Method Article

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

DOI:

10.3791/50708

⸱

August 7th, 2013

 , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה אנליטית להעריך את החיים של גלוטמט בממברנות astrocytic מהקלטות אלקטרו של זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצפיפות הגבוהה ביותר של מובילי גלוטמט במוח נמצאת בהאסטרוציטים. כמה מובילי גלוטמט התנועה של גלוטמט על פני הקרום עם שיתוף ההובלה של 3 Na + ו 1 + H ונגד התחבורה של K + 1. יכול להיות במעקב הנוכחי stoichiometric הנוצרים בתהליך ההובלה עם הקלטות תיקון-מהדק כל התא מתאים כוכביים. כמובן הזמן הנוכחי נרשם מעוצב על ידי את מהלך הזמן של פרופיל גלוטמט הריכוז כדי שהאסטרוציטים חשופים, קינטיקה של מובילי גלוטמט, ואת מאפייני electrotonic הפסיביים של קרומי astrocytic. כאן אנו מתארים את השיטות הניסיוניות ואנליטי, שניתן להשתמש כדי להקליט זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ולבודד את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מכל הגורמים האחרים המעצבים את צורת הגל של זרמי טרנספורטר astrocytic. השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את החיים oF פלאש ברח מכלוב וsynaptically-שוחרר גלוטמט בממברנות astrocytic בכל אזור במערכת העצבים המרכזית בבריאות ובחוליים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האסטרוציטים הם אחד מסוגי התאים הנפוצים ביותר במוח עם מורפולוגיה בצורת כוכב ובליטות בממברנה עדינות שמרחיבות לאורך neuropil ולהגיע 1,2 קשרים סינפטיים השכן. קרום התא של האסטרוציטים הוא ארוז בצפיפות עם מולקולות טרנספורטר גלוטמט 3. בתנאים פיסיולוגיים, מובילי גלוטמט במהירות לאגד גלוטמט בצד החוץ התאי של הממברנה ולהעביר אותו אל הציטופלסמה התא. בעשותם כך, מובילי לשמור על ריכוז הבסיס הנמוך של גלוטמט ב4 השטח תאי. מובילי גלוטמט בתהליכי astrocytic משובחים סמוכים לגירוי הסינפסות ממוקמים באופן אידיאלי כדי לאגד גלוטמט שוחרר במהלך אירועים סינפטיים כפי שהוא מפזר ממרווח הסינפטי. בעשותם כך, מובילי גם להגביל גלישת ג....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פרוסה

  1. הכן 500 מיליליטר חיתוך פתרון / אחסון המכיל (מ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 0.5 CaCl 2, 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl 2, 26.2 NaHCO 3, 1 אא 2 PO 4, וגלוקוז 22, 320 mOsm, pH 7.4
  2. השתמש בכוס 250 מ"ל כדי להכין את חדר טבילה לפרוסות, למלא אותו עם 200 מיליליטר חיתוך פתרון / אחסון, לחמם אותו באמבט מים ב 34 ° C ו בועה אותו עם 95% 2 O, 5% CO 2.
  3. שמו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההצלחה של הגישה אנליטית שתוארה כאן באופן ביקורתי תלויה בהשגת הקלטות אלקטרו באיכות גבוהה של זרמי טרנספורטר מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית. בחתכי היפוקמפוס עכבר חריפים, האסטרוציטים ניתן לזהות בקלות תחת Dodt תאורה או IR-DIC בגלל הגוף שלהם תאים הקטן (O מיקרומטר = 10) וגרעין בולט (איור 1). המורפולוגיה בצורת כוכב הייחודית שלהם יכולה להיות מוערכת עם epifluorescence, confocal, או מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים, בעת הוספת fluorophore כמו אלכסה 594 (50 מיק.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים גישה ניסויית להשיג קלטות אלקטרו מהאסטרוציטים, פרוטוקול אנליטי לבודד את זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ושיטה מתמטית כדי להפיק את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מזרמי טרנספורטר astrocytic.

ההצלחה של הניתוח מסתמכת על היכולת להשיג הקלטות מהדק תיקון באיכות גבוהה מהאסטרוציטים ועל הדיוק של האלגוריתמים הולמים כדי לתאר את זרמי טרנספורטר. ניתוח deconvolution מסתמך על שתי ההנחות הבאות. (1) התהליכים מר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ תכנית מחקר עירונית (NS002986). AS כתב את כתב היד ויישם את ניתוח deconvolution. JSD פיתחה את הגרסה הראשונית של ניתוח deconvolution והגיב על הטקסט.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CGP52432Tocris1246
(R,S)-CPPTocris173
DPCPXTocris439
LY341495 מלח דיסודיוםTocris4062
MSOPTocris803
NBQX מלח דיסודיוםTocris1044
D,L-TBOATocis1223
PicrotoxinSigmaP1675
MNI-L-glutamateTocris1490
Alexa 594Life TechnologiesA10438
אלקטרודות מטריקסחברת פרדריק הארMX21AES(JD3)
נימי זכוכית בורוסיליקטPrecision InstrumentsPG10165-4
דו-שלבי זכוכית מיקרו-פיפטה חולץNarishigePC-10
Loctite 404 דבק מיידיטד פלה46551
Xe lampRapp אופטואלקטרוניפלאש מיק
איגור פרו 6Wavemetrics
אופציונליות World

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glutamate ClearanceAstrocytic Transporter CurrentsDeconvolution AnalysisWhole cell Patch clampTBOA AntagonistSynaptic StimulationBrain Slice PreparationElectrophysiology RecordingsTransporter Current IsolationFlash uncaged Glutamate

Related Articles