Method Article

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

DOI:

10.3791/50639

⸱

December 10th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) הוא כלי רב עוצמה לחקר ביופילמים. מעט מאוד מחקרים כימתו בהצלחה התפלגות בו-זמנית של יותר משני רכיבים בתוך ביופילמים כי: 1) בחירה של צבעים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מינימלית היא מסובכת, ו-2) כימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. מטרות: דווח על מתודולוגיה לכימות והשוואה של התפלגויות תלת מימדיות במקביל של שלושה רכיבים תאיים/חוץ-תאיים של ביופילמים הגדלים על מצעים רלוונטיים. שיטות: השיטה מורכבת משלבים נפרדים ומחוברים זה לזה הכוללים צמיחת ביופילם, צביעה, הדמיית CLSM, ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם וניתוח סטטיסטי של פרמטרים מבניים. ביופילמים של Streptococcus mutans (זן UA159) גודלו במשך 48 שעות על דגימות סטריליות של חומרים מרוכבים של שרף Point 4 ו-TPH3. הדגימות הוטבלו לאחר מכן למשך 60 שניות במי פה של Biotène PBF (BIO) או Listerine Total Care (LTO), או במים (קבוצת ביקורת; n=5/קבוצה). ביופילמים נצבעו בפלואורוכרומים עבור חומרים פולימריים חוץ-תאיים, חלבונים וחומצות גרעין לפני הדמיה עם CLSM. הפרמטרים המבניים של ביופילם שחושבו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ISA3D היו נפח ביולוגי ועובי ממוצע של ביופילם. מודלים מעורבים ניתוחים סטטיסטיים השוו פרמטרים מבניים בין מי פה לקבוצת ביקורת (תוכנת SAS; α=0.05). תוכנת Volocity אפשרה הדמיה של הפצות תלת מימד של רכיבי ביופילם (פלואורוכרומים). תוצאות: שטיפת פה BIO ייצרה מבני ביופילם השונים באופן משמעותי מהביקורת (p<0.05) על שני מרכיבי השרף, בעוד ש-LTO לא ייצר הבדלים (p>0.05) באף אחד מהמוצרים. מסקנות: מתודולוגיה זו כימתה והשוותה ביעילות ובהצלחה התפלגויות תלת-ממדיות בו-זמניות של שלושה רכיבים עיקריים בתוך ביופילמים של S. mutans על מצעים רלוונטיים, ובכך התגברה על שני אתגרים להערכה בו-זמנית של רכיבי ביופילם. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לקבוע את יעילותם של חומרים אנטיבקטריאליים/נוגדי עכירות כנגד רכיבי ביופילם מרובים, כפי שמוצג באמצעות מי פה. יתר על כן, לשיטה זו יש יישום רחב מכיוון שהיא מאפשרת השוואה של מבנים תלת מימדיים/ארכיטקטורה של ביופילמים במגוון דיסציפלינות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביופילמים הם קהילות מיקרוביאליות מובנות העטופות במטריצה חוץ-תאית המיוצרת בעצמה, ומחוברות למשטחים ביולוגיים או אינרטיים1. ביופילמים מייצגים אורח חיים נפוץ עבור חיידקים רבים, ונוצרים על ידי מעבר בשלבים מתאים צפים חופשיים (פלנקטוניים) לקהילות מורכבות מרובות מינים. העמידות המובנית של ביופילמים לחומרים אנטי-מיקרוביאליים היא השורש לזיהומים חיידקיים מתמשכים וכרוניים רבים1,2, כפי שמודגם על ידי ביופילמים אוראליים (רובד שיניים). מיקרואורגניזמים קריוגניים כגון מוטנס, סטרפטוקוק מעבדים סוכרוז ופחמימות אחרות כדי לייצר מטריצה חוץ-תאית וליצור חומצות שעלולות לפרק את מבנה השן ולגרום לעששת. רוב מטריצות הביופילם הן ביופולימרים המורכבים מרכיבים תאיים וחוץ-תאיים כגון אקסופוליסכרידים (EPS), חלבונים וחומצות גרעין3,4.

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), הטכניקה הנפוצה ביותר להדמיה פלואורסצנטית, שינתה באופן קיצוני את ההדמיה האופטית בביולוגיה מכיוון שיש לה את היכולת לאסוף תמונות תלת מימד של מבנים ביולוגיים מיובשים ללא קיבוע5,6,7. טכניקה לא הרסנית זו כוללת איסוף תמונות של חתכים דקים בתוך אזור עניין על הדגימה באופן שמסירים את התרומה של אור לא ממוקד. האיכות והרזולוציה של התמונות שצולמו על ידי CLSM הן מעבר למה שניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבה. חיסרון מרכזי אחד של CLSM הוא שסריקת תמונות מתרחשת בקצב איטי יותר מאשר בטכניקות מיקרוסקופיה רחבות, בהן תמונות שלמות נאספות בו זמנית5. עם זאת, עם מבחר הולך וגדל של פלואורוכרומים, לייזרים ומסננים, CLSM הפכה לאחת הטכניקות הרווחות להדמיה מולטי-ספקטרלית5,7.

מחקרים קודמים הראו ש-CLSM הוא כלי שימושי לבחינת המבנה או הארכיטקטורה של ביופילמים על ידי שימוש בתג פלואורסצנטי אחד או שניים או כתמים כדי לספק הבנה טובה יותר של התפלגות ה-EPS והתאים בתוך ביופילמים, ובמיוחד בתוך המטריצה החוץ-תאית7,8. בתיאוריה, צביעה/תיוג פלואורסצנטי של רכיבים מרובים רצוי לחקר המבנה המפורט והקו-לוקליזציה של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. עם זאת, ניתוח בו-זמני של רכיבים שונים בתוך ביופילמים יכול להיות מאתגר מכיוון ש: 1) בחירה של צבעים פלואורסצנטיים בעלי חפיפה ספקטרלית מינימלית היא מסובכת, ו-2) כימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. קולוקליזציה באמצעות מספר פלואורוכרומים מחייבת שימוש בכתמים ספציפיים ביותר עם הפרעות ספקטרליות מינימליות כדי למנוע השפעות דימום, המתרחשות כאשר לשני פלואורוכרומים יש חפיפה משמעותית בשיא הספקטרלי שלהם, מה שגורם לאחד להתרגש חזק יותר מהשני9. באופן אידיאלי, פלואורוכרומים בעלי ספקטרום עירור שאינם חופפים יספקו את התוצאות הטובות ביותר, אולם קשה מאוד למצוא כתמים העומדים בקריטריון זה. במקום זאת, בחירת הכתמים מותאמת על ידי בחירת פלואורוכרומים שספקטרום הפליטה שלהם הוא בעל חפיפה מינימלית, מה שמאפשר לראות את הכתמים בזה אחר זה בתוך פס אורך גל תצפית מוגבל9.

סופר-אימפוזיציה של תמונות פלואורסצנטיות היא כנראה השיטה הנפוצה ביותר להערכת התפלגות בו-זמנית של פלואורוכרומים. קולוקליזציה של הרכיבים השונים מופיעה כחפיפה של צבעים שונים דרך ערוצים מרובים שנוצרו על ידי הפלואורוכרומים הנבדקים10. הכלים להצגת תמונות פלואורסצנטיות מרובות ערוצים כתמונות צבעוניות ממוזגות זמינים ברוב תוכנות CLSM ותוכנות ניתוח תמונות ביולוגיות. למרות שסופר-אימפוזיציה של תמונות שימושית להערכה מרחבית של קו-לוקליזציה, ניתן לבחון את התמונות באופן איכותי רק על ידי ניתוח חזותי. זה מספק כמות מוגבלת של מידע, מכיוון שייצוגים אלה בדרך כלל אינם מועילים לכימות קולוקליזציה בתנאי ניסוי שונים ואינם קובעים אם הקולוקליזציה חורגת מצירוף מקרים אקראי11. מעט מאוד מחקרים עד כה השתמשו בשיטות כמותיות כדי לנתח את המבנה התלת-ממדי של ביופילמים ורכיבי ביופילם, ומעטים עוד יותר כימתו את ההשפעה של טיפולים אנטיבקטריאליים או אמצעים נוגדי עכירות על רכיבי ביופילם.

מטרת מחקר זה הייתה לדווח על מתודולוגיה לכימות והשוואה של ההתפלגות התלת-ממדית בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים. השיטה מורכבת משלבים נפרדים אך קשורים זה בזה הכוללים צמיחת ביופילם, צביעה, הדמיית CLSM של ביופילמים, ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם וניתוח סטטיסטי של פרמטרים מבניים. בדיקת גידול הביופילם מאפשרת גידול ביופילם על מצעים רלוונטיים, ומייצרת מבני ביופילם הניתנים לשחזור. השילוב של צביעה סימולטנית חדשה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין עם מדידת פרמטרים מבניים של ביופילם תלת מימדי מביא להתפלגות ניתנת לכימות של רכיבים בתוך ביופילמים. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם מאפשר הערכה של ביופילמים בתנאי ניסוי ספציפיים (למשל לאחר טיפול במי פה), כפי שיתואר בסעיף הבא.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה וריאגנטים

  1. יש להכין 300 מ"ל תרבית לילה בינונית (THY; 3% ציר טוד יואיט שהוכן לפי הוראות היצרן בתוספת 0.3% תמצית שמרים במים טהורים במיוחד) וחיטוי. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים.
  2. מכינים 1 ליטר אגר THY (3% מרק טוד יואיט, 0.3% תמצית שמרים ו-1.5% אגר במים טהורים במיוחד), אוטוקלאב ומצננים ל-60 מעלות צלזיוס לפני שמוזגים לצלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.
  3. הכינו 150 מ"ל מדיום גידול ביופילם (0.5X TY בתוספת 10 מ"מ סוכרוז; 1.5% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים ו-10 מ"מ סוכרוז במים טהורים במיוחד) ועקרו מסנן. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודש.
  4. הכינו 1 ליטר מלח פוספט (PBS; 8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4 ו-0.24 גרם KH2PO4 במים טהורים במיוחד) וחיטוי. יש לאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
  5. הכינו 600 מ"ל מאגר Tris HCl 10 מ"מ בתוספת 10 מ"מ CaCl2 במים טהורים במיוחד (מאגר TC; pH 7.2) וחיטוי. יש לאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
  6. חיטוי 1 ליטר מים טהורים במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.

2. ייצור דגימות

  1. ייצור דגימות בצורת דיסק של חומרים מרוכבים של שרף שיניים נקודה 4 (PF) ו-TPH3 (TP) בתבנית נירוסטה בהתאמה אישית בשתי מרווחים. כל תוספת מתרפאת באור למשך 40 שניות באמצעות יחידת ריפוי אור LED. לשני המוצרים יש הרכבים ורמות מילוי מעט שונות, ובכך מייצרים טופוגרפיות פני שטח שונות שעליהן יגדלו הביופילמים.
    1. ניתן לייצר דגימות של מצעים רלוונטיים באמצעות פרוטוקולים מבוססים מדיסציפלינות אחרות במקום שלב 2.1.
  2. גימור וליטוש דגימות לגימור משטח סופי מקובל, למשל באמצעות מלטש מטחנה חצי אוטומטי. שוטפים דגימות מלוטשות במים טהורים במיוחד ומייבשים באמצעות אוויר דחוס.
  3. עקר דגימות באמצעות גז תחמוצת אתילן או שיטת עיקור חלופית.

3. גידול ביופילם

  1. יש לחסן מושבה אחת של S. mutans לתרבית לילה של 4 מ"ל (שלב 1.1). יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות. הצפיפות האופטית (OD600) של התרבית צריכה להיות ≥0.9.
    1. עדיף להשתמש במושבה מתרביות צלחות שהועברו פי 2 ממלאי מקורי, מכיוון שהדבר מביא לצמיחה עקבית יותר של ביופילם.
  2. צרו דילול של 1:100 באמצעות תרבית הלילה (שלב 1.1) ב-10 מ"ל של מצע גידול ביופילם (שלב 1.3).
  3. העבר דגימות מרוכבות של שרף סטרילי (למשל PF, TP) לצלחות סטריליות של 12 בארות.
  4. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום תרבית מדולל (שלב 3.2) לבארות לטיפול (מי פה) ולקבוצות ביקורת. הוסף 2.5 מ"ל של מצע גידול ביופילם סטרילי לא מחוסן לבארות בקרת סטריליות.
  5. לגדל את הביופילמים בתנאים מיקרואירופיליים. מניחים צלחות על שייקר ב-100 סל"ד בתוך אינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  6. לאחר 24 שעות, יש לשאוב מדיום אספטי מכל הבארות ולשטוף פעמיים עם PBS סטרילי (שלב 1.4; 2.5 מ"ל/באר), תוך שאיפת ה-PBS לאחר כל שטיפה. יש לחדש 2.5 מ"ל של מצע גידול ביופילם טרי בכל באר ולדגור למשך 24 שעות נוספות בתנאים זהים לשלב הקודם, לזמן גידול כולל של 48 שעות.
  7. במקום השלבים לעיל, ניתן לגדל ביופילמים של מינים אחרים על מצעים באמצעות פרוטוקולים קבועים.

4. טיפולים אנטיבקטריאליים/מי פה

  1. מדיום שאיבה לאחר השלמת צמיחת הביופילם.
  2. יש להוסיף 2.5 מ"ל מי פה Biotène PBF (BIO) או Listerine Total Care (LTO), או שיטת טיפול אחרת, בבארות עבור קבוצות הטיפול, ולהוסיף 2.5 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים לבאר קבוצת הביקורת. טבלו דגימות למשך 60 שניות, לפי הוראות היצרן, תוך כדי ערבוב צלחות על שייקר מסלולי ב-150 סל"ד. שאפו מיד גם את מי הפה וגם את המים האולטרה-טהורים מהבארות.
  3. שטפו את הדגימות 5 פעמים למשך 15 שניות לכל שטיפה במים סטריליים אולטרה-טהורים על שייקר המסלול ב-150 סל"ד, תוך שאיבת מים לאחר כל שלב כביסה.
  4. במקום השלבים לעיל, ניתן לבדוק חומרים אנטיבקטריאליים אחרים באמצעות פרוטוקולים קבועים.

5. מכתים

  1. הכן את דילול הכתמים לניתוח ביופילם.
    1. הכן תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל של Concanavalin A, Alexa Fluor 647 מצומד (AF) ב-0.1 M נתרן ביקרבונט pH 8.3. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס במכסות חד פעמיות למשך מספר חודשים מכיוון שמומלץ להקפיא ולהפשיר. באמצעות פתרון מלאי AF זה, הכן דילול של 250 מיקרוגרם/מ"ל במאגר TC.
    2. הכן דילול של 10 μM באמצעות תמיסת המלאי (SY) של 5 mM Syto 9, כפי שסופק על ידי היצרן, במאגר TC. אחסן את תמיסת המלאי SY הנותרת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
    3. הכן דילול פי 10 באמצעות תמיסת ה-5,000x Sypro Red (SR), כפי שסופק על ידי היצרן, במים סטריליים אולטרה-טהורים. אחסן את תמיסת המלאי הנותרת של SR בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
  2. שטפו את כל הביופילמים פעמיים עם מאגר TC (2.5 מ"ל/באר) בתנועת סיבוב ידנית, מה שמאפשר לכביסה השנייה להישאר בצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף.
  3. הנח טיפה של 50 מיקרוליטר של כתם AF על כל דגימת ביופילם. כתם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. יש לכבס פעמיים עם מאגר TC (2.5 מ"ל/באר), ולשאוף לאחר כל כביסה.
  4. לאחר מכן יש למרוח טיפה של 50 מיקרוליטר של כתם SY על כל דגימת ביופילם. כתם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. יש לכבס פעמיים במים סטריליים אולטרה-טהורים (2.5 מ"ל/באר), ולשאוף לאחר כל כביסה
  5. לבסוף, הניחו טיפה של 50 מיקרוליטר של כתם SR על כל דגימת ביופילם. כתם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. יש לכבס 3 פעמים במים סטריליים טהורים במיוחד (2.5 מ"ל/באר), ולשאוף לאחר כל כביסה.
  6. העבירו את הדגימות לצלחת של 6 בארות, והניחו דגימה אחת לכל באר במים אולטרה-טהורים סטריליים של 6 מ"ל כדי להקל על מיקרוסקופיה קונפוקלית.

6. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי

  1. רכוש תמונות של כל רכיב (כתם) בתוך ביופילמים של קבוצות הטיפול והביקורת באמצעות הגדרות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המוצגות בטבלה 1. במחקר זה נעשה שימוש בעדשת טבילה 63X עם צמצם מספרי של 0.9 בעלת מרחק עבודה של 2.2 מ"מ.
    figure-protocol-1
    טבלה 1. הגדרות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

  1. הגדר את גודל הסריקה ל-250 מיקרומטר x 250 מיקרומטר ורזולוציית פיקסלים מינימלית של 512 x 512 כדי להשיג תמונות CLSM ברזולוציה המתאימה לניתוח כמותני.
  2. השתמש בכתם SY כדי להגדיר את הנקודות העליונות והתחתונות של ערימת תמונות הביופילם, ולאחר מכן הגדר את שלב ה-z כך שיהיה מתאים לניתוח כמותי (0.6 מיקרומטר למחקר זה). לפני איסוף סריקה, בצע אופטימיזציה של פרמטרי התמונה והכתמים (כלומר מתח PMT והיסט) באמצעות אפשרות QLUT. טבלת חיפוש צבעים שימשה להקצאת פסאודו-צבעים לכל כתם (ירוק עבור SY, אדום עבור SR וכחול עבור AF) על מנת להפוך כל רכיב ביופילם לבולט יותר בשחזור התלת-ממדי.
  3. אסוף תמונות CLSM ב-400 הרץ באמצעות סריקה רציפה במצב "בין ערימות" כדי למטב את לכידת התמונות של כתמים מרובים באותו ביופילם.

7. ניתוח מבני ביופילם

  1. לנתח את תמונות ה-CLSM שנאספו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות עבור ביופילמים. השלבים הבאים מתארים את השימוש בתוכנת ISA3D12 לחישוב הפרמטרים המבניים של תמונות הביופילם שנאספו.
    1. העתק קובצי תמונה CLSM עבור כל ביופילם לתיקיית התמונות, כמפורט במדריך התוכנה. ודא שמוסכמת מתן השמות לקובצי CLSM הנדרשת על-ידי התוכנה מתבצעת. התוכנה מאפשרת ניתוח של קבצים בתוך תת-תיקיות במצב אצווה, ובכך מקלה על ניתוח ביופילמים של טיפול וקבוצת ביקורת באותה ריצה.
    2. הזן מידות ציר x, y ו- z של תמונות CLSM בשדות dxy ו- dz של תיבת הדו-שיח הראשית. בחר הגדרות מיפוי סף ומרחק, כמתואר במדריך התוכנה (Otsu ו-Quasi-Euclidean שימשו למחקר זה, בהתאמה). הזן שם מתאים עבור קובץ התוצאות ולאחר מכן הפעל את התוכנית. קובץ תוצאות יופק בתיקיית ISA.
    3. צפה בקובץ התוצאות כדי לקבל ערכים עבור עשרים פרמטרים מבניים תלת-ממדיים12 כגון נפח ביולוגי ועובי ביופילם ממוצע (שנמדד במחקר זה) המכמתים את ההתפלגות התלת-ממדית של כל רכיב (כתם) בתוך הביופילם.

8. ויזואליזציה של מבנה הביופילם

  1. צור שחזור של רכיבים (כתמים) בתוך כל ביופילם באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. השלבים הבאים מתארים את השימוש בתוכנת Volocity ליצירת שחזורים תלת מימדיים.
    1. צור ספרייה עבור כל ביופילם על ידי העתקת קבצי תמונה CLSM לתוכנה, כמתואר במדריך.
    2. השתמשו באפשרות התפריט 3D Renderer כדי להפיק תמונה תלת-ממדית משוחזרת מתמונות CLSM של כל ביופילם (פורמט HR Opacity שימש למחקר זה).
    3. סובב את התמונה התלת-ממדית כדי לכוון את כל הביופילמים באופן דומה ביחס לצירי הקואורדינטות x, y ו-z. צלם תצלום בזק של שחזור הביופילם בכיוון הנכון, ולאחר מכן ייצא את תצלום הבזק ב-TIFF, JPEG או פורמט מתאים אחר.
  2. לבצע ניתוח חזותי של ההתפלגות המקבילה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך ביופילמים על התמונות המשוחזרות.
  3. השתמש במקדם המתאם של פירסון ובמקדם החפיפה של מנדרס כדי לבצע ניתוח קולוקליזציה של רכיבי ביופילם מרובים (קולוקליזציה לא נמדדה במחקר זה).

9. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בניתוחים סטטיסטיים נפרדים של מודלים מעורבים כדי להשוות ערכים ממוצעים של פרמטרים מבניים בין מי פה לקבוצת הביקורת (α=0.05). לצורך מחקר זה, נעשה שימוש בתוכנת SAS לביצוע הניתוח הסטטיסטי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות מייצגות עבור הטיפולים (שטיפות פה) וקבוצת ביקורת לא מטופלת מוצגות בטבלה 2, ובאיורים 1 ו-2. טבלה 2 מציגה את ערכי הממוצע וסטיית התקן של הפרמטרים המבניים של ביופילם, נפח ביולוגי (מיקרומטר3) ועובי ביופילם ממוצע (מיקרומטר) שחושבו באמצעות תוכנת ISA3D. לפרמטרים מבניים של ביופילמים שטופלו במי פה שהיו שונים באופן משמעותי מאלה של ביופילמים בקבוצת הביקורת (p<0.05) יש ערכי ממוצע וסטיית תקן מודגשים באדום. תוצאות הניתוחים הסטטיסטיים של המודלים המעורבים הראו כי שטיפת פה BIO ייצרה מבני ביופילם השונים באופן משמעותי מהביקורת (p<0.05) על שני מרכיבי השרף, בעוד ששטיפת פה LTO לא יצרה הבדלים משמעותיים (p>0.05) על אף אחד ממרוכבי השרף. התוצאות מראות בבירור כי מרכיבי הביופילם התאיים והחוץ-תאיים שנותרו לאחר שני טיפולי מי הפה היו שונים. יש לציין גם שהביופילמים של S. mutans שגדלו על שני המצעים (PF ו-TP) היו שונים במבנה התלת-ממדי למרות שהם גודלו בתנאים דומים ושני המצעים היו מלוטשים בחומרים שוחקים דומים.

ניתן להמחיש את ההתפלגות המקבילה של EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך ביופילמים באמצעות שחזורים תלת מימדיים שנוצרו באמצעות תוכנת Volocity. איורים 1 ו-2 מדגימים שחזורים מייצגים של ביופילמים של קבוצת ביקורת הגדלים על חומרים מרוכבים של שרף PF ו-TP, בהתאמה. הכתם הכחול מייצג EPS בתוך ביופילמים של S. mutans, הכתם הירוק מדגים חומצות גרעין, והכתם האדום מראה חלבונים. החלל המתווך עשוי להיות תפוס על ידי מים או רכיבי ביופילמים אחרים שאינם מסומנים בפלואורסצנט.

figure-results-1
איור 1. שחזור תלת מימד מייצג של ביופילם S. mutans שגדל על מרוכב שרף PF בקבוצת הביקורת (לא טופל במי פה). שכבת-על בו-זמנית של שלושת הכתמים בתוך ביופילם יחיד מאפשרת הדמיה בו-זמנית של רכיבי EPS (כתם כחול), חומצת גרעין (כתם ירוק) וחלבון (כתם אדום) בתוך ביופילמים של S. mutans. (יחידה אחת = 24 מיקרומטר). לחץ כאן לצפייה באיור גדול יותר.

figure-results-2
איור 2. שחזור תלת מימד מייצג של ביופילם S. mutans שגדל על מרוכב שרף TP בקבוצת הביקורת (לא טופל במי פה). שכבת-על בו-זמנית של שלושת הכתמים בתוך ביופילם יחיד מאפשרת הדמיה בו-זמנית של רכיבי EPS (כתם כחול), חומצת גרעין (כתם ירוק) וחלבון (כתם אדום) בתוך ביופילמים של S. mutans. (יחידה אחת = 24 מיקרומטר). לחץ כאן לצפייה באיור גדול יותר.

<גבול טבלה="1"> מרוכב שרף נקודה 4 TPH3 מי פה רכיב BV (מיקרומטר3) MT (מיקרומטר) BV (מיקרומטר3) MT (מיקרומטר) ביוטין PBF חומצות גרעין 279,517±53,291 9.32±2.80 195,033±42,014 7.45±3.70 רווח למניה 344,902±56,386 22.35.±17.19 197,840±62,351 9.83±7.26 חלבונים 298,796±62,868 21.54.±21.65 216,033±66,654 24.33±39.64 ליסטרין טוטאל קר חומצות גרעין 355,707±110,444 26.45±14.21 273,296±47,323 13.43±2.89 רווח למניה 494,099±180,592 64.90± 26.68 329,150±47,145 34.35±30.32 חלבונים 348,416±161,316 58.68±47.28 303,150±54,705 34.18±41.46 בקרה (לא מטופלת) חומצות גרעין 388,375±42,152 51.15±40.66 327,809±39,400 17.08±1.65 רווח למניה 660,448±173,197 91.37±74.84 363,850±67,612 28.33± 15.07 חלבונים 517,274±119,475 127.96±73.84 353,161±56,518 17.21±4.41

טבלה 2. ערכי ממוצע וסטיית תקן של נפח ביולוגי (BV) ועובי ביופילם ממוצע (MT) של ביופילמים שטופלו ב-BIO או LTO, או נותרו ללא טיפול (קבוצת ביקורת). לפרמטרים מבניים של ביופילמים שטופלו במי פה שהיו שונים באופן משמעותי מאלה של ביופילמים בקבוצת הביקורת (p<0.05) יש ערכי ממוצע וסטיית תקן מודגשים באדום.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רכישת תמונות CLSM צריכה להתבצע באופן ובפורמט הדרושים לכימות ביופילמים ולניתוח קו-לוקליזציה, כך שהתפלגות עוצמת האות בכל תמונה היא ייצוג אמין של ההתפלגות של כל פלואורוכרום בערימת הביופילם. יש להבחין בין עוצמת האות לרעש ורקע10,11, שאינה מושפעת מאוטופלואורסצנטיות מהמצע, ובעלת דימום מינימלי עקב הפרעות ספקטרליות בין הפלואורוכרומים המשמשים11. רעש הוא מגבלה בלתי נמנעת של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית11, ואיכות התמונה יכולה לפעמים להיות מוגבלת מסיבות טכניות או לוגיסטיות. זיהוי פלואורוכרומים עם חפיפה ספקטרלית מינימלית הוא קריטי להצלחת שיטה זו, אך יכול להיות מסובך. יתר על כן, הכימות של פלואורוכרומים מרובים מהווה בעיה רב-גורמית. לכן, אין זה מפתיע שמעט מאוד מחקרים כימתו בהצלחה את ההתפלגות המקבילה של יותר משני מרכיבים בתוך המבנים של ביופילמים.

מטרת מחקר זה הייתה לדווח על מתודולוגיה המורכבת משלבים נפרדים אך קשורים זה לזה לכימות והשוואה של ההתפלגות התלת-ממדית בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. בדיקת גידול הביופילם המתוארת מאפשרת גידול ביופילם על מצעים רלוונטיים ומייצרת מבני ביופילם הניתנים לשחזור, כפי שמודגם בתוצאות המדווחות בטבלה 1. השילוב של צביעה סימולטנית חדשה של רכיבי EPS, חלבונים וחומצות גרעין עם מדידת פרמטרים מבניים של ביופילם תלת מימדי מביא להתפלגות ניתנת לכימות של רכיבים בתוך ביופילמים. ניתוח ויזואלי איכותי של ההתפלגות המקבילה של EPS, חלבונים וחומצות גרעין בתוך הביופילם אפשרי באמצעות שחזור של כתמים מכוסים בתוך כל ביופילם. תוכנת ISA3D12 מכילה מספר פרמטרים מבניים ייחודיים כגון ממד פרקטלי, הומוגניות ומקדם חספוס ביופילם בנוסף לפרמטרים הנמדדים באופן מסורתי כגון נקבוביות ועובי ביופילם כדי לשפר את הכימות של המבנים התלת-ממדיים של ביופילמים. ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים המבניים של הביופילם מאפשר השוואות רלוונטיות של ביופילמים בתנאי ניסוי ספציפיים כגון יעילות אנטיבקטריאלית/אנטי-פאולינג (למשל לאחר טיפול במי פה) או לאורך זמן (השפעות זמניות).

מתודולוגיה זו כימתה והשוותה ביעילות ובהצלחה את ההתפלגות התלת-ממדית המקבילה של שלושה רכיבים עיקריים בביופילמים של S. mutans שגודלו על מצעים רלוונטיים, ובכך התגברה על שני אתגרים להערכה בו-זמנית של רכיבי ביופילם. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לקבוע את היעילות של טיפולים אנטיבקטריאליים או אמצעים נגד עכירות כנגד רכיבי ביופילם מרובים, כפי שהודגם באמצעות שטיפות פה במחקר זה. יתר על כן, ניתן להחליף את רוב הפרוטוקולים שתוארו לעיל בפרוטוקולים לייצור מצעים רלוונטיים ומבחני גידול ביופילם של מיקרואורגניזמים רלוונטיים. לכן, לשיטה זו יש יישום רחב מכיוון שהיא מאפשרת השוואה של מבנים/ארכיטקטורה תלת מימדיים של ביופילמים in vitro ו-in vivo במגוון דיסציפלינות כולל מדעי הרפואה, השיניים, הגיאולוגיקה והים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. ההפקה והגישה החופשית למאמר זה ממומנים על ידי Leica Microsystems.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון למחקר זה ניתן על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות/NIDCR 1R15DE019566-01A1. ד"ר. ג'ים הנתורן (מעבדת OUHSC לזרימה וציטומטריית תמונה) מוכר על מתן סיוע טכני במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. ד"ר פרננדו אסטבן פלורז (המחלקה לחומרים דנטליים) זוכה להכרה על מתן סיוע טכני במהלך צילומי הסרטון הזה.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בקטו אגרבקטון, דיקינסון ושות214010
בקטו טוד יואיט מרקבקטון, דיקינסון ושות249240
תמצית שמרים, EMD מגורעןMillipore1.03753.0500
בקטו טריפטוןבקטון, דיקינסון ושות'211705
OmniPur סוכרוזEMD Millipore8510
אשלגן כלורי, מגיב ACS, 99.0-100.5%Sigma-AldrichP3911-500G
אשלגן פוספט, מונובסיסי, ≥ 99.0%, מגיב ACSסיגמא-אולדריץ'P0662-500G
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888-500G
נתרן פוספט, מונובסיסי, מונוהידראטEMD MilliporeSX0710-1
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן, 99.8+%, מגיב ACSסיגמא-אולדריץ'252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 מצומדInvitrogenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 או S6653
Biotè ne שטיפת פה PBFGlaxoSmithKlineN/A
ליסטרין Total CareMcNeil-PPC, Inc.לא ישים
' '

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).">Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).">Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).">Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).">Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).">Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).">Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).">Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).">Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).">Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).">Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).">Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biofilm QuantificationConfocal MicroscopyExtracellular Polymeric SubstancesNucleic Acid StainingProtein StainingBiofilm Structural Analysis3D Image ReconstructionStatistical AnalysisMouthwash TreatmentStreptococcus Mutans

Related Articles