שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

Summary

השימוש בשיטת הזרקת מחט לחסן תירס וצמחי teosinte עם פתוגן ביוטרופי Ustilago maydis מתואר. שיטת החיסון להזרקת מחט מקלה על מסירה מבוקרת של הפתוגן הפטרייתי בין עלי הצמח שבהם הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות appresoria. שיטה זו יעילה ביותר, ומאפשרת חיסונים הניתנים לשחזור עם U. maydis.

Abstract

תירס הוא יבול דגנים גדול ברחבי העולם. עם זאת, רגישות לפתוגנים ביוטרופיים היא האילוץ העיקרי להגברת הפרודוקטיביות. U. maydis הוא פתוגן פטרייתי ביוטרופי והסוכן הסיבתי של תות תירס על תירס. מחלה זו אחראית להפסדי תשואה משמעותיים של כ -1.0 מיליארד דולר בשנה בארה"ב. 1 מספר שיטות כולל סיבוב יבול,^יישום קוטלי פטריות וטיפולי זרעים משמשים כיום כדי לשלוט תירס smut². עם זאת, התנגדות המארח היא השיטה המעשית היחידה לניהול smut תירס. זיהוי של צמחי יבול כולל תירס, חיטה ואורז העמידים לפתוגנים ביוטרופיים שונים הפחית באופן משמעותי את הפסדי התשואה מדי שנה^3-5. לכן, השימוש בשיטת חיסון פתוגן המספקת ביעילות ובאופן רב את הפתוגן בין עלי הצמח, יקל על זיהוי מהיר של קווי תירס העמידים בפני U. maydis. כמו, צעד ראשון לקראת החדירה קווי תירס עמידים U. maydis, שיטת חיסון הזרקת מחט ושיטת הקרנה תגובת התנגדות נוצל כדי לחסן תירס, teosinte, ו תירס x teosinte קווי התבוננות עם U. maydis זן ולבחור צמחים עמידים.

קווי התבוננות פנימה של תירס, טאוסינט ותירס x טאוסינט, המורכבים מכ-700 צמחים, נשתלו, חוסנו בזן של מידיס אמריקאי, והוקרנו להתנגדות. שיטות החיסון והסינון זיהו בהצלחה שלושה קווי teosinte עמידים בפני U. maydis. כאן מוצג פרוטוקול סינון מפורט של חיסון הזרקת מחט ותגובת התנגדות לקווי גירוי תירס, טאוסינט ותירס x teosinte. מחקר זה מדגים כי חיסון הזרקת מחט הוא כלי שלא יסולא בפז בחקלאות שיכול לספק ביעילות U. maydis בין עלי הצמח וסיפק קווי צמחים עמידים U. maydis כי עכשיו ניתן לשלב ולבדוק בתוכניות הרבייה עבור עמידות למחלות משופרת.

Introduction

מחלות פטרייתיות של צמחים מייצגות את אחד האיומים הבולטים ביותר על החקלאות. הצורך לפתח יבולים עם עמידות משופרת למחלות הולך וגדל בשל צורכי המזון של אוכלוסיית העולם ההולכת וגדלה. פתוגנים צמחיים מדביקים באופן טבעי צמחי יבולים בתחום וגורמים למחלות המשפיעות לרעה על יבול⁶. הוכח כי זיהוי וניצול צמחים עמידים יכול לשפר את ההתנגדות ולהפחית את אובדן התשואה. זנים עמידים זוהו במיני צמחים רבים, כולל תירס, חיטה, אורז ובדורה על ידי כך שהם מחוסנים את הצמחים בפתוגן צמחי ובוחרים לקווים עמידים⁷. לכן, פיתוח ושימוש בשיטת חיסון יעילה יאפשרו לצמחים רבים להיות מחוסנים ומוקרנים להתנגדות. שיטות חיסון שונות שימשו כולל חיסון לטבול, pipeting את תרבות ההשעיה תא פתוגן לתוך המערבולת של הצמח, וחיסון הזרקת מחט^8-11. עם כל שיטה, הפתוגן חייב להיות הציג באופן אמין בין הצמח עוזב שבו הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות של appresoria כדי להבטיח פיתוח פתוגן וזיהום צמחי^12,13.

שיטת חיסון הטבילה כרוכה בהשקעת שתיל צמחי לתוך תרבות השעיית תאים פתוגן, בעוד שיטת הצינור דורשת הצבת תרבות המתלים של תאי הפתוגן למערבולת של שתיל הצמח. עם זאת, קיימות בעיות בשתי השיטות. ראשית, שתי השיטות תלויות בתנועה הטבעית של הפתוגן מפני השטח של העלה לרקמת הצמח המשתנה מאוד. רוב הפתוגנים נכנסים באופן טבעי לצמח דרך פתחים סטומטליים או פצעים על פני השטח של עלה הצמח. עם זאת, קיימת שונות משמעותית ביכולת הפתוגנים לחדור את משטח עלה הצמח דרך הסטומטה ו/או הפצעים על פני העלה. לכן, חדירת פתוגן לא ניתן לשלוט עם כל שיטת חיסון פוטנציאל וכתוצאה מכך נתונים לא עקביים. שנית, כאשר סינון מספר רב של צמחים, שקיעת השתילים לתוך תרבות השעיית תא פתוגן יכול להיות זמן רב ועשוי להגביל את מספר הצמחים שניתן לסנן. לעומת זאת, פרוטוקול חיסון הזרקת המחט המתואר בזאת מספק את תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן בין עלי הצמח המקלים על היווצרות^{נספחים 14}. לאחר מכן הפתוגן מנצל את התוספתן החדש שפותח כדי להיכנס לצמח ומבטל את בעיית החדירה לפתוגן. בנוסף, פרוטוקול חיסון הזרקת מחט מספק מגוון של פנוטיפים עבור תירס וצמחי teosinte כי כבר מחוסנים עם U. maydis ולהפגין זיהום טוב. הפנוטיפים יכולים לשמש כסמן כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר עבור תרבות השעיית תאי הפתוגן וכתוצאה מכך פנוטיפים צמחיים עקביים בתוך ובין ניסויים שונים.

בעקבות חיסון צמחים עם תרבות השעיית תא פתוגן, צמחים מוקרנים בדרך כלל כדי לזהות פנוטיפ עמיד או רגיש^8-11,15. בעוד קשקשי דירוג המחלות נמצאים בשימוש נרחב כדי לסנן ולסווג פנוטיפים צמחיים, סולמות הדירוג משתנים בהתאם לפתוגן המנותח. לכן, הקמת פרוטוקול סולם דירוג מחלה עבור U. maydis ו אינטראקציות תירס יכול להיות מנוצל עבור פתוגנים פטרייתי דומה¹⁶.

סדרת הפרוטוקולים הנוכחית מפרטת חיסון הזרקת מחט עם תרבות השעיית תאים U. maydis והקרנת תגובת עמידות למחלות של תירס, טאוסינט וקווי אינטרוגרסיה של תירס x teosinte. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מוגבלים לחיסון הזרקת מחט של U. maydis לתוך צמחים תירס אבל יכול להיות מנוצל עבור כל פתוגן פטרייתי יחסית מיני צמחים. לכן, הכללת הפרטים של שתי השיטות באותו פרוטוקול תאפשר לחוקרים לנצל ישירות את הפרוטוקולים לחיסון וסינון או לתפעל את הפרוטוקולים המקוריים כך שיתאימו טוב יותר למיני הפתוגן והצמחים המעניינים.

Protocol

1. צמיחת חומר צמחי

1. בחר קווי צמח לחיסון והקרנה. שני קווי תירס, חמישה קווי teosinte, וארבעים קווי תירס x teosinte עם התנגדות לא אופיינית U. maydis שימשו עבור עבודה זו (טבלה 1).
2. זרעי צמחים לניסויים (הזרקתמיאדיס U) ושליטה (הזרקת מים) ניסויי חיסון הזרקת מחט. עשה זאת עבור כל קו צמח.
3. צמח ארבעה זרעים (משכפל) עבור כל קו צמח בדירות קטנות על ידי דחיפת הזרעים על 1/2 אינץ 'לתוך האדמה עם האצבע מכסה עם אדמה קלות(איורים 1A ו 1B). אל תארוז את האדמה על הזרע. שתילת הזרע עמוק יותר או אריזת האדמה על הזרע עלולה לגרום לבעיות עם הופעת השתיל.
4. להשקות את הזרעים לתוך האדמה. ודא כי האדמה ספוגה הזרעים להישאר מתחת לאדמה לאחר השקיה.
5. לאחר השקיה, למקם צמחים בתא צמיחה עם סביבות יום ולילה של 28/20 מעלות צלזיוס טמפרטורה ו 14/10 שעות של photoperiod, בהתאמה וכ 500 μmol / m²   שניות קרינה פעילה פוטוסינתטית בחלק העליון של החופה. לשמור על לחות יחסית במהלך היום והלילה כ 70% ו 90%, בהתאמה.
6. שמור את כל הצמחים באותו תא צמיחה כדי לשמור על סביבת צמיחה כי הוא congruent על פני הניסוי.
7. לאחר 10 ימים, להסיר את הצמחים מתא הצמיחה לחסן את הצמחים עם U. maydis תא השעיה תרבות באמצעות שיטת חיסון הזרקת מחט. הערה: צמחים תירס ניתן לחסן 7 ימים לאחר שתילת^8-10. עם זאת, הצמחים teosinte הם קטנים מדי לאחר 7 ימים. לכן, לחסן הן תירס וצמחים teosinte 10 ימים לאחר השתילה עבור עקביות בתוך הניסוי (ראה שלב 2.12).

2. חיסון הזרקת מחט

1. האם כל העבודה במכסה המנוע זרימה למינאר. הסר U. maydis גליצרול מניות מאחסון מקפיא. השתמש לולאה סטרילית ומניות גליצרול פס של U. maydis בר סוג זנים 1/2 (סוג הזדווגות a1b1) ו 2/9 (סוג הזדווגות a2b2, ליד isogenic כדי 1/2) על תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA) צלחות. לשמור על זנים בנפרד.
2. מניחים לוחות מחשב כף יד פסים עם U. maydis באינקובטור 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים. אם משתמשים בפתוגן ביוטרופי שונה להשתמש בזן המתאים, מדיה ותנאי צמיחה. לפקח על הצמיחה של הפתוגן על פני תקופה של יומיים כדי להבטיח כי U. זן maydis גדל היטב.
3. מוציאים את לוחות מחשב כף יד מהחממה לאחר יומיים. הצלחות צריכות להיות צמיחה פתוגנית טובה ומכילות מושבות בודדות(איור 2A). חשוב להשיג מושבות בודדות. אם מושבות בודדות אינן נוכחות restreak הצלחות בריכוז נמוך יותר.
4. לעשות את כל העבודה במכסה המנוע זרימה למינארי. השתמש בקיסם סטרילי כדי לבחור מושבה אחת עבור כל זן מלוחות מחשב כף יד. מניחים את קיסם המכיל מושבה אחת לתוך מרק דקסטרוז תפוחי אדמה 3 מ"ל (PDB). מומלץ לקבל 2-3 תרבויות.
5. מניחים את 3 מ"ל תרבויות PDB לתוך חממה 30 מעלות צלזיוס / שייקר במשך יומיים ב 200 סל"ד. לפקח על הצמיחה של התרבות לאורך התקופה של יומיים כדי להבטיח את הצמיחה של התרבות. התרבות צריכה להיראות מעוננת מאוד.
6. הסר את תרביות הנוזל מן האינקובטור / שייקר ולמדוד את הריכוז ב OD₆₀₀ כדי להבטיח כי התאים גדלו כדי OD של 1.0 (~ 1 x 10⁷ תאים / מיליליטר)¹⁷.
7. להביא את U. maydis תרביות השעיית תאים לריכוז הסופי של 1 x 10⁶ תאים / מיליליטר, באמצעות מים בנפח התרבות הסופי 30 מ"ל. ריכוז זה באופן עקבי גורם לזיהום טוב של הצמחים עם תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן. ^{17 , 17}

הערה: יש לבדוק ריכוזי השעיית תאים שונים בעת שימוש בזני פתוגן שונים כדי לקבוע את טיטר התא המתאים הדרוש לחיסון^18,19. הריכוז הסופי הנתון לתרבות המתלים של התא יכול לשמש כנקודת התחלה לרטט. הריכוז המתאים של תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן צריך להיות מאומת על ידי הדמיה של פנוטיפים הצמח עם זיהום טוב (איורים 3A-E).

8. מערבבים כמויות שוות של שני זנים U. maydis לפני החיסון. אם באמצעות זן פתוגן אחד להמשיך לשלב 2.9. הכן תרביות השעיית תאים טריות של U. maydis עבור כל ניסוי חיסון והשליך תרביות השעיית תאים לאחר יומיים.
9. עבור חיסון הזרקת מחט ניסיוני, למלא מזרק 3 מ"ל עם U. maydis תרבות השעיית התא על ידי ציור תרבות השעיית התא לתוך המזרק.
10. לחיסון הזרקת מחט הבקרה, מלא מזרק 3 מ"ל במים¹⁷. השתמש באותו הליך לחיסון הזרקת מחט ניסיוני.
11. חבר מחט תת-מזרק 0.457 מ"מ x 1.3 ס"מ לקצה כל מזרק של 3 מ"ל. גודל המחט שנבחר יספק את תרבות המתלים של התא בין עלי הצמח עם נזק מינימלי לרקמת הצמח.
12. הסר את מפעלי הניסוי והבקרה מתא הגדילה 10 ימים לאחר השתילה כהכנה לחיסוני הזרקת מחט(איור 2B)(ראה שלב 1.7).
13. בזהירות להכניס את המחט hypodermic המכיל את U. maydis תא השעיה תרבות לתוך הגבעול של צמח ניסיוני בזווית 90 ° ממש מעל קו הקרקע. הכנס את המחט עד שהיא נמצאת באמצע הגבעול. אין לדחוף את המחט דרך הגבעול(איור 2C).
14. להזריק את המפעל הניסיוני עם כ 100 μl של U. maydis תרבות ההשעיה התא^18,19. זה ישתנה מעט בהתאם לגובה השתיל. תרבות המתלים של התא תדחוף דרך הגבעול ותעבור למערבולת של הצמח. תרבות המתלים של התא תהיה גלויה במערבולת של הצמח. המשך הזרקת 100 μl של תרבות השעיית התא לתוך כל צמח בודד עד מזרק 3 מ"ל ריק.
15. לאחר ההזרקה, להסיר בזהירות את המחט מן גזע הצמח. הסר את המחט מן המזרק ריק עכשיו 3 מ"ל ולמלא במים. חבר את המחט בחזרה למזרק ולדחוף את המים דרך המחט כדי להסיר כל רקמת צמח שעלול להיתפס בקצה המחט.
16. חזור על שלבים 2.9-2.15 עבור כל צמח ניסיוני. בצע את אותו פרוטוקול עבור מפעלי הבקרה על ידי הזרקת מים.
17. הנח את צמחי הניסוי והבקרה המחוסנים בחזרה לתא הגדילה. להשקות את הצמחים מדי יום על ידי הרטבת האדמה לא רקמת הצמח.
18. בדוק את הצמחים מדי יום כדי לזהות התפתחות פתוגן ותגובות התנגדות לצמחים.

3. הקרנת תגובת התנגדות

1. ציון ולתעד את תגובות ההתנגדות עבור כל צמח 7, 10, 14, ו 21 ימים לאחר חיסון (dpi) באמצעות 1 עד 5 סולם דירוג תגובת התנגדות. חומרת המחלה עולה ככל שהערכים המספריים בסולם הדירוג גדלים (טבלה 2). תגובת התנגדות של 1C (עלה כלורוזיס), 1A (ייצור אנתוציאנין עלה) או 2 (עלי דפנה קטנים) מצביעה על התנגדות. תגובת התנגדות של 3 (גזע), 4 (גל בסיסי) או 5 (מוות של צמחים) מצביעה על רגישות (איורים 3A-E וטבלה 2)^18,19.
2. ציון הן מפעלים ניסיוניים והן מפעלי בקרה ודירוגי תגובת התנגדות שיא.
3. השווה את תגובות ההתנגדות של מפעלי הניסוי והבקרה. בחר צמחים ניסיוניים עם דירוג תגובת התנגדות של 1C, 1A או 2. צמחים אלה נחשבים עמידים בפני U. maydis^18,19.
4. חזור על הניסוי כולו כדי לאמת את הפנוטיפים הצמחיים.

Results

חיסון מוצלח להזרקת מחט יכול להיקבע על ידי הדמיה של הפנוטיפ של הצמחים מחוסנים עם U. maydis (ניסיוני). רוב הצמחים הניסיוניים היו רגישים לזיהום U. maydis. הצמחים הרגישים הראו התפתחות מחלה חמורה מאוד שהודגמה על ידי היווצרות גזע ותמר בסיסי עם teliospores שחור(איורים 3D ו 3E, טבלה 2). מספר צמחים מתו לאחר חיסון בשל חומרת המחלה. זוהו שלושה קווי התבוננות פנימה של תירס x teosinte שהיו עמידים בפני מידיס U. עבור צמחים עמידים U. maydis, חיסון מוצלח...

Discussion

במחקר זה שיטת החיסון הזרקת מחט המשמשת כדי לספק זן של U. maydis לתוך הגבעול של 700 תירס וצמחי teosinte היה מוצלח. בנוסף, סולם דירוג עמידות למחלות מתוקן שימש כדי לסנן את הצמחים ולזהות התפתחות פתוגן. כתוצאה משימוש בשתי השיטות, זוהו קווי צמחים עמידים בפני מיאדיס U. בקרב 700 צמחי תירס וטוסינט שכעת ניתן לשלבם ולבדוק אותם בתוכניות רבייה לשיפור עמידות למחלות.

כמו ברוב שיטות החיסון, היכולת לשחזר את אותו פנוטיפ התנגדות בקרב צמחים מאותו קו היא חיונית. בנוסף, יש לצפות באותם פנוטיפים של ה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
זרעים לצמחים			נאספו מצלבים מקוריים
תא גידול	Conviron	PGR14 REACH-IN
שתילת דירות	Hummert International	14-3385-2
אדמה (3 חלקים קליפת אורן; 1 חלק טחב כבול עם פרלייט)	האמרט אינטרנשיונל	10-1059-2
קולט אדים למינארי	מעבדת קונוקו	70875372
מלאי גליצרול של פתוגן (U. maydis) או פתוגן פטרייתי מעניין			מלאי גדל מתרבית מקורית
לולאה סטרילית	פישר סיינטיפיק	S17356A
צלחות אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA)	פישר סיינטיפיק	R454311
מוגדרת ל-30 מעלות; C	Fisher Scientific	11-690-650F
קיסמים סטריליים	Walmart		נרכש מוולמארט ומעוקר על ידי חיטוי
מרק דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker מוגדר ל -30 מעלות; C	ניו ברונסוויק	14-278-179
ספקטרופוטומטר	פישר סיינטיפיק	4001000
U. maydis  תרבית תרחיף תאים (1 x 106 תאים/מ"ל)			גדל ממלאי גליצרול כמתואר בשיטות
3 מ"ל מזרקים	בקטון דיקינסון
מ"מ x 1.3 ס"מ מחטים היפודרמיות	קנדל ברנדס	8881250321