Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

סיכום

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

תקציר

תאי רכס עצביים (NCC) הם אוכלוסיית תאים חולפת וmultipotent שמקורו בצינור העצבי הגבי ונודדת בהרחבה לאורך כל עובר חוליות המתפתחת. בנוסף לאספקת גליה ותאי עצב היקפיים, NCC ליצור מלנוציטים כמו גם רוב שלד קרניו-פנים. הגירת NCC והבידול נשלט על ידי שילוב של מוצא הצירי שלהם יחד בצינור העצבי ואת החשיפה שלהם לאותות תאיים אזורי שונים. תרומה כזו של ligands תאי באה לידי ביטוי במיוחד בתקופת היווצרותה של מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מורכבת ביניהם של הגרעינים עצביים השולטת באופן מקומי (בין השאר) תנועת שרירים בטן ואת תנועתיות מעיים. רוב ENS נגזר מברכה ראשונית קטנה של NCC שמתחייב למסע ארוך על מנת ליישב - במקורי לאופנה הזנב - לכל אורכו של המעי הפוטנציאלי. בין כמה מסלולי איתות ידועיםלהשפיע קולוניזציה NCC enteric, GDNF / איתות RET מוכרת כחשוב ביותר. ואכן, הפרשת spatiotemporally המבוקר של ליגנד RET GDNF ידי mesenchyme הבטן היא בעיקר אחראית למשיכה והדרכתו של NCC enteric-להביע RET ולבתוך הבטן העוברית. כאן, אנו מתארים vivo לשעבר assay נדידת תאים, מה שהופך את שימוש בקו עכבר מהונדס בעלי NCC שכותרתו fluorescently, המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כולל GDNF.

מבוא

תאי רכס עצביים (NCC) הם סוג תא חולף ייחודי לבעלי חוליות שמהווה נגזרים רבים במהלך ההתפתחות העובר. אוכלוסיית תא זו מתעוררת בגבול של הצלחת העצבית, סמוך להאאקטודרם אינו עצבי ^1. במהלך neurulation, כיפוף של מקומות צלחת העצביים NCC לאורך קצה הגב של הצינור העצבי ויוצרים. NCC אז לעבור מעבר אפיתל-mesenchymal, הפרדה ונודדות הרחק בצינור העצבי. NCC ליישב מבנים עובריים שונים, כולל מערכת העיכול שבו הם יוצרים את כל מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מקושרת ביניהם של הגרעינים עצביים מוטבעת בדופן המעי. כפי שנסקר ^2,3 לאחרונה, גנים רבים היו מעורבים בפיתוח של המבנה המורכב הזה.

פרוטוקול

שמירה על האתיקה

ניסויים מעורבים עכברים בוצעו בעקבות המועצה קנדית להנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולמניפולציה של בעלי חיים המשמשים במחקר רפואי. פרוטוקולים הנוגעים למניפולציה של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המוסד הרפואי מאוניברסיטת קוויבק במונטריאול (Comité Institutionnel דה ההגנה des ANIMAUX; מספר התייחסות 0512-R3-650-0513).

1. הכנת ג'לי קולגן

לעבוד בצורה סטרילית, מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה.

תוצאות

התוצאות הבאות הן נציג של מה שניתן להשיג עם הטכניקה שתוארה כאן (איור 1). השימוש בגורמי גדילה (כלומר GDNF) מגרה הגירה של NCC enteric מתוך explant המעיים ולג'ל קולגן-GFP-לבטא (איור 2). למרות שחלק מהתאים לצאת מexplant בהעדר גורמי גדילה, אלה הם בעיקר לא-GFP שכותרתו ויציינו את כניסתה הפסיבית. יש צורך להסיר את פרוסת המעיים מג'ל קולגן על מנת לרשום את התוצאות, כפי שהרקמה זו עדיין מאוכלסת בצפיפות על ידי תאי ניאון ואחרת היה להסתיר את התאים ש.......

דיון

אנו מראים כיצד vivo לשעבר טכניקת תרבות explant שלנו יכולה לשמש כדי לכמת באופן מדויק את פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF. כימות מדויק כזה הוא הקל מאוד על ידי שימוש 200 חלקי מעיים vibratome מיקרומטר עבים במקום חתיכות גדולות של גודל משוער, כפי שתואר ^11,12,15 בעבר. ואכן, זה מאפשר לנו לעבוד עם מספר סביר של תאים בסביבה מאוד לשחזור. ראוי לציין, ההתפלגות אחידה של NCC enteric ניאון בתוך אזור הזנב-ביותר של המעי הדק שממנו פרוסות explant נחתכות גם מאפשרת ניתוח של מס.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אבקת DMEM	Wisent	219-010-XK
NaHCO3	Bioshop	SOB999	Steriflip בדרגת ביוטכנולוגיה
(0.22 מיקרון)	EMD Millipore	SCGP00525
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x	Wisent	450-201-EL
סרום בקר עוברי	Wisent	095-150	קולגן
I	BD	354236
NaOH	Bioshop	SHY700	מדולל ממלאי 10 N ואז
GDNF	Cedarlane	CLCYT305
Falcon 24-well Plate	BD biosciences	353047
מספריים לניתוח	פישר סיינטיפיק	089515
צלחת פטרי מזכוכית	VWR	89000-306
PBS	Sigma	P5493	בדרגת תרבית תאים
	Leica	M125
דומונט #5 מלקחיים	כלים מדעיים עדינים	11251-20
Agarose	Bioshop	AGA001
להב כירורגי	נוצה	21
עט דבק מיידי לכל מטרה	Krazy Glue Krazy	KG824
HM 650V להב רטט מיקרוטום	תרמו סיינטיפיק	920110
פרפורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	P6148
DAPI	סיגמא-אולדריץ'	D9564
טבלה של ריאגנטים וציוד ספציפיים.

מערכת סינון ואקום באיכות גבוהה מסונן סטרילי מיקרוסקופ מנתח בדרגת ביוטכנולוגיה