הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

19.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50701

⸱

31 ביולי 2013

 , 
1NRW Research Group 'Dendritic integration in the CNS', Department of Epileptology, University of Bonn, 2Neuronal Networks Group, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE)

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מציגים מייקר Iontophoresis המהיר של נוירוטרנסמיטורים כטכניקה לחקור אינטגרציה של אותות postsynaptic עם דיוק מרחב ובזמן.

תקציר

אחד מהאינטרסים הבסיסיים במדעי המוח הוא להבין את האינטגרציה של תשומות מעוררות ומעכבות לאורך המבנה המורכב מאוד של העץ הדנדריטי, שסופו של דבר מוביל לפלט עצבי של פוטנציאל פעולה באקסון. ההשפעה של פרמטרים מרחב ובזמן שונים של קלט סינפטי ספציפי על פלט עצבי היא כעת תחת חקירה, למשל הנחתה מרחק תלויה בתשומות דנדריטים, האינטראקציה מיקום תלויה של מרחבית כניסות נפרדות, את ההשפעה של עיכוב GABAergig על שילוב מעורר, ליניארי ומצבים שאינם ליניארי אינטגרציה, ועוד רבים.

עם מיקרו Iontophoresis המהיר של גלוטמט וגאבא ניתן לחקור את האינטגרציה מרחב ובזמן של עירור ועיכוב glutamatergic GABAergic בדיוק. דרישות טכניות קריטיות הם או מנורת ניאון triggered, דיודה פולטת אור (LED), או SCA שני פוטוניםnning מיקרוסקופ כדי להמחיש סניפים דנדריטים ללא החדרת צילום נזק משמעותי של הרקמה. יתר על כן, זה מאוד חשוב שיהיה מגבר המייקר Iontophoresis המאפשר לפיצוי קיבול מהיר של pipettes עמידות גבוהה. הדבר חשוב נוסף הוא שלא משדר הוא שוחרר אופן לא רצוני על ידי טפטפת במהלך הניסוי.

ברגע שהוקם, טכניקה זו תיתן איתות אמינה לשחזור עם הנוירוטרנסמיטר גבוה וסגוליות מיקום. בהשוואה לגלוטמט ומשחררות רפרוף גאבא, Iontophoresis המהיר מאפשר שימוש בשתי המשדרים באותו הזמן, אבל במקומות רחוקים מאוד וללא הגבלה לשדה הראייה. יש גם יתרונות בהשוואה לגירוי חשמלי מוקדי של אקסונים: עם מיקרו Iontophoresis מיקומו של אתר הקלט בהחלט ידוע וזה בטוח שרק מוליך עצבי של עניין הוא שוחרר. עם זאת יש בו כדי להיחשב שעם מיקרו Iontophoresis בלבדpostsynapse מופעל והיבטי presynaptic של שחרור הנוירוטרנסמיטר לא נפתרו. במאמר זה אנו מדגימים כיצד להגדיר את מיקרו Iontophoresis בניסויי פרוסת מוח.

מבוא

תאי עצב במערכת העצבים המרכזית מקבלים מגוון של תשומות הסינפטי על התהליכים דנדריטים 1 הדקים ומסועפים שלהם. שם, מרבית התשומות דנדריטים המעוררות מתווכים על ידי סינפסות glutamatergic. יכולות להיות מופעלות סינפסות אלה בדרך מופצת מרחבית, וכתוצאה משילוב של פוטנציאל לינארי postsynaptic postsynaptic מעוררים (EPSPs). אם הסינפסות מופעלות בו זמנית ובקרבת מרחבי בדנדריט, ניתן לשלב תשומות מעוררות אלה הנ"ל ליניארי ולייצר 2-5 קוצים הדנדריטים.

יתר על כן, האינטגרציה של תשומות מעוררות תלויה במיקום של הקלט על העץ הדנדריטי. אותות המגיעים לאזור ציצה הדיסטלי הם הרבה יותר מוחלש מתשומות הפרוקסימלי בשל כבל סינון 6. בהיפוקמפוס, תשומות רחוקות לדנדריטים ציצת ​​שיער apical נוצרות על ידי אזור במוח שונה מאלה על dendri הפרוקסימליTES 7. שאלה מרגשת היא אפוא, כיצד קלט הסינפטי מעובד על ידי תאי דנדריטים שונים ואם שילוב הדנדריטים מסדיר את ההשפעה של תשומות שכבות אלה על ירי עצבי בדרכים שונות.

לא רק את המאפיינים התפקודיים, תכונות מורפולוגיות של דנדריט, המיקום והקיבוץ באשכול של התשומות המשפיעים על האינטגרציה הדנדריטים של תשומות מעוררות, גם את התשומות המעכבות נוספות ממסופי GABAergic מכריע לקבוע את היעילות של סינפסות glutamatergic 8,9. היבטים שונים של אינטגרציה הסינפטי יכולים להיחקר באופן אידיאלי באמצעות מוליך עצבי המייקר Iontophoresis, המאפשר יישום מוגדר מרחבית של נוירוטרנסמיטורים שונים לתחומים דנדריטים. כאן אנו מדגימים כיצד להקים מייקר Iontophoresis של גלוטמט וגאבא הצלחה לחקור אינטגרציה אות בתאי עצב.

ליישום זה, קנס שקצהוpipettes עמידות גבוהה מלאים בפתרונות הנוירוטרנסמיטר מרוכזים משמשים. pipettes אלה ממוקמים קרוב לקרום החיצוני של התא, שבו לקולטנים העצביים נמצאים. הדמיה טובה של הענפים הדנדריטים נדרש. זו מושגת הטובה ביותר באמצעות צבעי ניאון, אשר הציגו באמצעות פיפטה את התיקון. לאחר מכן דופק קצר מאוד (<1 אלפיות השנייה) נוכחי (בטווח של 10-100 Na) משמש כדי להוציא את מולקולות מוליך העצבי הטעונות. עם פולסים קצרים אלה ופיצויים קיבול אפקטיביים, יכולים להיות התעוררות פוטנציאלים או זרמי postsynaptic עם דיוק זמן ומרחב גבוה, מה שאומר שהמיקום של הקלט מעורר ידוע במדויק. גלוטמט מייקר Iontophoresis יכול להפעיל סינפסות ברדיוס מוגדר, שהוא קטן מ 6 מיקרומטר כפי שמוצג כאן (איור 1 9), אבל זה אפשרי גם להגיע לרזולוצית סינפסה אחת 10-12.

היינה, מ ', ואח' הראה כי הרזולוציה מרחבית של מיקרו-Iontophoresis מהיר יכולה גם להיות מותאמת לאיתור גדלים מתחת ל -0.5 מיקרומטר, שהוא קטן יותר מגודל הנקודה שהושג באופן קבוע עם משחררות רפרוף שני פוטונים של גלוטמט 13. עם מיקרו Iontophoresis מהר זה בקלות ניתן להשתמש בשתיים או יותר pipettes iontophoretic ולמקם אותם במקומות שונים, אפילו מרוחקים על העץ הדנדריטי. בדרך זו, יכולה להיחקר אינטגרציה של אירועים מעוררים, כוללים אלה ממסלולים שונים,. כמו כן ניתן להשתמש גלוטמט ופיפטה iontophoretic מלא GABA באותו הזמן. בדרך זו ניתן ללמוד את ההשפעה של עיכוב GABAergic במקומות שונים ביחס לקלט מעורר (בנתיב, עיכוב מחוץ לנתיב). כמו כן, ההשפעה של עיכוב על ידי interneurons מיקוד תחומים עצביים ספציפיים, כמו דנדריטים דיסטלי, סומה או אקסונים 14, ניתן לחקור באמצעות Iontophoresis GABA. בנוירונים בתרבית, מיקרו Iontophoresis המהיר מציע את ההזדמנות כדי investigate הפצת סינפסה אחת ואת ההיבטים הבסיסיים של תקשורת הסינפטית בתאי עצב בפירוט רב יותר 10,11.

במאמר זה אנו מדגימים בפירוט כיצד להקים Iontophoresis גלוטמט וגאבא לשימוש בפרוסות המוח חריף, המאפשר חקירת אינטגרציה הסינפטי של תשומות מעוררות ומעכבות בתלות במיקום קלט, את נקודות החוזק של קלט, ועיתוי, לבד או ביחסי גומלין. אנו להצביע על יתרונות ומגבלות של טכניקה זו וכיצד לפתור בעיות בהצלחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דרישות מערכת

  1. מערכת מיקרוסקופ: ראיה טובה של דנדריט היא קריטית. אם זמין, להשתמש במערכת מיקרוסקופ שני פוטונים סריקת לייזר. בניסויים שלנו השתמשנו בהיקף TRIM השני, LaVision BIOTEC, בילפלד, גרמניה או רביעי מערכת אולטימה, ערבה טכנולוגיות, מידלטון, ויסקונסין מצויד טי: ספיר ultrafast פעם לייזר (זיקית Ultra II, קוהרנטית) ואובייקטיבי NA גבוה (60x, 0.9 NA, אולימפוס) כדי להמחיש את דנדריטים שהיינו מלאים בצבע פלואורסצנטי באמצעות פיפטה את התיקון. למרות שהוא חשב שצילום נזק כפחות חמור באמצעות סריקת 2 פוטונים, להפחית את כוח לייזר (להלן 8 מגה ואט ברקמות) וישב פעמים (להלן 1 μsec) או עד כמה שניתן.
  2. אפשרות שנייה היא להפעלת מקור אור פלואורסצנטי שדה רחב (LED או מנורת ניאון) סינכרוני עם רכישה כדי לצמצם את זמן חשיפה עד כמה שניתן. יש לנו להשתמש monochromator עם מקור אור משולב (TILLPhoטוניק, Gräfelfing, גרמניה) על מיקרוסקופ Zeiss Axioskop 2 FS זקוף שהיה מצויד בתאורת אינפרא אדום Dodt ניגודיות (TILLPhotonics, Grafelfing, גרמניה). בניסויים שלנו זמני חשיפה בדרך כלל נע בין 10 אלפיות השני למקסימום. 30 אלפיות השניים.
  3. השתמש במגבר המייקר Iontophoresis מהיר, למשל מערכת מיקרו Iontophoresis שני ערוצי MVCS-C-02 (NPI אלקטרוני, תם, גרמניה) עם פיצוי קיבול מהר. יש את microelectrodes Iontophoresis קנס שקצהו התנגדויות של 25-100 MΩ (מכריע בהתאם לגודל וצורת טיפ פיפטה), וניתן להשיג זמני עלייה מהירים רק אם פיצוי הקיבול של מגבר iontophoretic הוא מכוון בצורה אופטימלית. פיצוי מהיר זה יש צורך ליישם פולסים הנוכחי עם הופעה קצרה ומהירה במגוון תת אלפית השנייה לפיפטה iontophoretic ובכך להוציא את המשדר עם רזולוציה מרחבית גבוהה בגדלים ספוט מתחת 1 מיקרומטר 13. מגברי Iontophoresis הם אלכל כך זמין ממספר חברות אחרות, דבר שלא נבדקו במעבדה שלנו. מכשירים אלו הם לידיעתנו אינה מצוידת במעגלי פיצוי קיבול.

2. הכן את פתרונות

  1. הכן מלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) ופתרון פנימי כפי שהוא נדרש לתכנון הניסוי. התוספת היחידה לפתרון הפנימי, אשר נדרש, היא צבע פלואורסצנטי אדום או ירוק (לדוגמא מיקרומטר 50 ל 200 אלקסה פלואוריד 488 או 594 hydrazide, Invitrogen), תלוי בציוד האופטי. הנה דוגמה לסוכרוז ACSF אשר יכול לשמש לנתיחה, במ"מ: 60 NaCl, 100 סוכרוז, 2.5 KCl, 1.25 אא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 CaCl 2, 5 MgCl 2, 20 גלוקוז; ולACSF הנורמלי פתרון לניסויי תיקון-מהדק במ"מ: 125 NaCl, KCl 3, 1.25 אא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2.6 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 15 גלוקוז.
  2. Carbogenize (95% 2 O, 5% CO 2) כל הזמן את כל פתרונות תאיים.
  3. הכן את הפתרון פנימי, למשל, במ"מ: 140 K-גלוקונאט, 7 KCl, 5 HEPES החומצה, 0.5 MgCl 2, 5 Phosphocreatine, 0.16 EGTA; עם 50-200 מיקרומטר אלקסה 488.
  4. לגלוטמט מייקר Iontophoresis להכין פתרון עם 150 חומצה גלוטמית מ"מ ולהתאים את ה-pH 7.0 עם NaOH. הוסף מיקרומטר 50 -200 אלקסה פלואוריד 488 או 594 hydrazide (Invitrogen) להדמיה.
  5. לIontophoresis של GABA להכין פתרון 1 M GABA ולהתאים את ה-pH ל 5 עם HCl 15. ב-pH GABA זו נזקפת, ורק אז הוא יכול להיות מיושם באמצעות Iontophoresis. יש לציין כי ה-pH הנמוך בפתרון נפלט למרחב תאי עשוי להשפיע על השידור עצמו 16,17 GABA.
    הגן על פתרון GABA מאור ולעתים קרובות להכין פתרון מניות GABA טרי, שכן פתרון מבוגר יכול לאבד את האפקטיביות שלה.
  6. אם קשה לראות את אירועי GABAergic, hiGH Cl - הפתרון פנימי הנהיגה כוח, למשל על ידי משמיט KCl, עשוי לעזור כדי להמחיש את אירועי GABAergic כדי לראות אם הוא עובד Iontophoresis GABA, אך כדי לחקור אינטגרציה הסינפטי כוח מניע פיסיולוגי עשוי להיות מומלץ. לגילוי כללי של אירועי GABAergic קטנים, פרוטוקול שמוצג באיור 8C יכול לעזור.

3. משוך ולבדוק את Pipettes Iontophoresis

  1. באופן כללי, מושך את pipettes הנכון הוא אולי השלב הקריטי ביותר כדי להשיג Iontophoresis הנוירוטרנסמיטר המבוקר. בעת השימוש בIontophoresis בתרבית תאים, ניתן למשוך דומות לחד microelectrodes 10 אלקטרודות עדינות מאוד. בניסויי תיקון-מהדק בפרוסות חריפות, לעומת זאת, pipettes דק מאוד אלה לכופף על פני השטח פרוס כאשר הם הורידו לתוך הרקמה עם זווית, מה שהופך את זה בלתי אפשרי להגיע לדנדריטים עמוקים יותר.
  2. לכן, למשוך את פיפטה עם טיפ קטן מאוד, כך שאף neurotransmitter יכול לדלוף החוצה, אבל הטיפ צריך להיות עדיין נוקשה מספיק כדי לחדור לתוך הרקמה (איור 2). לדוגמה, השתמש 150 GB F 8P pipettes ייצוגית (מדע מוצרים, Hofheim, גרמניה) וחולץ אופקי (לדוגמא DMZ-יוניברסל פולר, Zeitz-מכשירי GmbH, Martinsried, גרמניה; או פולר P-97, Instrument חברת סאטר , Novato, קליפורניה) עם כמה מדרגות, מושכים כדי להשיג פתח קטן, אלא גם טאפר קצר עם זווית חדה (איור 2 וטבלה 2).
  3. כמו כן ניתן להשתמש pipettes זכוכית קוורץ למשוך pipettes iontophoretic 10. אלה אמורים להיות תכונות מכאניות טובים יותר ולהיות אמינים יותר, אך מושכי לייזר מיוחדים נדרשים. אבל אפשר גם להגיע לתוצאות טובות עם pipettes הזכוכית רגיל, המשמשים בדרך כלל למשייכת pipettes תיקון.
  4. לבדוק את ביצועי פיפטה והתנגדות בתא ללא רקמות, לפני השימוש בהם בפעם הראשונהזמן, שכן דליפה של גלוטמט עלול לפגוע ברקמות.
  5. הגדר את מגבר Iontophoresis בצורה נכונה. ואז למלא את פיפטה עם תמיסה המכילה צבע מוליך עצבי ולמקם אותו לתוך האמבטיה (ACSF).
  6. לפצות את הקיבול (איור 3). בדרך כלל pipettes החדים מאוד יהיה לי קיבול גבוה יותר מאשר בוטים אלה.
  7. בדקו את ההתנגדות של פיפטה: יש מגבר המייקר Iontophoresis משמש כאן לבנות בתכונה למדידת התנגדות פיפטה. זה מעורר פולסים מלבניים בדיקה קצרה, שיכול להיות במעקב עם אוסצילוסקופ רגיל או חיבור למחשב עם תוכנת רכישת לוח / D. בהתאם לצורה ואת גודל הקצה, הקצה צריך להיות התנגדות בין 25-90 MΩ.
  8. פוקוס על הקצה עם מטרת טבילה במים 60x או 40X ולעבור להדמית ניאון ואם אפשר, להתקרב אליו אם דליפות צבע ניאון מקצה פיפטה, להחיל חיובי קטן (במקרה של Glutamate) או שלילי (במקרה של GABA, איור 4) לשמר נוכחי (<0.02 μA). אם זה לא עוזר לבטל את הדליפה, לשנות את פיפטה.
  9. החל נוכחי צעד חזק או שימוש על ההדק הידני ולנטר את הקצה בתמונה הניאון כדי לראות אם יכול להיפלט אל מחוץ לפיפטה הפתרון. כאמור לעיל, את הקוטביות של הדופק הנוכחי בהתאם לתשלום של המולקולה שאמורה להיפלט. כדי להוציא אותו גלוטמט הוא זרם שלילי ולגאבא נוכחי חיובי (איור 4).
  10. בועות אוויר בפיפטה שפליטת הבלוק של צבע ומשדר, יכולה להיות מסומנת על ידי החלת פליטה גבוהה מספר פעמים הנוכחיות.
  11. יחדיו, אם אין דליפה גלויה ופליטת מבחן הייתה מוצלחת, לפצות את הקיבול ולהתחיל את הניסוי.
  12. זהירות: מאחר שפיצוי הקיבול מושגת על ידי מעגל משוב, מעגל זה יכול להחטיא את המטרה או להתנדנד אם הוא overcompensated. בעדינות להשתמש בהגדרת החיוג לפיצוי קיבול.
  13. בהתאם ליציבות חולץ לפעמים יש צורך להתאים את ההגדרות חולץ מהעת לעת, שכן נימה אולי השתנתה מאפיינים. עם זאת, אם פעם אחת פיפטה טובה מיועדת, ניתן להשתמש בו במשך כמה ימים. לפיכך, לאחר שסיים את הניסוי לאחסן פיפטה iontophoretic במכל סגור ללא פגיעה בקצה.
  14. לניסוי הבא למלא את פיפטה עם פתרון הנוירוטרנסמיטר, להחיל כמה פולסים הוציאו חזקים כדי לנקות את הקצה ולאחר מכן לבדוק אם המאפיינים (לדוגמא התנגדות) שינוי באופן משמעותי. לאחר מכן לפצות את הקיבול ולהשתמש בפיפטה שוב. אין להשתמש בפיפטה יחידה עם פתרונות הנוירוטרנסמיטר שונים.

4. הכן את פרוסות המוח

  1. אם מיקרו Iontophoresis משמש בפעם הראשונה בהחלט להכין את הפרוסות לאחר הקמת תכנית חולץ מהימן עובדת.
    2. <נהלי p> לבצע הרדמה ועריפת ראש בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של המוסד שלך או הרשות המקומית.
  2. לאחר סילוקו של המוח, להעביר אותו לקרח סוכרוז ACSF הקר (ראה פרוטוקול 2.1).
  3. לחתוך את האזור של עניין לפרוסות בעובי המתאים (לדוגמה 300 מיקרומטר).
  4. דגירה את הפרוסות בסוכרוז ACSF על 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כתוצאה מכך, להעביר אותם לתא המכיל החזקה שקועה ACSF הרגיל בטמפרטורת חדר.
  5. לאורך כל ההכנה וניסוי carbogenize ACSF מקיף את הפרוסות עם 95% 2 O, 5% CO 2.

5. להקים הקלטה כל תא

  1. מקם את פיפטה Iontophoresis (ים) כבר קרוב לפני השטח פרוס לפני תיקון תא, כדי להימנע ממיצוב לטווח ארוך, לאחר קביעת המצב כל התא.
  2. משוך התנגדות נמוכה תיקון פיפטה (3 - mΩ 5), למלא אותו עם דאתם מכילים פתרון פנימי ולהפעיל לחץ חיובי לפיפטה (30 - 60 mbar).
  3. הזן את האמבטיה וגישה לתא תחת הדרכה חזותית (ניגוד dodt אינפרא אדום או שתיים תמונת ניגוד שיפוע פוטון).
  4. לפקח על התנגדות פיפטה עם דופק בדיקה (למשל -10 mV, 20 אלפיות שני) במצב מהדק מתח. כשנוגע ברקמה לתקן את הפוטנציאל לקזז.
  5. מתקרב לתא ודחף בעדינות את קצה פיפטה לתוכו עד "גומה" ניתן לראות בבירור. מייד לשחרר את הלחץ של פיפטה, להחיל 40 - לחץ שלילי mbar 60 ולעבור את פוטנציאל הממברנה ל-65 mV.
  6. כשמגיע הנוכחיים מחזיק ערכים מתחת 100 הרשות הפלסטינית, תשחרר את הלחץ השלילי.
  7. לאחר הקמת חותם גיגה (התנגדות> 1 GΩ), קרע הקרום עם שאיבה קצרה, חזקה לפיפטה או פיצוי יתר קצר של מעגל פיצוי הקיבול.
  8. תלוי באיזה מצב (מהדק מתח או נוכחי) נדרשלתכנון הניסוי, לפצות כראוי.
  9. התחל להביא פיפטה iontophoretic לעמדתו הסופית. אם יש צורך בתיאור מפורט יותר של כיצד לבצע בהצלחה הקלטות מהדק תיקון, ישנם מספר קווים מנחים מצוינים זמין 18,19.

6. הנח את פיפטה iontophoretic וליצור פוטנציאל iontophoretic postsynaptic

  1. באופן כללי, ניתן עוררו אירועי iontophoretic במקומות מוגדרים, בהתאם לניסוי הרצוי, למשל, בדנדריט קוצני למייקרו Iontophoresis גלוטמט, בפיר הדנדריטים, סומה, או קטע ראשוני האקסון לגאבא מייקר Iontophoresis.
  2. מתקרב עד התא למרחק כ 1 מיקרומטר מבלי לגעת בו. לאחר שהגיע לעמדתו של עניין זה קריטי, כי אין הנוירוטרנסמיטר דולף החוצה, וכי קיבול פיפטה הוא פיצוי בצורה נכונה.
  3. אם מתקרב לתא עם גלוטמט מלא pipett iontophoreticהדואר גורם לשלילת קוטביות זיהוי של פוטנציאל הממברנה, להתאים לשמר נוכחי אם אפשר, או לשנות את פיפטה.
  4. החל פולסים הנוכחי שלילי קצר, מתחיל מאפס ולהגביר את הזרם באופן שיטתי (למשל 0.1-0.4 אלפיות שני, 0.01-1 μA פולסים). זה עוזר כדי לגלות שבטווח הנוכחי iontophoretic מעורר את התגובות הרצויות בניסוי ספציפי ההגדרה.
  5. במידה ואין תגובה לגילוי, להרים את כמה מאה מיקרומטרים טפטפו ולהחיל נוכחי השליפה חזקה (> 0.1 μA) כדי לנקות את הקצה. התאם את פיצוי הקיבול, מתקרב לתא, ונסה שוב.
  6. אם עדיין אין תשובה, להפחית לשמר נוכחי. להיות מאוד זהיר עם הגדרות החיוג מאז הליך זה יכול לגרום לשחרור הנוירוטרנסמיטר בלתי מבוקר. לכן, כל הזמן לפקח על הקלטת כדי לזהות שינויים המתאימים בפוטנציאל הממברנה.
  7. אם קשה לזהות אירועי GABAergic, זה יכול להיות מועיל כדי להשתמשn הרכב פתרון פנימי מניב בCl גבוה - כוח מניע. כדי להשיג זאת, להפחית את Cl - ריכוז בפתרון פיפטה (ראה סעיף 2.6 פרוטוקול.). זה יגרום אירועי GABAergic גדולים יותר בפוטנציאל הממברנה מנוחה בשל כוח מניע גבוה יותר.
  8. לחלופין, להזריק שלבים הנוכחיים ארוכים וכתוצאה מכך סיכויי פוטנציאל הממברנה מ-100 mV ל -48 mV (8C איור). עם פרוטוקול זה Cl - כוח מניע הוא גדל בפוטנציאלי hyperpolarized גורמים לתגובת GABA depolarizing.
  9. כמו כן ניתן להשתמש בפרוטוקול ההזרקה הנוכחי הצעד כדי לקבוע את פוטנציאל ההיפוך של האירועים עוררו, אשר מסייע לקבוע את אופי GABAergic של האירועים. הזליגה של GABA היא קשה יותר לזיהוי מאשר דליפה של גלוטמט. במקרה זה, ניטור מתמיד של התנגדות הקלט יכול לעזור, כאשר טפטפת מלא GABA הוא התקרב. אם התנגדות הכניסה יורדת, לשמור נוכחית יכול bהדואר מוגבר או יש להשתמש פיפטה שונה.
  10. כניסויי בקרה לIontophoresis גלוטמט, אנו מציעים Ca 2 + ניסוי הדמיה, באמצעות 200 מיקרומטר OGB-1 ולא EGTA בפתרון פיפטה לדמיין זרימת סידן מקומית שעלול להיגרם כתוצאה מדליפת גלוטמט.
  11. באופן כללי, כדי להשיג תגובה יציבה שזה מאוד חשוב שתהיה יציב מכאני פיפטה כדי למנוע סחיפה לאורך זמן. הסחף יכול להיגרם על ידי שינויי טמפרטורה, ולכן מומלץ לעבור על הציוד לפחות חצי שעה לפני המדידות כדי למנוע סחיפה תרמית. הקפד להשתמש בחותמות דיו טובות בבעל פיפטה והקצה הוא באמת קבוע. בעל עצמו יכול להיות קבוע בנוסף עם סרט טפלון, יתר על כן, כדי להיות בטוח שאין מתח על הכבלים מheadstage או מניפולטור, שגם הוא מקור פוטנציאלי של סחיפה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גישה פשוטה כדי לקבוע את ההתפשטות המרחבית של Iontophoresis היא לחזור בי פיפטה iontophoretic השלבים מדנדריט, תוך שמירה על גלוטמט נפלט מתמיד. מצאנו כי ההיקף המרחבי של גירוי מייקר iontophoretic היה בקוטר של כ 12 מיקרומטר (איור 1 מראה רדיוס). כמה עמוק ברקמות יכול לשמש Iontophoresis תלוי בקשיחות של פיפטה. עם זאת, את pipettes iontophoretic הדרוש לניסויים בפרוסות (איור 2), המשמשים כאן, לא מגביל את עומק החדירה. במקום זאת המערכת האופטית והרזולוציה יורדת בעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן נסביר איך ליישם מייקר Iontophoresis המהיר של נוירוטרנסמיטורים לחקור אינטגרציה הסינפטי בדנדריטים. טכניקה זו שימש בהצלחה לחקור שידור סינפטי glutamatergic וGABAergic באזורים שונים במוח במבחנת in vivo 9,20-22. מיקרו-Iontophoresis שימש במשך יותר מ -60 שנים, אבל בשנים הראשונות זה היה בשימוש בעיקר לאופן מקומי להחיל נוירוטרנסמיטרים ותרופות על לוחות זמנים איטיים או בינוניים 23 או לmicroinjection של חומרים לתוך תאים 24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים לאנס ריינר פולדר, מרטין פורמן ווקר ג'קסון לזהירות לקרוא את כתב היד. החוקרים קיבל מימון שהועמד על ידי משרד המחקר MIWF של מדינת Northrhine-Westfalia (SR), שיתוף הפעולה BMBF-Projekträger DLR ארה"ב לגרמניה במדעי המוח חישובית (CRCNS; SR), מרכזי התמחות במחלות ניווניות (כהן; SR), ואת האוניברסיטה של ​​תכנית מימון בין חומות בון (BONFOR; SR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
 <חזק>חומר
מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני (TRIM Scope II), ו-Ultima IV, Prairie Technologies, מידלטון, ויסקונסין)LaVision Biotec, בילפלד, גרמניה 
מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני Ultima IVPrairie Technologies, מידלטון, ויסקונסין, ארה"ב 
Ti:Sapphire לייזר פועם מהיר במיוחדזיקית Ultra II, קוהרנטי 
60X אובייקטיב, NA 0.9אולימפוס 
Zeiss Axioskop 2 FS מיקרוסקופ זקוףTILLPhotonics, Grä felfing, גרמניה 
מונוכרומטורTILLPhotonics, Grä felfing, גרמניה 
מערכת מיקרו-יונטופורזה MVCS-02NPI אלקטרוניקה, Tamm, גרמניה 
Sutter puller P-97Sutter Instrument Company, Novato, CA 
חוטי זכוכית (150 GB F 8P)Science Products, הופהיים, גרמניה 
 <חזק>מגיב
Alexa Fluor 488 הידרזידבדיקות מולקולריות טכנולוגיות חייםA-10436 
Alexa Fluor 594בדיקות מולקולריות טכנולוגיות חייםA-10438 
NaClסיגמא אולדריץ'S7653 
KClסיגמא אולדריץ'P9333 
NaH2PO4Sigma AldrichS8282 
NaHCO3Sigma AldrichS6297 
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S7903 
CaCl<תת>2סיגמא אולדריץ'C5080 
MgCl2Sigma AldrichM2670 
גלוקוזסיגמא אולדריץ'G7528 
K-גלוקונאטסיגמא אולדריץ'G4500 
חומצת HEPESסיגמא אולדריץ'H4034 
פוספוקריאטיןסיגמא אולדריץ'P7936 
EGTAסיגמא אולדריץ'E3889 
חומצה גלוטמיתסיגמא אולדריץ'G8415 
GABAסיגמא אולדריץ'A5835 
NaOHMerck1.09137.1000 
HClMerck1.09108.1000 

מקורות

  1. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  2. Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
  3. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
  4. Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
  5. Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
  6. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
  7. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
  8. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
  9. Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
  10. Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
  11. Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
  12. Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
  13. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
  14. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
  15. Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
  16. Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
  17. Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
  18. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  19. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
  20. Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
  21. Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
  22. Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
  23. Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
  24. Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
  25. Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
  26. Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
  27. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
  28. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הגשה של גלוטמטהגשה של GABAעץ דנדריטיקונפיגורציית תא שלםפיצוי קיבולהתנגדות פיפטהדימות פלואורסצנטיפרוסת מוח
מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.