; 3% Todd Hewitt Broth שהוכן לפי הוראות היצרן בתוספת 0.3% Yeast Extract במים אולטרה-טהורים) ועבדו באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך עד חודשיים.
  2. הכינו 1 L של אגר THY (3% Todd Hewitt Broth, 0.3% Yeast Extract, ו-1.5% אגר במים אולטרה-טהורים), עבדו באוטוקלבה, וקררו ל-60 °C לפני המזיגה לצלח petri. אחסנו ב-4 °C למשך עד 3 חודשים.
  3. הכינו 150 ml של מצע גידול לביופילם (0.5X TY בתוספת 10 mM סוכרוז; 1.5% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, ו-10 mM סוכרוז במים אולטרה-טהורים) ועבדו בסטריליזציה באמצעות סינון. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך עד חודש אחד.
  4. הכינו 1 L של תמיסת סליין בבופר פוספט (PBS; 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, ו-0.24 g KH2PO4 במים אולטרה-טהורים) ועבדו באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
  5. הכינו 600 ml של בופר Tris HCl בריכוז 10 mM בתוספת 10 mM CaCl2 במים אולטרה-טהורים (בופר TC; pH 7.2) ועבדו באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
  6. עבדו 1 L של מים אולטרה-טהורים באוטוקלבה. אחסנו בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.

2. הכנת הדגימות

  1. ייצרו דגימות בצורת דיסק של קומפוזיטים לשחזור שיניים מסוג Point 4 (PF) ו-TPH3 (TP) בתבנית פלדת אל-חלד בהזמנה מיוחדת, בשתי שכבות. כל שכבה עוברת פוטו-פולימריזציה למשך 40 sec באמצעות יחידת הארה מסוג LED. לשני המוצרים הרכבים ורמות מילוי שונות מעט, ובכך הם יוצרים טופוגרפיות שטח שונות שעליהן יגדלו הביופילמים.
    1. ניתן לייצר דגימות של מצעים רלוונטיים באמצעות פרוטוקולים מבוססים מדיסציפלינות אחרות במקום שלב 2.1.
  2. בצעו גימור והברקה לדגימות עד להשגת גימור שטח סופי מקובל, למשל, באמצעות מכשיר השחזה והברקה חצי-אוטומטי. שטפו את הדגימות המהולקות במים אולטרה-טהורים וייבשו באמצעות אוויר דחוס.
  3. סטריליזו את הדגימות באמצעות גז ethylene oxide או בשיטת סטריליזציה חלופית.

3. צמיחת ביופילם

  1. בצעו אינוקולציה של מושבה אחת של S. mutans לתוך 4 ml של תוצר גידול למשך לילה (שלב 1.1). הדגירו למשך לילה ב-37 °C למשך 16-18 שעות. הצפיפות האופטית (OD600) של התרבית צריכה להיות ≥0.9.
    1. מומלץ להשתמש במושבה מתרביות בצלחות שעברו מעבר (passage) פעמיים ממלאי המקור, שכן הדבר מוביל לצמיחת ביופילם עקבית יותר.
  2. הכינו דילול של 1:100 באמצעות התרבית של הלילה (שלב 1.1) ב-10 ml של תוצר גידול לביופילם (שלב 1.3).
  3. העבירו דגימות סטריליות של קומפוזיט שרף (e.g. PF, TP) לצלחות סטריליות בעלות 12 בארות.
  4. הוסיפו 2.5 ml של תוצר גידול מדולל (שלב 3.2) לבארות המיועדות לקבוצות הטיפול (מי פה) והביקורת. הוסיפו 2.5 ml של תוצר גידול סטרילי לביופילם ללא אינוקולציה לבארות ביקורת הסטריליות.
  5. גדלו את הביופילמים בתנאים מיקרו-אווירופיליים. הניחו את הצלחות על שייקר במהירות של 100 rpm בתוך אינקובטור ב-37 °C למשך 24 שעות.
  6. לאחר 24 שעות, שאבו באופן אספטי את התוצר מכל הבארות ושטפו פעמיים עם PBS סטרילי (שלב 1.4; 2.5 ml/באר), תוך שאיבת ה-PBS לאחר כל שטיפה. מלאו מחדש 2.5 ml של תוצר גידול טרי לביופילם בכל באר והדגירו למשך 24 שעות נוספות תחת תנאים זהים לשלב הקודם, למשך זמן גידול כולל של הביופילם של 48 שעות.
  7. במקום השלבים המפורטים לעיל, ניתן לגדל ביופילמים של מינים אחרים על מצעים תוך שימוש בפרוטוקולים מבוססים.

4. טיפולים אנטיבקטריאליים/שטיפות פה

  1. שאבו את המצע לאחר השלמת צמיחת הביופילם.
  2. הוסיפו 2.5 ml של תמיסת פה מסוג Biotène PBF (BIO) או Listerine Total Care (LTO), או שיטת טיפול אחרת, לבארות של קבוצות הטיפול, והוסיפו 2.5 ml של מים סטריליים אולטרה-טהורים לבארת קבוצת הביקורת. השריו את הדגימות למשך 60 sec, בהתאם להוראות היצרן, תוך כדי ניעור של הפלטות על שייקר אורביטלי במהירות של 150 rpm. שאבו מיד את תמיסת הפה ואת המים האולטרה-טהורים מהבארות.
  3. שטפו את הדגימות 5 פעמים למשך 15 sec לכל שטיפה באמצעות מים סטריליים אולטרה-טהורים על השייקר האורביטלי במהירות של 150 rpm, תוך שאיבת המים לאחר כל שלב שטיפה.
  4. במקום השלבים שלעיל, ניתן לבחון חומרים אנטיבקטריאליים אחרים באמצעות פרוטוקולים מבוססים.

5. צביעה

  1. הכינו את דילול הצבעים עבור ניתוח הביופילם.
    1. הכינו תמיסת מלאי (stock solution) בריכוז 5 mg/ml של Concanavalin A, Alexa Fluor 647 conjugate (AF) בתוך נתרבicarbonate 0.1 M ב-pH 8.3. אחסנו ב- -20 °C במנות בודדות לשימוש אחד למשך מספר חודשים, שכן יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרת. באמצעות תמיסת המלאי של AF, הכינו דילול של 250 μg/ml בבופר TC.
    2. הכינו דילול של 10 μM באמצעות תמיסת המלאי של Syto 9 (SY) בריכוז 5 mM, כפי שסופקה על ידי היצרן, בבופר TC. אחסנו את שארית תמיסת המלאי של SY ב- -20 °C למשך מספר חודשים.
    3. הכינו דילול של 10x באמצעות תמיסת המלאי של Sypro Red (SR) בריכוז 5,000x, כפי שסופקה על ידי היצרן, במים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים. אחסנו את שארית תמיסת המלאי של SR ב- -20 °C למשך מספר חודשים.
  2. שטפו את כל הביופילמים פעמיים (2x) עם בופר TC (נפח של 2.5 ml/well) תוך כדי תנועת סיבוב ידנית, והשאירו את השטיפה השנייה בלוחית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאבו את הנוזלים.
  3. טפטפו 50 μl של צבע AF על כל דגימת ביופילם. צבעו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. שטפו פעמיים (2x) עם בופר TC (נפח של 2.5 ml/well), תוך שאיבה לאחר כל שטיפה.
  4. המשיכו בטפטוף של 50 μl של צבע SY על כל דגימת ביופילם. צבעו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. שטפו פעמיים (2x) עם מים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים (נפח של 2.5 ml/well), תוך שאיבה לאחר כל שטיפה.
  5. לבסוף, טפטפו 50 μl של צבע SR על כל דגימת ביופילם. צבעו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, במיגון מאור. שטפו שלוש פעמים (3x) עם מים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים (נפח של 2.5 ml/well), תוך שאיבה לאחר כל שטיפה.
  6. העבירו את הדגימות ללוחית בעלת 6 בארות, כאשר כל דגימה מונחת בבאר אחת ב-6 ml של מים מזוקקים אולטרה-טהורים סטריליים, כדי להקל על ביצוע מיקרוסקופיה קונפוקלית.

6. דימות באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית

  1. רכש תמונות של כל רכיב (צבע) בתוך הביופילמים של קבוצות הטיפול והביקורת באמצעות מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי עם לייזר (CLSM), בהתאם להגדרות המוצגות ב- טבלה 1במחקר זה נעשה שימוש בעדשת טבילה (dipping lens) בעלת הגדלה של 63X, מפתח מספרי (numerical aperture) של 0.9 ומרחק עבודה של 2.2 מ"מ.
    Biofilm staining chart; laser wavelengths (nm) and emission bands (nm) for EPS, nucleic acids, proteins.
    טבלה 1. הגדרות מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי.

  1. הגדירו את גודל הסריקה ל-250 μm x 250 μm ורזולוציית פיקסלים מינימלית של 512 x 512 כדי לרכוש תמונות CLSM ברזולוציה המתאימה לניתוח כמותי.
  2. השתמשו בצביעת SY כדי לקבוע את נקודות העליון והתחתון של ערימת תמונות הביופילם, ולאחר מכן הגדירו את ה-z-step כך שיהיה מתאים לניתוח כמותי (0.6 μm במחקר זה). לפני ביצוע הסריקה, בצעו אופטימיזציה לפרמטרי התמונה והצביעה (i.e. מתח ו-offset של ה-PMT) באמצעות אפשרות ה-QLUT. טבלת חיפוש צבעים (color look-up table) שימשה להקצאת פסאודו-צבעים לכל צבע (ירוק עבור SY, אדום עבור SR, וכחול עבור AF) כדי להפוך כל מרכיב בביופילם למובחן יותר בשחזור התלת-ממדי.
  3. רכשו תמונות CLSM בתדר של 400 Hz באמצעות סריקה סדרתית במצב "between stacks" כדי למקסם את לכידת התמונות של מספר צבעים בתוך אותו ביופילם.

7. ניתוח מבני של ביופילם

  1. נתחו את תמונות ה-CLSM שנאספו באמצעות תוכנה לניתוח תמונות של ביופילמים. השלבים הבאים מתארים את השימוש בתוכנת ISA3D12 לחישוב הפרמטרים המבניים של תמונות הביופילם שנאספו.
    1. העתיקו את קבצי תמונות ה-CLSM עבור כל ביופילם לתיקיית Images, כפי שמפורט במדריך של התוכנה. ודאו כי אתם פועלים לפי מוסכמות השמיות של קבצי ה-CLSM הנדרשות על ידי התוכנה. התוכנה מאפשרת ניתוח של קבצים בתוך תיקיות משנה במצב אצווה (batch mode), ובכך מקלה על ניתוח ביופילמים של קבוצות טיפול ובקרה בריצה אחת.
    2. הזינו את ממדי צירי x, y ו-z של תמונות ה-CLSM בשדות dxy ו-dz בתיבת הדו-שיח הראשית. בחרו את הגדרות הסף (threshold) ומיפוי המרחקים, כפי שמתואר במדריך של התוכנה (במחקר זה נעשה שימוש ב-Otsu וב-Quasi-Euclidean, בהתאמה). הזינו שם מתאים לקובץ התוצאות, ולאחר מכן הפעילו את התוכנית. קובץ תוצאות ייווצר בתיקיית ISA.
    3. עיינו בקובץ התוצאות כדי לקבל ערכים עבור עשרים פרמטרים מבניים בתלת-ממד12, כגון נפח ביולוגי (biovolume) ועובי ממוצע של הביופילם (שנמדדו במחקר זה), המכמתים את ההתפלגות התלת-ממדית של כל רכיב (צבע) בתוך הביופילם.

8. ויזואליזציה של מבנה הביופילם

  1. צרו שחזור של רכיבים חופפים (צביעות) בתוך כל ביופילם באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. השלבים הבאים מתארים את השימוש בתוכנת Volocity ליצירת שחזורים בתלת-ממד.
    1. צרו ספרייה עבור כל ביופילם על ידי העתקת קבצי תמונות CLSM לתוך התוכנה, כפי שמתואר במדריך.
    2. השתמשו באפשרות התפריט 3D Renderer כדי להפיק תמונת תלת-ממד משוחזרת מתמונות ה-CLSM של כל ביופילם (במחקר זה נעשה שימוש בפורמט HR Opacity).
    3. סובבו את תמונת התלת-ממד כדי להכווין את כל הביופילמים באופן דומה ביחס לצירים x, y ו-z. צלמו תמונת מצב (snapshot) של שחזור הביופילם המכוון נכונה, ולאחר מכן ייצאו את תמונת המצב בפורמט TIFF, JPEG או פורמט מתאים אחר.
  2. בצעו ניתוח חזותי של ההפצה הסימולטנית של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך הביופילמים על התמונות המשוחזרות.
  3. השתמשו במקדם המתאם של פירסון (Pearson's correlation coefficient) ובמקדם החפיפה של מנדרס (Manders' overlap coefficient) כדי לבצע ניתוח קולוקליזציה של רכיבי ביופילם מרובים (במחקר זה לא נמדדה קולוקליזציה).

9. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בניתוחים סטטיסטיים של מודלים מעורבים נפרדים כדי להשוות את ערכי הממוצע של פרמטרים מבניים בין קבוצת מי פיית הפה לקבוצת הביקורת (α=0.05). למחקר זה, נעשה שימוש בתוכנת SAS לביצוע הניתוח הסטטיסטי.

תוצאות

תוצאות מייצגות עבור הטיפולים (מי פה) וקבוצת הביקורת שלא טופלה מוצגות בטבלה 2, ובאיורים 1 ו 2. טבלה 2 מציגה את ערכי הממוצע וסטיית התקן של פרמטרי המבנה של הביופילם: נפח ביולוגי (μm3) ועובי ממוצע של הביופילם (μm), אשר חושבו באמצעות תוכנת ISA3D. פרמטרים מבניים של ביופילמים שטופלו במי פה שהבדילו באופן מובהק מאלו של ביופילמים בקבוצת הביקורת (p<0.05) מסומנים בערכי ממוצע וסטיית תקן המודגשים באדום. תוצאות הניתוחים הסטטיסטיים של המודלים המעורבים הדגימו כי מי פה מסוג BIO יצרו מבני ביופילם שהבדילו באופן מובהק מהביקורת (p<0.05) בשני סוגי השרף הקומפוזיטי, בעוד שמי פה מסוג LTO לא יצרו הבדלים מובהקים (p>0.05) באף אחד משני סוגי השרף הקומפוזיטי. התוצאות מראות בבירור כי רכיבי הביופילם התאיים והחוץ-תאיים שנותרו לאחר שני טיפולי מי הפה היו שונים. כמו כן, יש לציין כי ביופילמים של S. mutans שגדלו על שתי התשתיות (PF ו-TP) הבדילו במבנה התלת-ממדי שלהם, למרות שגדלו בתנאים דומים ושתי התשתיות פולשו באמצעות חומרי שיוף דומים.

ניתן להדמיות את ההפצה הסימולטנית של EPS, חלבונים וחומצות גרעיניות בתוך ביופילמים באמצעות שחזורי תלת-ממד (3D) שנוצרו באמצעות תוכנת Volocity. איורים 1 ו- 2 מציגים שחזורים מייצגים של ביופילמים מקבוצת ביקורת שגדלו על קומפוזיטים של שרף PF ו-TP, בהתאמה. הצבע הכחול מייצג EPS בתוך ביופילמים של S. mutans, הצבע הירוק מדגים חומצות גרעיניות, והצבע האדום מראה חלבונים. החלל שביניהם עשוי להיות תפוס על ידי מים או רכיבי ביופילם אחרים שאינם מסומנים באופן פלואורסצנטי.

תרשים פיזור תלת-ממדי, ויזואליזציה דינמית של נתונים, גרף, כלי מחקר אינטראקטיבי, תצוגת אנליזה.
איור 1. שחזור תלת-ממדי מייצג של ביופילם של S. mutans שגדל על קומפוזיט שרף PF בקבוצת הביקורת (שלא טופלה במי פה). חפיפה סימולטנית של שלושת הצביעים בתוך ביופילם בודד מאפשרת ויזואליזציה בו-זמנית של רכיבי EPS (צבע כחול), חומצה גרעינית (צבע ירוק) וחלבון (צבע אדום) בתוך ביופילם של S. mutans. (1 Unit = 24 μm). לחצו כאן להצגת האיור בגודל מלא.

ויזואליזציה של מבנה תאי תלת-ממדי, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתוח נתונים מרחביים, גרף מדעי.
איור 2. שחזור תלת-ממדי מייצג של ביופילם של S. mutans שגדל על קומפוזיט שרף TP בקבוצת הבקרה (שלא טופלה במי פה). חפיפה סימולטנית של שלושת הצבעים בתוך ביופילם בודד מאפשרת ויזואליזציה בו-זמנית של רכיבי EPS (צבע כחול), חומצות גרעין (צבע ירוק) וחלבונים (צבע אדום) בתוך ביופילמים של S. mutans. (1 Unit = 24 μm). לחצו כאן להצגת איור מוגדל.

ש composite שרףנקודה 4TPH3
מי פהמרכיבBV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBFחומצות גרעיניות279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
חלבונים298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total Careחומצות גרעיניות355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
חלבונים348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
ביקורת (לא מטופל)חומצות גרעיניות388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
חלבונים517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

טבלה 2. ערכי ממוצע וסטיית תקן של נפח ביולוגי (BV) ועובי ממוצע של הביופלם (MT) בביופלמים שטופלו ב-BIO או LTO, או שהושארו ללא טיפול (קבוצת ביקורת). פרמטרים מבניים של ביופלמים שטופלו בתמיסות לחיטוי הפה והיו שונים באופן מובהק מאלה של ביופלמים בקבוצת הביקורת (p<0.05) מסומנים בערכי ממוצע וסטיית תקן המודגשים באדום.

דיון

רכישת תמונות CLSM צריכה להתבצע באופן ובפורמט הדרושים לכימות ביופילמים ולניתוח קו-לוקליזציה, כך שהתפלגות עוצמת האות בכל תמונה היא ייצוג אמין של ההתפלגות של כל פלואורוכרום בערימת הביופילם. יש להבחין בין עוצמת האות לרעש ורקע10,11, שאינה מושפעת מאוטופלואורסצנטיות מהמצע, ובעלת דימום מינימלי עקב הפרעות ספקטרליות בין הפלואורוכרומים המשמשים11. רעש הוא מגבלה בלתי נמנעת של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית11, ואיכות התמונה יכולה לפעמים להיות מוגבלת מסיבות טכניות או לוגיסטיות. זיהוי פלואורוכרומים עם חפיפה ספקטרלית מינימלית הוא קריטי להצלחת שיטה זו, אך יכול להיות מסובך. יתר על כן, הכימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. לכן, אין זה מפתיע שמעט מאוד מחקרים כימתו בהצלחה את ההתפלגות המקבילה של יותר משני מרכיבים בתוך המבנים של ביופילמים.

מטרת מחקר זה הייתה לדווח על מתודולוגיה המורכבת משלבים נפרדים אך קשורים זה לזה לכימות והשוואה של ההתפלגות התלת-ממדית בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. בדיקת גידול הביופילם המתוארת מאפשרת גידול ביופילם על מצעים רלוונטיים ומייצרת מבני ביופילם הניתנים לשחזור, כפי שמודגם בתוצאות המדווחות בטבלה 1. השילוב של צביעה סימולטנית חדשה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין עם מדידת פרמטרים מבניים של ביופילם תלת מימדי מביא להתפלגות ניתנת לכימות של רכיבים בתוך ביופילמים. ניתוח ויזואלי איכותי של ההתפלגות המקבילה של EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך הביופילם אפשרי באמצעות שחזור של כתמים מכוסים בתוך כל ביופילם. תוכנת ISA3D12 מכילה מספר פרמטרים מבניים ייחודיים כגון ממד פרקטלי, הומוגניות ומקדם חספוס ביופילם בנוסף לפרמטרים הנמדדים באופן מסורתי כגון נקבוביות ועובי ביופילם כדי לשפר את הכימות של המבנים התלת-ממדיים של ביופילמים. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם מאפשר השוואות רלוונטיות של ביופילמים בתנאי ניסוי ספציפיים כגון יעילות אנטיבקטריאלית/אנטי-פאולינג (למשל לאחר טיפול במי פה) או לאורך זמן (השפעות זמניות).

מתודולוגיה זו כימתה והשוותה ביעילות ובהצלחה את ההתפלגות התלת-ממדית המקבילה של שלושה רכיבים עיקריים בביופילמים של S. mutans שגודלו על מצעים רלוונטיים, ובכך התגברה על שני אתגרים להערכה בו-זמנית של רכיבי ביופילם. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לקבוע את היעילות של טיפולים אנטיבקטריאליים או אמצעים נגד עכירות כנגד רכיבי ביופילם מרובים, כפי שהודגם באמצעות שטיפות פה במחקר זה. יתר על כן, ניתן להחליף את רוב הפרוטוקולים שתוארו לעיל בפרוטוקולים לייצור מצעים רלוונטיים ומבחני גידול ביופילם של מיקרואורגניזמים רלוונטיים. לכן, לשיטה זו יש יישום רחב מכיוון שהיא מאפשרת השוואה של מבנים/ארכיטקטורה תלת מימדיים של ביופילמים in vitro ו-in vivo במגוון דיסציפלינות כולל מדעי הרפואה, השיניים, הגיאולוגיקה והים.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. ההפקה והגישה החופשית למאמר זה ממומנים על ידי Leica Microsystems.

תודות

המימון למחקר זה ניתן על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות/NIDCR 1R15DE019566-01A1. ד"ר. ג'ים הנתורן (מעבדת OUHSC לזרימה וציטומטריית תמונה) מוכר על מתן סיוע טכני במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. ד"ר פרננדו אסטבן פלורז (המחלקה לחומרים דנטליים) זוכה להכרה על מתן סיוע טכני במהלך צילומי הסרטון הזה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקטו אגרבקטון, דיקינסון ושות214010
בקטו טוד יואיט מרקבקטון, דיקינסון ושות249240
תמצית שמרים, EMD מגורעןMillipore1.03753.0500
בקטו טריפטוןבקטון, דיקינסון ושות'211705
OmniPur סוכרוזEMD Millipore8510
אשלגן כלורי, מגיב ACS, 99.0-100.5%Sigma-AldrichP3911-500G
אשלגן פוספט, מונובסיסי, ≥ 99.0%, מגיב ACSסיגמא-אולדריץ'P0662-500G
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888-500G
נתרן פוספט, מונובסיסי, מונוהידראטEMD MilliporeSX0710-1
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן, 99.8+%, מגיב ACSסיגמא-אולדריץ'252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 מצומדInvitrogenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 או S6653
Biotè ne שטיפת פה PBFGlaxoSmithKlineN/A
ליסטרין Total CareMcNeil-PPC, Inc.לא ישים
' '

מקורות

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Streptococcus Mutans
כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.