רקמת שומן (AT) היא אתר של הפעלת תא חיסונית חזקה ואינטראקציה. כמעט בכל התאים של המערכת החיסונית נמצאים בAT ויחסים שלהם שונו על ידי השמנת יתר. בידוד נכון, כימות, ואפיון של אוכלוסיות בתא חיסון הם קריטיים להבנת תפקידם במחלה immunometabolic.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגילוי של חדירת מקרופאג גדל ברקמת השומן (AT) של מכרסמים ובני אדם סובלים מהשמנת יתר הוביל להתגברות העניין בתרומה של תאים חיסונית לעמידות לאינסולין מקומית ומערכתית. בידוד וכימות של אוכלוסיות תאי חיסון שונות ברזה והשמנת יתר בחברה הוא טכניקה מנוצל בדרך כלל במעבדות immunometabolism; טיפול עדיין קיצוני יש לנקוט הן בבידוד בתא בכלי דם סטרומה וניתוח תזרים cytometry כך שהנתונים המתקבלים הוא אמין ולפרש . בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך בשר טחון, לעכל, ולבודד את החלק היחסי של כלי הדם המועשר בתאי סטרומה החיסונית. כתוצאה מכך, אנו מראים כיצד מקרופאגים נוגדני התווית ולימפוציטים מסוג T וכיצד כראוי שער עליהם בניסויי cytometry זרימה. חלקות זרימת cytometry נציג מעכברים שמנים שאוכלים שומן רזים וגבוהים בשומן האכילו נמוכים מסופקות. אלמנט קריטי של ניתוח זה הוא השימוש בנוגדנים שעושיםלא לזרוח בערוצים שבו במקרופאגים הם autofluorescent אופן טבעי, כמו גם שימוש בפקדי פיצוי הולם.
מבוא
מבחינה היסטורית, רקמת השומן (AT) כבר נתפסה כאיבר אדיש של אחסון שומנים בדם, שמתרחב ומתכווץ בתגובה למאזן אנרגיה. כעת אנו מבינים כי AT מייצג איבר האנדוקרינית דינמי שמפריש באופן פעיל מספר ההורמונים, אשר משפיעים באופן ישיר התנהגות אכילה והומאוסטזיס הגלוקוז מערכתי. בנוסף, בעשור האחרון חלה עלייה הולכת וגובר לאוכלוסיות הרבות של תאים חיסוניים המתגוררות בכל חלק סטרומה וסקולרית (SVF), כמו גם את תרומתם ל-AT הומאוסטזיס.
היכולת להפריד בין AT adipocyte וSVF באמצעות לעכל collagenase אחריו צנטריפוגה ההפרש תואר לראשונה בשנת 1964 על ידי Rodbell 1. Collagenase השני משמ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חומרים כימיים ומתכלה
לפני שתתחיל בפרוטוקול הניסוי הזה, להכין את ריאגנטים הבאים:
- 70% אתנול
- 1X PBS
- 1X DPBS (ללא Ca וMg) בתוספת 0.5% BSA
- FACS חיץ: 1X DPBS (ללא Ca ומ"ג), 2 mM EDTA, ו -1% FCS
- חיץ ACK: Cl 150 מ"מ NH 4, 10 מ"מ 3 KHCO, ומ"מ Na 2 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עיכול collagenase של AT אחריו צנטריפוגה ההפרש שימש לבודד את SVF מרפידות שומן epididymal של עכברים ממין זכר C57BL/6J האכיל שומן נמוך (10% מקלוריות שומן) או שומן גבוה (60% קלוריות משומנים) דיאטה (LFD וHFD , בהתאמה) במשך 16 שבועות. תאים של SVF אז תויגו עם נוגדנים ראשוניים fluorophore-מצומדות לכמת את שיעור הכספומטים קיימא (איור 1) ובתאי T (איור 2) באמצעות ניתוח FACS. gating הראשוני, כולל פיזור אור, אפליה כפיל, ושערים כדאיות מתואר באיורים 1 א &.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עניין גובר בתפקידה של המערכת החיסונית בהשלכות מטבוליות של השמנה הוביל לשימוש הנרחב בזרימת cytometry לאפיין תאים חיסוניים של AT. אף על פי הפרוטוקול המדויק ישתנה בין מעבדות המבוססות על הניסיון שלהם וציוד זמין, כוללים את השלבים הקריטיים עיכול collagenase, צנטריפוגה ההפרש, וסימון אנטיגן פני תא. מטרתו של המאמר הנוכחי היא לספק לפרוטוקול מפורט ומדריך מעשי לבידודה של AT SVF לחוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם AT ו / או ביצוע cytometry זרימה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
התזמורת סימפונית נתמכת על ידי NIH רות ל 'Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK נתמך על ידי מלגת דוקטורים מהאגודה האמריקנית לסוכרת (7-10-MI-05), והוא נתמך על ידי אהה פרס איגוד לב אמריקאי הוקם חוקר (12EIA8270000). ניסויי cytometry זרימה בוצעו במשאבים משותפים Cytometry זרימת VMC. משאבי cytometry זרימת VMC משותפים נתמך על ידי המרכז לחקר מחלות העיכול ונדרבילט (DK058404).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DPBS (ללא Ca או Mg) 10 x 500 מ"ל | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| קולגנאז | Sigma | C6885-5G | |
| תמיסת יודיד פרופידיום | סיגמא | P4864-10 מ"ל | |
| ערימה יציבה 20 מיקרוליטר | Rainin | SS-L10 | |
| 20 מיקרוליטר טיפים מסנן | Rainin | SRL10F | |
| מחסנית יציבה 250 מיקרוליטר טיפים | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 מיקרוליטר טיפים | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 מיקרוליטר טיפים מסנן | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 מיקרוליטר טיפים לסנן | Rainin | SR-L200F | |
| FC בלוק | BD Biosciences | 553142 | |
| פישר 100 דקות מסננות | פישרברנד | 22-363-549 | |
| צלחת במשקל בינוני | פישרברנד | 02-202B | |
| רדיד אלומיניום | פישרברנד | 1213100 | |
| מספריים טחינה | פישרברנד | 089531B | |
| וורטקס | פישרברנד | 2215365 | |
| צינורות חרוטיים 50 מ"ל | BD Falcon | 14-959-49A | |
| צינורות FACS עליונים מסננים | BD Falcon | 352235 | |
| 10 מ"ל נרתיק פיפטה 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| צינורות תחתונים עגולים | BD Falcon | 352058 | |
| 5 מ"ל מזרק | BD Falcon | 309646 | |
| V צלחות תחתונות | Costar | 07-200-107 | |
| העברת נורת פיפטה | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| שייקר | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| מחצלת דבק | Thermo Scientific | 1368750 | |
| צנטריפוגה | תרבית תאים Sorvall | מתאמי 75253839 | |
| Sorvall | 75003723 | ||
| חולדה נגד עכבר CD16 / CD32 | BD Biosciences | 553142 | ריכוז: 0.5 - 1 μ g/ 106 תאים |
| חולדה נגד עכבר F4/80 | eBioscience | 17-4801 | מצומד פלואורופור: APC ריכוז: 0.2 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 17-4321 |
| עכברוש נגד עכבר CD11b | eBioscience | 11-0112 | מצומד פלואורופור: FITC ריכוז: 0.5 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטייפ: 11/1/4031 |
| אוגר ארמני נגד עכבר CD11c | eBioscience | 12-0114 | מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.8 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: Dec-88 |
| עז נגד עכבר MGL1/2 | R& D Systems | FAB4297P | מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.1 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: IC108P |
| עז נגד עכבר CD206 | R& D Systems | FAB2535P | מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.1 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: IC108P |
| Rat נגד עכבר CCR2 | R& D Systems | FAB5538P | מצומד פלואורופור: PE ריכוז: 0.1 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: IC013P |
| אוגר ארמני נגד עכבר TCRβ | BD Biosciences | 553174 | מצומד פלואורופור: APC ריכוז: 0.2 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | מצומד פלואורופור: PE-Cy7 ריכוז: 0.8 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | מצומד פלואורופור: Alexa Fluor 700 ריכוז: 0.2 μ g/ 106 תאים מספר קטלוגי בקרת איזוטיפ: 557963 |
טבלה 1. רשימת חומרים וריאגנטים. |
מקורות
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
