Method Article

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

DOI:

10.3791/50713

⸱

November 2nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERV), אשר תופסים 8% של הגנום האנושי, לשמור על יכולות קידוד נדירות אבל מאה אלף חזרות ארוכות מסוף (LTRs). Microarray Affymetrix מותאם אישית תוכנן כדי לזהות ביטוי לוקוס HERV הבודד והיה בשימוש ברקמות סרטן ערמונית כהוכחה של מושג למחקרים קליניים בעתיד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטיגן ספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לאבחון העיקרי לסרטן הערמונית בשימוש קליני, אבל היא חסרה ייחוד ורגישות, בעיקר בערכי מינון נמוכים 1. 'כיצד להשתמש PSA' נשאר גיליון הנוכחי, או לאבחון כמו אזור אפור המתאים לריכוז בסרום של בין 2.5-10 ng / ml שאינו מאפשר הבחנה ברורה שיש להבחין בין הסרטן וnoncancer 2 או למעקב מטופל למעלה כניתוח של ה-PSA לאחר ניתוח פרמטרים הקינטית יכולים להוות אתגר לא מבוטל ליישום המעשי שלהם 3,4. לחלופין, RNAs noncoding (ncRNAs) הם מתעוררים כמו מולקולות מפתח בסרטן בבני אדם, עם הפוטנציאל לשמש כסמני רומן של מחלה, למשל PCA3 בסרטן ערמונית 5,6 וכדי לחשוף היבטי uncharacterized של ביולוגיה של גידול. יתר על כן, הנתונים מפרויקט ENCODE שפורסם בשנת 2012 הראו כי סוגים שונים RNA לכסות על 62% מgenשת. כמו כן, נראה כי הסכום של מוטיבים רגולטוריים תעתיק הוא גבוה יותר לפחות 4.5x מזו מקבילה לאקסונים המקודדים חלבונים. לפיכך, חזרות ארוכות מסוף (LTRs) של רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERVs) מהוות מגוון רחב של רצפים רגולטוריים תעתיק משוער / מועמד, כפי שהיא הפונקציה העיקרית שלהם ברטרווירוסים זיהומיות. HERVs, אשר פזורות בכל רחבי הגנום האנושי, מקורן בזיהומי אבות ועצמאיים בתוך הקו נבט, ואחרי תהליכי התפשטות העתקה והדבקה ומובילים לmulticopy משפחות הכובשים 8% של הגנום האנושי (שימו לב שאקסונים span 2% של הגנום שלנו ). לוקוסי HERV חלקם עדיין לבטא חלבונים שנקשרו עם מספר פתולוגיות כוללים הסרטן 7-10. יש לנו תוכנן microarray בצפיפות גבוהה, בפורמט Affymetrix, במטרה לאפיין בצורה אופטימלית ביטוי לוקוסי HERV בודד, על מנת להבין טוב יותר אם הם יכולים להיות פעילים, אם הם נוסעים שעתוק ncRNA או מ 'odulate קידוד ביטוי גנים. כלי זה כבר מיושם בתחום סרטן הערמונית (איור 1).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (המכונים גם HERVs) פזורים בכל רחבי הגנום שלנו. הם נובעים מזיהומים אבות ועצמאיים בתוך הקו נבט, ואחרי תהליכי התפשטות העתקה והדבקה ומובילים למשפחות multicopy. היום, הם לא מדבקים יותר, אך הם תופסים 8% של הגנום האנושי; כנקודת השוואה, אקסונים span 2% של הגנום האנושי. נתונים מפרויקט ENCODE פורסם ב2012 הראו כי סוגים שונים RNA לכסות על 62% של הגנום, ובכלל זה שליש באזורי intergenic. יתר על כן, נראה כי הסכום של מוטיבים רגולטוריים תעתיק הוא גבוה יותר לפחות 4.5x מזו מקבילה לאקסונים המקודדים חלבונים. חוזר HERVs ארוך מסוף (LTR) מייצג מגוון רחב של אלמנטים רגולטוריים תעתיק פוטנציאליים, כפי שהוא הפונקציה הרגילה שלהם ברטרווירוסים זיהומיות. מבחינה היסטורית, חוץ מכמה לוקוסים הביעו בשליה או האשך, זה היה שסבר שHERV שותק בשל epהרגולציה igenetic. לכן, יש לנו תוכננו microarray בצפיפות גבוהה, בפורמט Affymetrix, במטרה לאפיין בצורה אופטימלית ביטוי לוקוסי HERV בודד, על מנת להבין טוב יותר אם הם פעילים, אם הם נוסעים שעתוק lncRNA או לווסת את קידוד ביטוי גנים. כלי זה מכונה HERV-V2 GeneChip משלב 23,583 probesets HERV ויכול להפלות 5,573 אלמנטים ברורים HERV המורכב מLTRs סולו, כמו גם proviruses מלא וחלקי (איור 2).

אבחון, הערכה, ותכנית:

אבחנה של סרטן הערמונית מבוססת על מינון של אנטיגן ספציפי לערמונית סמן (PSA) במעבדה קלינית, בדיקה רקטלית דיגיטלית להעריך שינוי מורפולוגי של הערמונית ובסופו ביופסיות ערמונית שנצפו על ידי פתולוג. היעדר ספציפי מספיקים ורגישות בין סמנים לסרטן קונבנציונליים, כגון PSA לסרטן הערמונית, הוכר af נרחבter כמה עשורים של השלכות קליניות 1. בתחילה, ה-PSA הוצעה לאבחון וטיפול באדנוקרצינומה של הערמונית 11. זה היה אחרון שהוצע לבדיקות סקר לסרטן ולמעקב אחר התפתחות המחלה 12. עם זאת, נותרת שאלה שנשאלת באופן קבוע: "איך להשתמש PSA '. (I) אזור אפור המתאים לריכוז בסרום של בין 2.5-10 ng / ml אינו מאפשר הבדל ברור שיש להבחין בין הסרטן וnoncancer 2 (ii) שני מחקרי עוקבה גדולים להירשם מאות אלפי אנשים באירופה וב ארה"ב לא הצליחה להגיע למסקנה ברורה לגבי התועלת של הקרנה במונחים של תמותה ספציפית למחל 13,14; ניתוח (iii) של פרמטרים ה-PSA לאחר ניתוח הקינטית כגון אישור ה-PSA, מהירות PSA וזמן הכפלה, אם כי פשוטה בתאוריה, יכול להוות אתגר משמעותי ב3,4 יישום המעשי. אנו עשויים לצפות כי בשנים הקרובות, אפליקציה סמן ביולוגיlications יתמוך בחירה קלינית בין מחכה פקוחה ויותר או טיפולים פחות אגרסיביים בהתאם לפנוטיפ גידול. בנוגע לאבחנה שניתנו על ידי פתולוג, גורם מגביל ראשון מגיע מ20% אבחון שלילי שגוי בביופסיות ערמונית (סרטן רבים הם החמיצו על ידי דגימה). חשש שני עוסק בצורך בהליך ביופסיה נוסף הבאים שלילי, אשר עשוי להציג תופעות לוואי.

כריתה רדיקאלית של ערמונית היא כיום אחד הטיפולים סטנדרטיים בסרטן הערמונית. מוצע בחולים בריאים, הזדקנות 45-65 שנים, במיוחד במקרה של דפוסים אגרסיביים (7 גליסון ל10), גידול multifocal או גידול מוחשי. עכשיו זה נעשה במחלקה שלנו באמצעות ניתוח סייע רובוטית. בגלל הראיות הולכות ומצטברים כי סמנים מולקולריים יהיו חשיבות עליונה בשנים הקרובות, מצאנו לנכון להציע לכל המטופלים שלנו את האפשרות של השתתפות בתכנית לערמוניתבנקאות רקמות. לייתר דיוק, תוכניות מחקר מולקולרי הרחבת על סרטן הערמונית גרמו לדרישה הולכת וגוברת לגישה לרקמות גידול טריות באיכות גבוהה מדגימות כריתת ערמונית. מחקר זה, בפרט גישות גנומי, נדרשות דגימות גדולות באיכות הגבוהה DNA / RNA. Tumoral ורקמות סמוכות 'tumoral שאינו' מאותו החולה יש צורך. המלצות לטיפול ועיבוד prostatectomies הרדיקלי נועדו לשמר את התכונות פתולוגיים הקובעות במה ומעמדה שולי וטיפול נוסף ובכך הפוטנציאל והפרוגנוזה. כל שיטת דגימת רקמה טרי, ולכן, לא צריכה להתפשר הערכות פתולוגי שלאחר מכן כדי להיות מקובל על האבחנה. נתיחה מקרוסקופית של הערמונית היא קשה ותשומת לב רבה צריכה להיות משולמת לרקמות שולי ופלישה קופסית: נתיחה בשום צורה לבנקאות ערמונית צריכה להתנהל תמיד מאומן uropathologist לפי מסכיםפרוטוקול ד. ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה והעדה הרפואית הסכימה המדינה לחקירות אלה והסכמה מהדעת שהתקבלה עבור כל החולים שנכללו בבנקאות רקמות ערמונית.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כירורגיה

הוסר לאחר על ידי המנתח, לשמור הערמונית על קרח עד נלקח ממונה על ידי פתולוג.

2. טיפול ברקמות ערמונית

  1. לכבד את העיכוב של איסכמיה סביב הניתוח, להעביר דגימות כריתה רדיקאלית של ערמונית על קרח למעבדה על ידי צוות ייעודי בתוך 30 דקות לאחר אבלציה כירורגית. העיכוב של הקפאה צריך להיות פחות מ 20-30 דקות (איור 3 א).
  2. לשקול ולהכתים את הערמונית על פי הפרוטוקול הרגיל (לדוגמא ירוקה בצד ימין, שחור בצד השמאל, רואים 3B דמויות ו3 ג).
  3. בצע סעיף רוחבי גדול של הבלוטה בצד האחורי (איור 3D). לכוון את הערמונית ולשים אותו בצד הקדמי. בצע סעיף רוחבי גדול של הבלוטה בצד האחורי עם סכין כירורגית סטרילי.
  4. לנתח חתיכות של רקמות באזור המעבר,באזורי פריפרית ימין ועל השמאל, ומשאירים את השוליים ללא פגע (איור 3E).
  5. שים את הליבות של רקמה בצינור Eppendorf, הצמד הקפאה וחנות בחנקן נוזלי (איור 3F). אם אתה לא עושה biobank להמשיך ישירות עם צעד 2.7.
  6. בצע בנקאות ערמונית רק אם האורך הכולל של סרטן בביופסיות עדיף על 10 מ"מ. השתמש בחוט תפירה כדי לסגור את הערמונית וכדי למנוע עיוות בלוטה והפרעה מזערית של השוליים הניתוחיים (איור 3G). לאחר מכן לתקן את דגימת הכריתה הרדיקלית של ערמונית עם פורמלין ולהטביע בפרפין על פי הנוהל המקובל לניתוח היסטולוגית.
  7. הר ליבות רקמה קפוא אנכית על תלולית קטנה של אוקטובר ולעשות את החלקים בcryostat. קח קטע הסינגל ראשון 5 מיקרומטר קפוא ולהכתימה בtoluidine הכחול.
  8. בצע בדיקה היסטולוגית מהירה לנתח את האופי של הרקמה (כלומר. שפיר או ממאיר). לtumoralרקמות, להעריך את כמות תאי tumoral ובחר ליבות רק עם יותר מ 80% מתאי tumoral.
  9. בעקבות זאת, לבצע סעיף אחד חדש 5 מיקרומטר קפוא ולהכתימה בhematoxylin, eosin וספרן. לאחר מכן, לחתוך 15 חלקים x 30 מיקרומטר ולמקם אותו בצינור Eppendorf בחינם RNase.
  10. קח את הסעיף קפוא 5 מיקרומטר אחרון לhematoxylin, eosin וספרן ולהכתים אותו כדי לשלוט על כמות תאי tumoral בסוף ההליך.
  11. שים את צינור Eppendorf בקרח יבש ולשלוח את הדגימה למעבדה לביולוגיה המולקולרית.

3. RNA מיצוי, טיהור, ובקרת איכות

  1. המגון. לבצע המגון בנוכחות של 1 מיליליטר של רקמת מ"ג Trizol/100 עד הרקמה הוא נמס לגמרי בפתרון. הוספת פתרון Trizol בהדרגה ולהמשיך בטיפול על קרח באמצעות מטחנה ידנית. ברגע שהומוגני, aliquot הפתרון לצינורות Eppendorf ולהשאיר בTrizol בטמפ 'החדר במשךחמש דקות.
  2. הפרדת פאזות. הוספת כלורופורם 300 μl (או BCP/1.5 150 μl מיליליטר Trizol). שניות 15 ורטקס אז להשאיר בטמפ 'חדר למשך 2-3 דקות. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 2-8 ° C.
  3. ממטרים RNA. העבר בזהירות את השלב מימיים העליון לצינור חדש. הוסף 750 isopropanol μl. לדגור על RT עבור 10 דקות (להתסיס ידי היפוך). דגירה שעה 2 ב -19 ° C/-31 ° C. צנטריפוגה דגימות 12,000 XG במשך 30 דקות ב 2-8 ° C.
  4. לשטוף RNA והשעיה. בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant. לשטוף RNA גלולה עם 1 מיליליטר EtOH 80% (בעדינות להפוך את הצינורות). צנטריפוגה דגימות 7,500 XG 10 דקות ב 2-8 ° C. הסר supernatant באמצעות P1000 וP10. לאפשר שנותר EtOH לייבוש באוויר במשך דקות 2-3. הוספת 100 מים RNase ללא μl, צינורות העברה ל70 גוש חום ° C ולתת לשבת במשך 2-3 דקות לפזר את גלולה. ואז לשים על קרח. חנות ב -19 אחסון ° C/-31 ° C לטווח קצר ו--C ° 80 לאחסון ארוך טווח.
  5. טיהור RNA. לטהר RNA באמצעות ערכת RNeasy מיני (Qiagen). בקצרה, להתחיל על ידי הוספת RLT חיץ 350 μl למדגם RNA 100 μl ומערבבים היטב, לאחר מכן בצע את הליך Qiagen. לבסוף, לקחת μl 3 (מתוך 50 μl) aliquot של המוצר מטוהר לבקרת איכות (שלב 3.6). RNA החנות ב -19 C ° לC/-31 ° תקופה קצר טווח או ב-80 ° C לאחסון ארוך טווח.
  6. RNA QC (איור 4 א). בדוק את האיכות של RNA ושלמות RNA באמצעות Bioanalyzer (Agilent) וNanodrop (Thermo), על פי הוראות היצרן. RNA היושרה מספר (רין) משמש כדי להעריך את איכות RNA. בפרט, להצליח בזיהוי של פסגות 18S 28S ומומלץ מאוד להשתמש בדגימות בצעדים נוספים.

4. WT-RNA תשואות הגברה

המלצות לביצוע צעדי ההגברה באמצעות WT-האובערכת ההגברה ation בתנאים אופטימליים:

  • לרוץ לא פחות משמונה דגימות הגברה בכל פעם כדי להבטיח דיוק pipetting. ואז, בחשבון 1 נפח פסולת בעת הכנת תערובות הורים הדורשות פיצול של הערכה ל -3 קבוצות של 8 תגובות.
  • תמיד לשמור ריאגנטים מופשרים וצינורות תגובה על קרח, אלא אם כן הורה אחר.
  • השתמש רק 80% אתנול פתרון טרי לטיהור.
  • אל תפסיק בכל שלב של הפרוטוקול.

  1. לדלל רנ"א הכל כדי לקבל ריכוז של 25 ng / μl. לעבד 2 μl של המדגם בדילול מלא.
  2. הכן את פולי ופתרון RNA ספייק-בשליטה על ידי דילול סדרתי של פולי-מלאי RNA עם פולי-בקרת דילול חוצץ (Affymetrix), על מנת להשיג דילול 1:25000.

    שלב 1: ראשית סטרנד סינתזה cDNA 4.3-4.8. ריאגנטים ציינו מופנים על ידי הספק באופן הבא: A1 (הראשון סטרנד פריימר Mix), A2 (FiRST סטרנד הצפת Mix), A3 (הראשון סטרנד האנזים Mix).

  3. להפשיר A1 ו-A2 בטמפרטורת חדר. מערבבים על ידי בעזרת מערבולת-מיקסר במשך 2 שניות וספין עבור 2 שניות. ואז, במקום מהירות על קרח. הנח A3 על קרח.
  4. לשים 2 μl של רנ"א הכל (50 ng) בצינור PCR 0.2 מיליליטר ולהוסיף 2 μl של A1 (נפח סופי: 4 μl). שווי ולסובב את הצינור ל2 שניות.
  5. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לאחר מכן למקם את הצינור על קרח.
  6. הכן הראשון סטרנד cDNA מיקס מאסטר כדלקמן (נתון לתגובה אחת). מערבבים על ידי pipetting ספין למטה בקצרה מיקס מאסטר. באופן מיידי, מניח על קרח.
    מגיב נפח
    הראשון סטרנד הצפת המיקס (A2) 5 μl
    Poly-RNA בקרה (1:25000) 0.5 μl
    הראשון סטרנד אנזים המיקס (A3) 0.5 μl
  7. הוסף 6 & #181; ליטר של מיקס מאסטר RNA / הצינור המכיל פריימר. מערבבים על ידי מצליף את הצינור, הספין במשך 2 שניות ומקום במהירות על קרח (נפח סופי: 10 μl).
  8. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שמור על קור רוח בשעה 4 ° C. הסר את צינור התגובה מCycler התרמי, ספין בקצרה ולשמור על קרח. המשך מייד עם הצעד שני סטרנד הסינתזה cDNA.

    שלב 2: שנית סטרנד סינתזה cDNA 4.8-4.12. ריאגנטים ציינו מופנים על ידי הספק באופן הבא: B1 (השני סטרנד הצפת Mix) ו-B2 (השני סטרנד האנזים Mix).

  9. ספין למטה B2 ו-B3 ל -2 שניות ומהירות מניח על קרח. להפשיר B1 בטמפרטורת חדר. מערבבים על ידי בעזרת מערבולת-מיקסר במשך 2 שניות, ספין במשך 2 שניות ומהירות מניח על קרח.
  10. הכן שני סטרנד מיקס מאסטר כדלקמן (נתון לתגובה אחת). מערבבים על ידי pipetting ספין למטה בר מיקס מאסטרלעוף. באופן מיידי, מניח על קרח.
    מגיב נפח
    שנית סטרנד הצפת המיקס (B1) 9.75 μl
    שנית סטרנד אנזים המיקס (B2) 0.25 μl
  11. הוסף 10 μl של מיקס מאסטר צינור אחד תגובה הראשונה של סטרנד. מערבבים על ידי pipetting 3x, ספין במשך 2 שניות ומניחים על קרח (נפח סופי: 20 μl).
  12. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 50 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שמור על קור רוח בשעה 4 ° C. הסר את צינור התגובה מCycler התרמי, ספין בקצרה ולשמור על קרח. המשך מייד עם הצעד פוסט שני סטרנד שיפור.

    שלב 3: לאחר שנית סטרנד שיפור 4.13-4.15. ריאגנטים ציינו מופנים על ידי הספק באופן הבא: B1 (השני סטרנד הצפת Mix), B3 (Reaction שיפור האנזים Mix).

  13. הכן מיקס מאסטר על ידי שילוב של B1 ו B3 מיקס כדלקמן (נתון לתגובה אחת). מערבבים על ידי pipetting ספין למטה בקצרה מיקס מאסטר. באופן מיידי, מניח על קרח.
    מגיב נפח
    שנית סטרנד הצפת המיקס (B1) 1.9 μl
    תגובת שיפור אנזים מיקס (B3) 0.1 μl
  14. הוסף 2 μl של מיקס מאסטר לכל צינור תגובה השני סטרנד. מערבבים על ידי pipetting 3x, ספין במשך 2 שניות ומניחים על קרח (נפח סופי: 22 μl).
  15. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שמור על קור רוח בשעה 4 ° C. הסר את צינור התגובה מCycler התרמי, ספין בקצרה ומניח על קרח. המשך מייד עם צעד ספיה ההגברה.

    שלב 4: cDNA גדיל בודד סינתזה (sscDNA) על ידי הליך ספיה מ4.16 -4.19. ריאגנטים ציינו מופנים על ידי הספק באופן הבא: C1 (ספיה פריימר Mix), C2 (ספיה הצפת Mix), C3 (ספיה אנזים Mix).

  16. להפשיר את C1 ו-C2 בטמפרטורת חדר. מערבבים על ידי בעזרת מערבולת-מיקסר, ספין במשך 2 שניות והמקום במהירות על קרח. להפשיר C3 על קרח. מערבבים את התוכן בעדינות על ידי היפוך 5x. הקפד לא להכניס בועות אוויר. לאחר מכן, ספין במשך 2 שניות ומניחים על קרח.
  17. להכין תערובת ספיה-Master, והיוו 0.5 נפח פסולת, כמפורט להלן. מערבבים על ידי pipetting ספין למטה בקצרה מיקס מאסטר. באופן מיידי, מניח על קרח.
    מגיב נפח
    ספיה-Buffer מיקס (C2) 5 μl
    ספיה, פריימר מיקס (C1) 5 μl
    ספיה אנזימי מיקס (C3) 10 μl
  18. הוסף 20 μl של ספיה מיקס מאסטר לt התגובה השני סטרנד משופראופה. מערבבים על ידי pipetting 6-8x, ספין ואת המקום במהירות על קרח (נפח סופי: 42 μl).
  19. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן 47 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שמור על קור רוח בשעה 4 ° C. הסר את הצינור מCycler התרמי, ספין בקצרה ומניח על קרח.

5. sscDNA טיהור ובקרת איכות

  1. sscDNA טיהור. לטהר sscDNA באמצעות ערכת QIAquik PCR הטיהור (Qiagen). בקצרה, להתחיל על ידי הוספת PB חיץ 200 μl ל42 μl של מוצר cDNA הגברה, לערבב ועומס על העמודה. לאחר מכן בצע את הליך Qiagen. לבסוף, לקחת μl 3 (מתוך 30 μl) aliquot של המוצר מטוהר sscDNA לבקרת איכות (שלב 5.2).
  2. sscDNA להניב ואימות התפלגות גודל (איור 4). בדוק תשואת sscDNA והתפלגות גודל באמצעות Bioanalyzer וNanodrop, על פי הוראות היצרן. הגודל של הפצה של cDNA הגברה צריך bדואר מורכב בדרך כלל בין 100 ו -1,500 בסיסים ארוכים עם שיא סביב 600 בסיסים.

6. sscDNA פיצול

  1. להכין 2 מיקרוגרם של cDNA ב30 μl, התאמת עוצמת הקול במי nuclease חינם.
  2. הכן 1x One-Phor-כל המאגר PLUS (OPA), החל מחיץ 10x OPA PLUS פתרון.
  3. הכן 0.2 U / μl DNase אני (דילול פי 5 של 1 U / μl DNase אני).
  4. הכן את פיצול מיקס מאסטר כדלקמן (נתון לתגובה יחידה):
    מגיב נפח
    10X One-Phor-כל המאגר PLUS 3.6 μl
    אני DNase (0.2 U / μl) 3 μl
  5. הוספת 6.6 μl של פיצול מיקס ל30 μl של sscDNA.
  6. ספין ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן להשבית אני DNase ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולשמור על קרח. Aliquot 1 &# 181; ליטר של cDNA המקוטע לאימות הפצת Agilent מבוסס גודל.
  7. sscDNA אימות התפלגות גודל (איור 4C). בדוק התפלגות גודל sscDNA באמצעות Bioanalyzer (Agilent). התפלגות הגודל של cDNA המקוטע צריכה להיות מורכבת בדרך כלל בין 35 ו200 בסיסים.

7. תיוג של מפוצל sscDNA

  1. לדלל את DLR-1a 7.5 מ"מ עד 5 מ"מ בDEPC מים.
  2. הכן מיקס מאסטר תיוג כדלקמן (נתון לתגובה יחידה):
    מגיב נפח
    מאגר תגובת 5x TdT 14 μl
    CoCl 2 (25 מ"מ) 14 μl
    DLR-1a (5 מ"מ) 1 μl
    transferase מסוף (400 U / μl) 4.4 μl
  3. הוספת 33.4 μl של תמהיל התיוגלכל דגימת cDNA מקוטעת.
  4. מערבבים על ידי מצליף את הצינור, ספין בקצרה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ולאחר מכן לשמור על קרח.

8. הכלאה לMicroarray צ'יפ HERV

  1. Prewet GeneChip HERV עם 200 μl של prehybridization מיקס (Affymetrix) ו לדגור על 50 מעלות צלזיוס, 60 סל"ד, ל10 דקות.
  2. מכין את תערובת ההכלאה כדלקמן (נתון לתגובה יחידה):
    מגיב נפח
    הבקרה אוליגו B2 (3nM) 3.3 μl
    20x אוקריוטים הכלאה בקרה 10 μl
    2x הכלאה Mix 100 μl
    DMSO 99.9% 17.7 μl
  3. הוסף את 131 μl של הכלאה מיקס ל69 μl של cDNA המקוטע ושכותרתו בטמפרטורת חדר כדי להפוך את vo סופיlume של 200 μl.
  4. מערבבים ולפגל למשך 2 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לדגור על 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 5 דקות.
  5. רוקן את GeneChip HERV prewetted ולטעון את הכנת יעד 200 μl. החל קשוחים כתמים על שני septa.
  6. להכליא על 50 מעלות צלזיוס, 60 סל"ד, ל18 שעה.
  7. לאחר 18 שעות, רוקן את GeneChip HERV ולאחסן את פתרון ההכלאה נאסף ב 4 ° C. מלא את מערך הבדיקה עם 250 א הצפת לשטוף μl אם השבבים לא לרוץ מייד על fluidics, לאחסן ב 4 ° C.

9. כביסה ומכתים

  1. הפעל את Fluidics משורת תפריטי GCOS. בתיבה הדו Fluidics, בחר את התחנה של עניין (1 - 4), לאחר מכן בחר Shutdown_450 לכל המודולים, ואז לרוץ. לטבול את 3 קווי שאיפת Fluidics לתוך מים מילי-Q. עקוב אחר הוראות מסך LCD.
  2. להחיל את תכנית Prime_450 לכל המודולים. הנח את צינורות להצפה לשטוף בבקבוק המכיל 400 מיליליטר הצפת לשטוף, ואחד להצפה לשטוף B בבקבוק המכיל 200 מיליליטר הצפת לשטוף ב 'ואז שוב, בצע את ההוראות במסך ה-LCD.
  3. הרם את המחטים ולמקם את קוקטייל כתם 600 μl 1 (SAPE הפתרון Mix) ו600 μl קוקטייל כתם 2 (נוגדן הפתרון Mix) המכיל צינורות microcentrifuge בעמדות מס '1 ומס' 2, ו800 מערך μl מחזיק פתרון חיץ בעמדת המס '3 .
  4. הקצה את שבב זכות לכל מודול, בחר את פרוטוקול FS450-004 ולהפעיל כל מודול, לפי הוראות שעל מסך.

10. סריקה

  1. לחמם את סורק GS3000. זה מוכן לסריקה כאשר האור מתחלף לירוק.
  2. החל קשוחים כתמים על septa כדי למנוע דליפה ולאחר מכן לטעון את השבב לתוך autoloader או לחלופין ישירות לתוך הסורק. להתחיל בסריקה.
  3. לאחר סריקת השבב,. קבצי cel נוצרים. בדוק את התמונה וליישר את הרשת למקום כדי לזהות את תאי הבדיקה (<דמויות חזקות> 4D-F).

11. ניתוח נתונים

  1. בקרת איכות. עיין בAffymetrix הסטנדרטי שולט כדי לוודא ששבבי HERV-V2 עומדים בקריטריוני QC. לשם כך ניתן להשתמש בייצוגים הבאים: חלוקת ערך עוצמת יומן (חלקות צפיפות ועלילות תיבה), סטיית החציון המוחלטת (MAD) לעומת חציון עוצמת חלקות (MAD-Med), מגרשי רקע, השגיאה סטנדרטית unscaled המנורמלת חלקות (Nuse) וביטוי היומן היחסי חלקות (RLE).
  2. נורמליזציה. בנוסף, בסיס הנתונים צריכים להיחקר כדי להדגיש את ההשפעות אצווה בלתי צפויות ולתקן אותם לפני ניתוח סטטיסטי. העיבוד מקדים נתונים ובכך כולל תיקון רקע (למשל. מבוסס על אות בסיס הבדיקה טריפטופן), ואחריו הנורמליזציה RMA וסיכום 15.
  3. כריית נתונים וחיפוש אחר גנים ההפרש לידי ביטוי. לנרמל את השבבים ולהחיל clusteri היררכיגישת ng לחקור את בסיס הנתונים (איור 6 א). לאחר מכן, לבצע חיפוש עבור גנים הביעו באופן דיפרנציאלי (DEG) באמצעות ניתוח קלאסי משמעותי של microarray (SAM) הליך 16 אחרי שיעור גילוי שווא תיקון (רוזוולט) 17. שים לב כי צעדים אלה משולבים באופן מלא בחלק מסוויטות ניתוח תוכנות כמו Partek GS אך לחלופין ניתן לבצע באמצעות התוכנה סטטיסטית R 18 עם חבילות מפרויקט BioConductor 19. לאחר הניתוח הסטטיסטי, לסנן את בסיס הנתונים כדי להוציא את probesets שלערכי ביטוי הם פחות מ 2 6.
  4. ויזואליזציה ופרשנות. לפרש את התוצאות מmicroarray HERV-V2 בממשק ייעודי באמצעות מסדי נתונים ביאור.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערך של לימודי transcriptomic נעוץ בעיקר באיכות של החומר ביולוגי שמתחיל. אם מיצוי RNA מתבצע בתנאים אופטימליים, RNA היושרה מספר (רין) הוא בדרך כלל (איור 4 א) 7 ומעלה. הצורך להכליא 2 מיקרוגרם של cDNA על שבב Affymetrix HERV-V2 מרמז על השימוש בתהליך הגברה. צעד הגברה מוצלח מוביל להפצה דמוית פעמון (איור 4). לאחר מכן, פיצול DNAse1 מבוצע כדי homogenize התפלגות גודל cDNA סביב 100 נוקלאוטידים לפני ההכלאה (איור 4C). לאחר הכלאה וסריקה (איור 4D), בדיקה ויזואלית של התמונה מאפשרת אחד כדי לבדוק אם הרשת מיושרת היטב לכתמים (איור 4E) ואם בקרות הכלאה עולות בקנה אחד (איור 4F). צעד זה שימושי גם כדי להוציא microarrays בי בועות אוויר או טעויות התרחש במהלך הניסוי.

ברגע שהשבבים עברו QC (איור 5) ולאחר נורמליזציה, הניתוח הסטטיסטי של 5 גידול ההתאמה זוג ודגימות RNA ערמונית נורמליות מבית החולים בליון-Sud הוביל לזיהוי של 207 probesets HERV עם ערכי ביטוי ההפרש (p.val <0.05) (איור 6 א). כדי לתמוך בעדויות אלו וכדי לקבל מידע ספציפי לערמונית, 35 דגימות נוספות התאמה זוג (מעי גס, השחלה, אשכים, שד, ריאות וערמונית) נוספו לניתוח והליך SAM-FDR (FDR = 20%) זיהה סופו של דבר 44 probesets HERV ספציפי לערמונית. ביניהם, את מבני HERV הרלוונטיים ביותר 10 מתוארים (איור 6). מחקרים קליניים נוספים יידרשו על מנת להעריך את הערכים של רגישות וספציפיות של סמנים ביולוגיים מועמד אלה.

pload/50713/50713fig1.jpg "width =" "/> 500px
. איור 1 ערכה של הליך הכולל מהמרפאה (1: כריתת ערמונית על ידי המטפל והכנת הרקמה על ידי פתולוג) לספסל (2-6: הכנת מדגם, הכנת היעד, עיבוד microarray) מובילה לזיהוי סמנים ביולוגיים מועמד (7: ניתוח biocomputing של microarrays HERV). חומצות גרעין הנגזרות מהרקמה נורמלית מתוארות בכתום; חומצות גרעין הנגזרות מאזור tumoral מורכבת מתערובת של רגיל (כתום) וספציפי של גידול (שחורה) חומצות גרעין. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-1
. איור 2 התעברות ותוכן של שבב HERV-V2: רצפי HERVמאוחזר מהגנום האנושי מאוחסנים במסד נתונים בשם HERV-gDB3, ולאחר מכן בדיקות מועמד 25-mer לעבור הליך דוגמנות הכלאה ייעודי (EDA +) לפני שמסונתזים סופו של דבר במערך (תת האזורים הממוקדים וכתוצאה מכך מתוארים עבור כל משפחה). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-2
איור 3. טיפול ערמונית על ידי פתולוג. () דגימת כריתה רדיקאלית של ערמונית טריות מועבר למעבדה. (BC) הערמונית מוכתמת (ירוק בצד ימין, שחור בצד השמאל). (ד) סעיף רוחבי גדול של הבלוטה בצד האחורי. (ה) השארת השוליים שלם, pieces של רקמות הם גזורים מאזורים השונים של בלוטת הערמונית. (F) ליבות של רקמה ממוקמות בצינור Eppendorf. (ז) חוט תפר משמש כדי לסגור את הערמונית וכדי למנוע עיוות בלוטה והפרעה מזערית של השוליים הניתוחיים. ואז, את דגימת הכריתה רדיקאלית של הערמונית היא מוכנה לתיקון בפורמלין על פי הנוהל המקובל לניתוח היסטולוגית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-3
פקדי איור 4. איכות של הכנת חומצות גרעין ויעילות הכלאה. () CDNA שלמות RNA, (ב ') מוגבר מטרות ויעדים (C) מקוטעים המשמשים בשלב ההכלאה. הESE שלוש בקרות איכות התקבלו עם Bioanalyzer באמצעות שבבי ננו RNA וassay eukaryote ננו Serie השני. (ד) תמונה כוללת של אזור HERV-V2 הכלאה microarray לאחר סריקה, (E) הגדלה של בקרות הפינה השמאלית העליונות מציג רשת היישור וגדלה (F) באזור המרכז מראה איתור פקדי הכלאה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-4
איור 5. עיבוד האותות. () Affymetrix הפולה ספייק-בבקרת הגברה. הפולה שולט תמלילי DAP, Thr, Phe ויס מB. גנים subtilis הם זינקו במדגם RNA וישמשו על מנת להעריך את ההצלחה הכוללת משלבי הכנת היעד. עוצמה צריכה להיות מזוהה בהפחתת ערכים בין פקדי ספייק-באלה כדי להבטיח שלא הייתה הטיה בהגברת WT-Ovation בין הפערים והגנים הביעו נמוכים. (ב) Affymetrix ספייק-בבקרת הכלאה. יעדים אלה בודדו מE. coli וbacteriophage P1 הם זינקו לפני הליך התיוג. ערכים גובר מצד BioB, BioC, BioD וCre מצביעים על ההצלחה הכוללת של ההכלאה. (ג) חלוקת עוצמת אותות השבב לאחר הנורמליזציה RMA. רוב אותות תערוכת probesets עם ערכים נמוכים מ -2 6 (רקע), המציין ביטוי כולל בעיקר מוגבל לכמה לוקוסי HERV ספציפיים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

"Width =" ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "/> 500px
איור 6. ניתוח נתונים. (א) ניתוח אשכולות היררכי של דגימות נורמליות וtumoral. אשכולות מחיצות היו מוחלים על ערכי ביטוי המנורמל באמצעות אלגוריתם פונקצית מרחק אוקלידי, קיבוץ probesets לעד (אדום) - ולמטה (כחולה) תקנה בין דגימות נורמליות וtumoral. בחירה (ב) למבני HERV העליונים 10 זוהו כסמן ביולוגי מועמד של סרטן הערמונית. עבור כל רכיב HERV, משפחת HERV קשורה, הקואורדינטות גנומית (צמח השדה 36/hg18) ותיאור קצר של מבנה HERV מקבלים. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-5
איור 7. רפרטואר HERV. () רצף של הגנום האנושי חשף 25,000 גנים המקודדים חלבונים (אקסונים, 2%) וכמות עצומה של אלמנטי transposable כולל 200,000 חוזר ארוך מסוף (LTR) retrotransposons (HERV, 8%). אקסטרפולציה (ב ') מתוכן שבב HERV-V2 ונתונים הביטוי משויך (79 דגימות שמקורן 8 רגילים לעומת סוגי tumoral רקמות) מצביעים על כך ששליש מרפרטואר HERV הוא תעתיק פעיל. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-6
איור 8. פרשנות פונקציונלית של אותות מהשבב. (א) זיהוי יזם ושליטה אפיגנטיים: איתות שלילית U3 (חללית אדומה, 5'LTR) לעומת איתות חיובית R-U5 (חללית כחולה, 5'LTR) מציע שעתוק מונע U3, נתמך על ידי מתילציה השונות CPG (עיגולים שחורים מוצקים) התוכן של U3 בperitumoral הנורמלי לעומת רקמות tumoral. אסטרטגית שחבור (ב '): מעטפת 3.1 kb המשוער קידוד ה-mRNA ביטוי אך ורק בגידול מזוהה באמצעות צומת אחוי SD1/SA2 חופף בדיקה. * להסיק מההשוואה עם רקמות שאינן שליה אחרות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך 10 השנים האחרונות, רוב הניסיונות למדידת ביטוי HERV השתמשו בטכניקות RT-PCR או להתמקד במוקד ספציפי 20-24 או המבוסס על השימור היחסי של גנים pol להעריך מגמות כלליות במסגרת סוגי HERV 25,26 . בנוסף, amplifications PCR באמצעות פריימרים מנוונים ביותר בשילוב עם microarrays צפיפות הנמוך שנועד לזהות ולכמת את הביטוי של משפחות HERV 27,28. על מנת לעקוב אחר הביטוי של לוקוס בודד בתוך משפחה, גישות מבוססות על ההגברה PCR של אזורים שמורים בשילוב עם שיבוט ורצף לאחר מכן אפשר לאלמנטים ברורים תעתיק פעילים של HML-2 29,30 או HERV-E4.1 31 במשפחות להיות מזוהה. כמו כן הסתיים בצעדי שיבוט ורצף, טכניקת ניטור ביטוי החוזרת הגנום במטרה לזהות יזמים בקרב חוזר זיהה HML-2 LTRs הבודד האנושי הספציפי הפעיל 32,33. אנחנו פיתחנו ברציפות שני דורות של microarrays צפיפות גבוהה מוקדשים לניתוח של transcriptome HERV, החדרת מתודולוגיות מתאימות לעיצוב בדיקה אלמנט חוזר ונשנה במטרה למזער תגובות צולבות בין אלמנטי paralogous בתוך משפחה 34,35. שבב HERV-V2 אשר מטרות 2,690 proviruses מובחן ו2,883 LTRs הסולו של HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 וHML-5 משפחות HERV-K, חשף ביטוי של 1,718 לוקוסי HERV (7 א דמויות ו-B) במגוון רחב של רקמות 35, שמודגמות במאמר זה על ידי זיהוי סמנים לסרטן ערמונית משוערים. בנוסף, השימוש בprobesets מרובה במוקד נתון הוא אינפורמטיבי על תקנת תעתיק שלה. ראשית, איתות שלילית U3 בשיתוף עם חיובי אחד U5 מסווגת LTR כמקדם, ואותות שליליים להפך U3 חיוביים וU5 עשויים לשקף תפקיד polyadenylation. אנחנו ולכן אניdentified 326 LTRs אמרגן במגוון רחב של רקמות 35 ו, המבוססות על מידע זה U3-U5 דיכוטומית המסופק על ידי המערך, שהצענו בניסוי ואשרנו לכמה מקרים נבחרים שהשעתוק אוטונומי כגון נשלט על ידי תהליך מתילציה תלוי אפיגנטיים 34 (איור 8). שנית, הגילוי של אותות מלמשל LTR, איסור הפרסום וprobesets העצמאי env או שהונפק מבדיקות מיקוד צומת אחוי ספציפית הוא אינפורמטיבי על אסטרטגית שחבור proviral, כפי שמודגם בפרופיל ביטוי ERVWE1/Syncytin1 בשליה או באשך tumoral 34. זה מצביע על כך שהתהליך של בחירת בדיקה ספציפית HERV הוא חזק מספיק כדי לתמוך בזיהוי אסטרטגית השחבור הקשורים רקמות, בצורה יעילה ככל לגנים קונבנציונליים 36 (איור 8).

שיטה זו היא הניסיון הראשון לזהות ביטוי מוקד בנפרד HERVבאמצעות microarray צפיפות גבוה מותאם אישית המבוסס על טכנולוגיה של Affymetrix. היתרונות זוהו בבירור של פורמט microarray לפענח transcriptome HERV בהיקף של (i) החיפושים מתואמים של כמה משפחות HERV וכן (ii) הניתוח סימולטני ועצמאי של האזורים השונים עבור כל מוקד, למשל. תחומים U3 וU5 לסולו וLTRs proviral, אזורי איסור פרסום או env וצמתים אפשריים שחבור הקשורים למבני proviral, ללא כל פריורי על הפונקציונליות של אלמנט HERV. סיכויים להסתמך על שיפור של הסברים בכלי biocomputing הקשורים microarray. זה אמור לאפשר אחד כדי להמיר אותות שבב להשערות ביולוגיות כגון האם HERVs הפעיל מעיד לנהוג שעתוק lncRNA או לווסת פחות או יותר הפרוקסימלי ביטוי גני קידוד. ואכן, הנחה זו נתמכת על ידי מחקרים שנעשה לאחרונה כי זיהו תמלילי ncRNA ערמונית סרטן קשור המכילים רכיבים של vORFs iral ממשפחת HERV-K אנדוגני רטרווירוס או החלקים של אזור המקדם LTR נגיפי 37, וכן שני אירועי היתוך גן כלומר HERV-K22q11-ETV1 וHERV-K17-ETV 38,39. יחדיו, גישת transcriptome כל זה בשילוב עם פונקצית LTR והזדהויות אסטרטגית שחבור עשויה לעזור לפענח את הסמן מול רכיבי הדק ביטוי HERV ב40,41 כרוניים ומחלות זיהומיות 42,43.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי BIOMERIEUX SA, הוספיס Civils דה ליון וסוכנות הציבור הצרפתי OSEO (מתקדם אבחון לגישות טיפוליות חדש, תכנית במימון ממשלת צרפת המוקדשת לרפואה מותאמת אישית). PP, VC, GO, NM, וFM הם עובדי BIOMERIEUX SA. PP, NM וFM הגישו בקשות לפטנטים המכסות את הממצאים של עבודה זו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לססיל Montgiraud, ז'ולייט Gimenez, מגאלי Jaillard ורטרנד בונו על תרומתם לפיתוח ואופטימיזציה הראשוניים של פרוטוקול HERV-V2. כמו כן אנו מבקשים להודות חאדר Haidous להדרכה שלו על שיקולים אתיים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TrizolInvitrogen15596-026
RNA poly-A מלאי בקרהAffymetrix900433
DNAse 1PromegaM61011,000 U (1 U/µ l)
טרמינל טרנספראזRoche3333574001400 U. כולל אנזים וקואנזים (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Hybridization בקרות פנימיות B2 ו-20x Eukaryotic Hybridization ControlAffymetrix900454
GeneChip Hybridization, שטיפה וצביעהAffymetrix900720כולל PreHybridization Mix ו-2x Hybridization Mix ל-30 תגובות
10x One-Phor-All Buffer PLUSהרכב במים שטופלו ב-DEPC: 100 מ"מ Tris-acetate pH 7.5; 100 מ"מ מגנזיום אצטט; 500 מ"מ אשלגן אצטט.
ערכת מיני RNeasyQiagen74104פרוטוקול ניקוי RNA
WT-Ovation מערכת הגברת RNA Nugen2210-24
QIAquik ערכת טיהור PCRQiagen28104
<חזק>ציוד
חומר שם החברהמספר קטלוגיתגובות
Nanodrop 1000סורק Thermo Scientific
GeneChip 3000 7GAffymetrixGS30007Gאופציונלי: טוען אוטומטי
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hybridization 640 תנורAffymetrix640כולל 4 נושאי
מערך GeneChip Probeתחנת עבודה עמוסה בתוכנת הפעלה GeneChip (GCOS) כולל GeneChip Scanner 3000 תיקון סריקה
שבב HERV-V2AffymetrixCustom array.
לזמינות מיקרו-מערך (לשימוש מחקרי בלבד), אנא צור קשר:
Franç ois Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMé rieux
מחלקת גילוי אבחון רפואי
מרכז הוספיטלייה ליון סוד, Bâ timent 3F
69495, Pierre Bé nite cedex France
טלפון: 33 (0)4 72 67 87 85
דוא"ל: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
מסד נתונים והערות ייעודיות

בניית מסד נתונים ייעודי, קיבוץ רצפי HERV גנומיים השייכים ל-6 משפחות HERV, הושג על ידי ההליך הבא: (i) הרצף השלם והמייצג ביותר של כל משפחת HERV נבחר מהספרות והוגדר כרצף אב-טיפוס (<חזק>איור 2). (ii) ששת אבות הטיפוס סומנו מבחינה פונקציונלית בהתייחס ל-LTR שלהם (U3/R/U5) ולחלקים הפנימיים שלהם (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 הוחל לאחר מכן באמצעות רצפים פונקציונליים אלה כספריות קלט. חיפוש כלל-גנומי של כל הרצפים הקשורים בוצע על הגנום האנושי על בסיס מינימום של 80% הומולוגיה (NCBI 36/hg18). (iv) לבסוף, הרצפים הפונקציונליים שאוחזרו על ידי תהליך זה הורכבו למיקומים נפרדים על בסיס מיקומם הגנומי ובסופו של דבר יושמו במסד נתונים ייעודי של HERV. מסד נתונים זה, הנקרא HERV-gDB3, מכיל 10,035 מיקומי HERV בודדים35.

עיצוב בדיקות ספציפיות ללוקוס
החל מ-HERV-gDB3, תחילה נוצרו מסלולים חופפים של בדיקות מועמדות 25-mer. לאחר מכן כל בדיקה מועמדת יושרה כנגד הגנום האנושי באמצעות KASH 45 על מנת להעריך את פוטנציאל ההכלאה הצולבת. הערכה אחרונה זו בוצעה על ידי מודל שפותח במיוחד למטרה זו ומכונה EDA+. בקצרה, העיקרון של EDA+ הוא לקחת בחשבון את חוסר היציבות שמביאים אי התאמות ופערים בקומפלקס הכלאה של 25 מטרה/בדיקה. בדיקות מועמדות המציגות סיכוני הכלאה צולבת נמוכים (כלומר. מספר נמוך של מטרות גנומיות לא ספציפיות) נבחרות ולבסוף מורכבות לבדיקות.

מותאם אישית HERV GeneChip microarray
ה-HERV GeneChip המותאם אישית משלב 23,583 בדיקות HERV ויכול להבחין בין 5,573 אלמנטים מובהקים של HERV, מורכב מ-LTRs סולו, פרו-וירוסים מלאים וחלקיים (<חזק>איור 2). בדיקות הבקרה הסטנדרטיות של Affymetrix להגברה והכלאה בלתי מוטות נכללו גם הן במיקרו-מערך.
ברזולוציה גבוהה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).">Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).">Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).">You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).">Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).">Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).">Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).">Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).">Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).
  9. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).">Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).">Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).">Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).">Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).">Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).">Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).">Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).">Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).">Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).">Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).
  20. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).">de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).">Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).">Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).">Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).">Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).">Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).">Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).">Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).">Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).">Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).
  30. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).">Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).
  31. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).">Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).
  32. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).
  33. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).">Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).">Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).
  36. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).">Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).
  37. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).">Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).">Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).">Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).">Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).">Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).">Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).">Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).
  44. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).">Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).">Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HERV Loci ExpressionMicroarray AnalysisProstate Cancer BiomarkersRNA ExtractionWhole Transcriptome AmplificationHERV Gene ChipHybridization ProtocolDifferential Expression AnalysisFunctional ValidationBiomarker Discovery

Related Articles