הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

סיכום

הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.

תקציר

התקדמות בטכניקות תא חי הקרינה מיקרוסקופיה, כמו גם הבנייה של זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון אפשרה להדמיה בזמן אמת של תעבורה והתפשטות של זיהום בנגיף alphaherpes של נוירונים. השירות של חלבוני היתוך ניאון רומן קרום ויראלי, קלפה, וcapsids, בשילוב עם הדמיה תא חי שנוצר על מכלולי חלקיקים נגיפיים העוברים תחבורה בתוך האקסונים. כלים דומים כבר מועסקים בהצלחה לניתוחים של תאי תאים פזורים של חלקיקים נגיפיים לכמת את המספר והמגוון של virions מועבר במגע בין תאים. חשוב לציין, בטכניקות של הדמיה תא החי של תחבורה והתפשטות אנטרוגדית לייצר שפע של מידע ובכלל מהירויות חלקיקי תחבורה, הפצות של חלקיקים, וניתוחים זמניים של לוקליזציה חלבון. לצד טכניקות גנטיות נגיפיות הקלסיים, מתודולוגיות אלה סיפקו תובנות קריטיותלשאלות מכניסטית חשובות. במאמר זה נתאר בפירוט את שיטות ההדמיה שפותחו כדי לענות על שאלות בסיסיות של תחבורה וירוס alphaherpes והתפשטות.

מבוא

זיהום של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) על ידי וירוסי alphaherpes כגון נגיף הרפס סימפלקס (HSV) -1, -2, ונגיף pseudorabies (PRV) כולל מספר שלבים מורכבים ופיקוח הדוק לאורך כל מחזור החיים של הנגיף. תחבורה בתוך הנוירונים של PNS היא קריטית באירועים של שניהם זיהום ויראלי ראשוני והתפשטות בין מארח שלאחר מכן. המנגנונים המולקולריים המווסתים שני מרכיבים של מחזור החיים של הנגיפים; התחבורה בבימויו של מכלולים נגיפיים הרחק מגופי תא בתוך אקסונים (הובלת אנטרוגרדית) והשידור הבא של virions לתאים רגישים (התפשטות אנטרוגרדית) הם חשובים להבנת הפתוגנזה ההרפס.

התחבורה והיציאה של חלקיקים נגיפיים בתאי עצב תלוי בהרכבה של ^1,2 virion זיהומית בוגר. מבחני בעבר קבועים, כולל immunofluorescence (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), שמשו כדי ללמוד את מדינת ההרכבה החלקיקים וprotאינטראקציות ein קשורות לתחבורת virion והתפשטות ^3-6. עם זאת באופי הדינמי של virions ההובלה וממצאים ניסיוניים שהוצג על ידי קיבוע כימי מבולבל פרשנות קבועה תמונות ^7,8. לאחרונה, מספר החלבונים נגיפיים היתוך-ניאון כבר תאר לHSV וPRV שיש השפעות זניחות על תפקוד חלבון. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבוני ניאון אדומים (mCherry או mRFP) fluorophores הם לזווג לעתים קרובות כדי לאפשר הדמיה של שתיים משלושת הרכיבים המבניים של virion בוגר: קופסית, קלפה, וגליקופרוטאין ^9-11. לחיות הדמיה תא של התחבורה אנטרוגדית באמצעות וירוסים כפול שכותרתו מדמיין את מדינת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים במהלך הובלה. fluorophore הדומה הביע זני נגיפים המשמשים לדמיין מספר והמגוון של הגנום נגיפי בעקבות התפשטות ^12,13. את המאפיינים של חלבוני הניאון (הנסקרת ב ^14,15) להשפיע באופן משמעותיהיכולת לדמיין מכלולים נגיפיים או סלולריים. את המאפיינים המהותיים של החלבון פלואורסצנטי, כולל אינטראקציות עצמיות ויציבות, יש לשקול בעת תכנון ובדיקת החלבון fusions חדשני לשימור טבע מהסוג פונקציונלי.

בשיתוף עם איחודי חלבון פלואורסצנטי, שתי היטב מאופיינים במערכות תרבות תאים במבחנה מועסקים הדמיה תא חי של הידבקות בנגיף הרפס: ¹⁶ מנותקים וממודר ¹⁷ (איור 1 א) גרעיני עכברוש (SCG) נוירונים צוואר הרחם מעולים. בשתי המערכות, עוברי של SCG הם גזורים, ניתקו לגופי תא בודדים, ומצופה במבחנת culturing ^18. נוירונים SCG הם חלק ממערכת העצבים האוטונומית ויכולים להיות מתורבתים בקלות ומובחן על ידי גורם גדילה עצבי (NGF) לvivo לשעבר המדינה מקוטבת בוגר. נוירונים SCG ניתקים יוצרים רשת מורחבת של האקסונים המאפשרת Fאו ההדמיה של חלקיקים נגיפיים כפי שהם עוברים הובלת אנטרוגרדית ^6. תרבויות SCG ממודרים לספק בידוד fluidic של גוף התא העצבי (תא S) וTermini האקסון דיסטלי (תא N) ^19. מספר הפרוטוקולים המפורטים לבנייה ולשימוש בתאי עצב ממודר באמצעות שונים Campenot תאי ¹⁷ או ²⁰ מקורי כבר פורסם בעבר. בידוד Fluidic מאפשר לזיהום סלקטיבית של גופי תאים עצביים ואיתור של virions צאצאים לאחר ההובלה לטרמיני האקסון מבודד. ציפוי תאי האפיתל במשך טרמיני לפני ההדבקה מספק תאי נמען להתפשטות זיהום נגיפי.

יש הרבה מרכיבים חיוניים חשובים לכל הניסויים ההדמיה התא חיים, אבל רלוונטי ביותר לפרוטוקולים שלנו הם: רכישה אוטומטית תמונה, תאורת ניאון, מהירות של הדמיה, ושליטה על הסביבה. עבור כל ניסויי ההדמיה, אנו משתמשים,, מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית epifluorescence תאורה (איור 1). מיקרוסקופ בנוי סביב ניקון אקליפס טי הבסיס ומעסיק מספר מערכות מחשב שבשליטת ממונעת למהירות להגדיר מחדש את המיקרוסקופ במהלך רכישת תמונה אוטומטית. תאורה הקרינה, אנו משתמשים במנורת קשת ספקטרום רחב כספית שיכולה להיות מוחלש עם מסנני צפיפות ניטראליים לאורך נתיב ההארה. מסנני עירור להגביל את הספקטרום של תאורת ניאון וכאשר יחד עם מראות dichroic מרובות עוברות ומסנני פליטת הקרינה לדמיין תרכובות ניאון ספציפיות. את מסנני העירור ופליטה הם רכובים בגלגלים עצמאיים, מהר מיתוג סינון כדי לאפשר רכישה רציפה מהירה של ערוצי ניאון שונים. המהירות של רכישת תמונה עוד יותר משופרת עם מצלמת CCD EM-רגישה ומהירה, שימושית לזיהוי של אותות בעצימות נמוכים ותדמית קצרה לקרוא פעמים. שליטה בסביבת microscאופ מושגת עם למעלה שלב חממה מחומם ודוד עדשת מטרה לשמור על דגימות בטמפרטורות גבוהות תוך אווירה מועשרת ₂ CO humidified והוא עבר לחממה. מיקרוסקופ נשמר בחדר חשוך עם טמפרטורת הסביבה נשמר קרוב ל 25 מעלות צלזיוס ואור בחוץ ממוזערים עם וילונות האפלה על כל החלונות. הפרוטוקולים הבאים לתאר את השימוש במערכת זו להובלת אנטרוגרדית ומבחנים להתפשט.

קיים מספר החלופות לשליטה למשתנים של הדמיה תא חי. השליטה על הגדרות מיקרוסקופיה יכולה להתבצע באופן ידני או באמצעות מערכות אוטומטיות תלויות בתוכנת קניינית. תאורת הקרינה ניתן להשיג עם ההלוגן, LED או מקורות לייזר. המהירות של הדמיה היא שונה על ידי המהירות של מיתוג מסנן ואת הזמן כדי להמחיש את האות עם מערכת זיהוי לזווג. בקרה סביבתית יכולה להיות מושגת באמצעות חומרה מיוחדת במיילשלב croscope, מתחם של חלק ממיקרוסקופ בתיבה מחוממת וhumidified או כל, או על ידי העלאת הטמפרטורה של החדר שבו מיקרוסקופיה תבוצע. כל אחת מחלופות אלה יש יתרונות וחסרונות הקשורים למחיר וביצועים.

בפרוטוקול שלאחר מכן, אנחנו פירוט השימוש בהדמית תא חי ללמוד תחבורה אנטרוגדית מהירה והתפשטות של וירוסי אנטרוגדית alphaherpes באמצעות השימוש בזני נגיפי רקומביננטי. הדמיה תא חי בזמן אמת visualizes קופסית, קלפה ו / או גליקופרוטאין שיתוף לוקליזציה על מבנים דינמיים העוברים תחבורה בתוך ¹¹ אקסונים. ההדמיה timelapse הלילה של תרבויות העצביות הממודרות מדמיין יציאה virion axonal וזיהום של תאים רגישים ^12. הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מותאמים לשימוש עם מערכת ההדמיה המסוימת שלנו, אבל מוצגים במונחים רחבים ביחס לארבעה היסודות של הדמיה תא חי. בדיון שהיינויפרט עוד כמה אופטימיזציה כי הוא הכרחי לניסויים מוצלחים.

פרוטוקול

סעיף 1 - תנאי בקרה סביבתיים למיקרוסקופ פלואורסצנטי Live-תא

1. 30 דקות לפני כל ניסוי הדמיה להתחבר ולהתחיל לחמם את המיקרוסקופ השלב העליון החממה.
   1. הפעל מיקרוסקופ, מקורות אור מועברים וepifluorescent, ופקדי חומרה אוטומטיים. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ, אלמנטי ש"ח, כדי להתחבר למיקרוסקופ ולהתחיל קירור המצלמה EM-CCD.
   2. צרף עדשות חמה יותר למטרה המתאימה (או 60x או טבילת שמן 100X). הערה: בחר עדשה אובייקטיבית המבוססת על סוג הניסוי. התערבות ההפרש לעומת זאת 100X (DIC) היא הטובה ביותר עבור מעקב של מכלולי virion הובלת אנטרוגרדית תוך מטרת שלב 60x מתאימה כדי להמחיש התפשטות אנטרוגדית. ההגדלה נמוכה, טבילה מטרות שאינן נפט אינן דורשות עדשה חמה יותר כמו שהם לא ליצור קשר ישיר עם המדגם.
   3. צרף שלב חממה עליונה על הבמה הממונעת של מייל croscope. להבטיח את התותב המתאים שיקיים המדגם נמצא במקום. צרף את קו אוויר humidified משליטת החממה ליציאת הקלט על הבמה העליונה החממה.
   4. הפעל חממה ועדשת פקדים חמים יותר ולהתאים את הגדרות לתנאי טמפרטורה מאומתים עבר ספציפיים למטרה והדוגמא שצלמה (ראה דיון).
   5. פתח את שסתום הבקרה על 5% CO _2/95% טנק אטמוספרי כדי לספק אוויר CO ₂ בתוספת לשלב חממה עליונה. קצב הזרימה צריך להיות בין 60 ל 80 מ"ל של גז לדקה. שיעורים מהר יותר יגרמו להתייבשות מדגם נרחבת למרות קאמרי humidifying.
2. הוסף שמן עדשה לעדשה אובייקטיבית ולמקם את התרבות שיהיה צילמו לשלב העליון החממה באופן מיידי.
3. לאפשר איזון של טמפרטורה בתרבות למינימום של 10 דקות. שעה אחת עדיפה, במיוחד עבור ההדמיה הלילה המתוארת בסעיף 3.

ve_title "> סעיף 2 - הדמיה בזמן אמת של פרוטוקול התחבורה virion אנטרוגרדית אירועים

1. שש עד שמונה שעות לפני ההדמיה, להדביק צלחת 35 מ"מ coverslip התחתון של נוירונים SCG בוגרים, ניתק עם 1 x 10 ⁶ יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס '1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור ואחרים אל. 2012a ^11. אם בדיקת וירוס אחד או יותר, חיסונים קיזוז על ידי 30-60 דקות, כדי לאפשר הדמיה של דגימות רציפות בזיהום הודעה פעמים דומה.
2. הכנס לתוך צלחת שלב העליונה חממה למינימום של 10 דקות לפני הפעלת כל ניסוי. בעוד טמפרטורת equilibrates, מישור המוקד עובר ויהיה להשפיע לרעה על כל ניסויי הדמיה.
3. באמצעות אור מועבר והעינית של המיקרוסקופ, למצוא גוף תא עצבי שיש לו סיומת axonal בבירור מבודדת. לחלופין, השתמש בתאורה המתאימה לקרינה למצוא תא להביע detecכמויות טבלה של חלבוני ניאון. חשוב להגביל את החשיפה של מדגם לתאורת פלורסנט, בשלב זה והשלבים הבאים, בגלל נזק לתאים מושרה אור והלבנה של חלבוני ניאון.
4. להחליש תאורת הקרינה כדי להפחית את עוצמת אור עירור לתאים שנחשפים. לעסוק אור הממתן צפיפות ניטרלי (ND) במסנני הקרינה נתיב אור התאורה. עבור סרטים שנמשכים יותר מ 1 דקות, מינימום של ND4 חייבים לשמש כדי למנוע צילום הלבנת של חלבוני ניאון ותמונות נזק של אקסונים נרחבים. מבנים מאוד ניאון בדרך כלל יכולים להיות דמיינו עם מסנן ND8 במקום.
5. באמצעות תוכנת מיקרוסקופ (איור 2 ומשלימת הסרט 1A), להדליק את האור, הדרך למצלמה EM-CCD.
6. לקבוע זמני הדמיה אופטימליים ותנאים לכל ערוץ ניאון.
   1. ליזום חלון תמונה חי באמצעות כפתור "הפעל".
   2. לקבוע את הגדרות חשיפת המצלמה האופטימליות עבור כל חלבון פלואורסצנטי. לא תעלה על 300 אלפית שנייה לכל ערוץ כסטיות motional של מבני virion זזו מהר יתרחש. לנצל את רווח EM של המצלמה להגדרה של 300 (יצרן הציע רווח מרבי), כדי לצמצם את זמן חשיפה ולשפר את זיהוי של אותות עמומים. זמני חשיפה נכונים צריכים לייצר תמונה עם רקע בעוצמה נמוכה ואותות ספציפיים גבוהים.
7. לאחר הגדרת חשיפות ומציאת אזור מוגדר היטב של האקסון, יש להגדיר את התוכנה כדי לבצע רכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות כדי למנוע הלבנת מדגם.
   1. בתוכנת אלמנטי ש"ח, בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מירידת "יישומים" למטה בתפריט.
   2. בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית הזמן שתקבע את תדירות רכישה של תמונה. הגדר את המרווח ל" אין עיכוב "ואת משך הזמן עד 5 דקות. הלאחר מכן תוכנת דואר תרכוש מסגרות תמונה בתדירות הגבוהה ביותר האפשרית עבור משך זמן של 5 דקות.
   3. בחר בכרטיסייה "למבדה", המאפשרת בחירה של תצורות החומרה שנקבעו מראש המשמשות לרכישת תמונת ניאון מרובה. לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט כדי לבחור תצורת חומרה מתאימה. חזור על פעולה עבור כל חלבוני הניאון להיות צלמו.
   4. להבטיח את הכרטיסיות לפוזיציות "XY", "Z-סדרה" ו "תמונה גדולה" הן דה שנבחרה.
   5. מעל לכרטיסיות, בחר בתיבה המסומנת "שמור לקובץ" כדי לשמור את התמונות באופן אוטומטי לדיסק הקשיח במהלך רכישה. הגדר את המיקום ואת שם קובץ של קובץ פלט הניסוי. כניסויים רציפים מבוצעים, התוכנה תוסיף את מספר סידורי בסוף שם הקובץ המיועד.
   6. ברגע שכל הכרטיסיות שנבחרו. ליזום את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור "Run-עכשיו".
   7. לייעל את קצב רכישת התמונה דרך הגדרות חשיפה ומתאר לעצמיגודל דואר. שימוש באזור קטן של שטח תמונה, מסוגל לעתים קרובות להאיץ את שיעורי רכישת מסגרת. הגדר את האזור של עניין באמצעות כלי ההחזר על ההשקעה בש"ח-אלמנטים, בחירת אזור שבין 25% ל 50% משטח התמונה הכולל. לחלופין, זמני חשיפה קצרים יותר יגדילו את שיעורי רכישת מסגרת, אבל מקטין את איכות האות (ראה דיון).

סעיף 3 - זמן לשגות הדמיה של אירועי לילה מורחים אנטרוגדית

1. ארבע שעות לפני הדמיה, להדביק תרבות עצבית ממודרת נבנתה על 35 מ"מ μ-תבשיל. לחסן גופי תאים עצביים עם 1 x 10 ⁶ יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס '1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור et al. 2012b ^12.
2. מניח בעדינות צלחת התרבות לשלב העליונה החממה. ודא את המיקום של המטרה מוגדר לצד המנה. לאט לאט מביא את המטרה אל מוקד, ensuring האובייקטיבי לא לדחוף לתוך המדגם. ברגע ששדה המיקוד זוהה, לנוע באיטיות במטרה למרכז הצלחת, ליד המחסום הפנימי demarking הצד הפנימי של תא האקסון. במהלך תנועה, להבטיח את עומק המיקוד נשמר ולהימנע מלדחוף לתוך המדגם. סטייה של משטח הפלסטיק על ידי המטרה תגרום ניזק לאקסונים והפלסטיק.
3. הוסף כ -2 מ"ל של חם (~ 37 מעלות צלזיוס) בופר פוספט למנת התרבות חיצונית של טבעת הטפלון. זה מקיף את התרבות העצבית עם טבעת של PBS כדי למזער את ההתייבשות לדוגמה ומספקת בידוד תרמי.
4. לאפשר טמפרטורה לאזן עבור מינימום של שעה 1 לפני ייזום רכישת תמונה אוטומטית (3.8). שלבים 3.5 עד 3.7 יכולים להיות מוגדרים בתקופה זו.
5. להגביל את עוצמת התאורה לרמה הנמוכה ביותר האפשרית על ידי העוסק כל מסנני הצפיפות ניטראליים. זה יאפשר רכישת תמונה תכופה oveפרקי זמן ארוכים ללא תמונה r-נזק מוגזם. הפחתת תאורה תגרום לאות נמוכה, הדורשת חשיפה ארוכה יותר (ראה דיון).
6. השתמש בהגדרות חשיפה היסטורי או לפני ניסיוני ההגדרה ליצור מנה מקבילה של תאי האפיתל נגועים להביע את חלבוני ניאון היעד להקים הגדרות חשיפה כמתואר בסעיף 2.5.
7. לאחר הגדרת חשיפות לאפיקים הדרושים, זה זמן להגדיר את התוכנה לרכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות להגביל מדגם הלבנת.
   1. בתוכנת אלמנטים (איור 2 וסרט משלים 2), בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מהירידה "יישומים" למטה בתפריט כדי להעלות את חלון רכישת ND.
   2. בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית השעה. הגדר את המרווח ל" 5 דקות ". הגדר את משך הזמן עד 20 שעות. שדה הלולאות יחושב באופן אוטומטי למספר חזרות prograמ 'יבצע.
   3. בחר בכרטיסייה "למבדה". לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט בחר בתצורה המתאימה למבדה בניגוד שלב. חזור לעמדות שלאחר מכן, בחירת התצורות המתאימות לכל חלבון פלואורסצנטי להיות צילמו.
   4. בחר בכרטיסייה "התמונה גדולה", הקובעת את הפרמטרים של מספר רב של תמונות כדי להיות משולבים לתוך שדה אחד גדול של נוף. אזור טוב בגודל מורכב 5 תמונות x 2 באמצעות חפיפה תפרים 7%. זה יאפשר למספר המרבי של תאים לכל עמדה להיות צילמו מבלי להשפיע על התדר של רכישת תמונה. כמו כן, בטל את סימון התיבה עבור "תריס פעיל סגור במהלך תנועת הבמה". אפשרות זו משפרת את המהירות של רכישה על ידי לא סוגר תריסים בין תמונות.
   5. בחר בכרטיסייה "XY פוזיציות", כדי לזהות מספר רב של עמדות שיהיה צלמו ברצף במקביל במהלך הסרט בין לילה. בחר עמדות המגדירות את פו המרכזint עבור כל אזור בתמונה גדול. בחר 6-8 עמדות תמונה במדגם. שטח תמונה טוב יהיה אשכולות קטנים של תאים בפרד קרוב לאקסונים מוגדרים בבירור. תאים לא צריכים להיות נערם זו על גבי זו bundling האחרת והאקסון צריך להיות ממוזערים. נקודת המיקוד היא גרעין התא. מקם את המטרה כך שמעטפת גרעין מוגדר היטב נתפס עבור רוב התאים.
   6. להבטיח את הלשונית "Z-הסדרה" אינה מסומנת.
   7. הגדר את התכונה 'שמירה אוטומטית כאמור לעיל בסעיף 2.6.5.
   8. בדוק את החשיפה והגדרות מיקום על ידי לחיצה על "זמן הלולאה 1". להעריך את התמונות משודר לתאורת אור, מיקוד ומסגור כתוצאה מכך. אם המיקוד השתנה, לאפס את המוקד לכל עמדה תחת לשונית XY. חכה 10 דקות ולחזור על פעולה זו עד שהדגש הוא יציב.
   9. לאחר אומתו את כל ההגדרות ונבדקו, ליזום ניסוי האוטומטי על ידי לחיצה על הכפתור "הפעל כעת".

עיבוד תמונה ויצוא - סעיף 4

נתוני יצוא

1. מערכי נתונים שהושגו במהלך לחיות תאי הדמיה של אירועי תחבורה או התפשטות צריכים להיות מיוצאים מהתוכנה שקל אלמנטים לסוגי קבצים בשימוש נפוצה לשימוש מאוחר יותר במצגות ופרסומים (משלימה סרט 3). כדי לייצא סרטים לפתוח את הקובץ המתאים nd2 הגלם. באלמנטי ש"ח ובחר את התצוגה "פיצול המרכיב" כדי להמחיש את ערוצי הניאון הרצויים. השמעת הקובץ במהירות מתאימה, 5 מסגרות לשנייה היא נקודת התחלה טובה להדמיה של תחבורה מהירה.
2. כולל חותמת זמן כדי לייצג את שעון בזמן אמת בעת צפייה בסרט. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר, הוסף ND-מידע. מונה דיגיטלי יופיע בפינה השמאלית העליונה.
   1. ערוך את חותמת הזמן כדי להציג את המידע. לחץ לחיצה ימנית על הדלפק ובחר עריכת ND-מידע. בחלון הקופץ שלאחר מכן, ערוך את הטקסט כדי לשקף Imagiפרמטרים ng שחשובים. עריכת גופן, צבע וגודל לבהירות.
3. לכו לתפריט "ערוך" ולמצוא את "יצירת תמונת מצב תצוגה" או לחץ על המקש "X". פקודה זו פותחת את החלון "תצוגת תמונת המצב". בחר "תחול על כל המסגרות" לייצר 8 סיביות, RGB, קובץ יצוא מוכן המכיל את ערוצי ניאון מכל הסרט.
4. שמור כקובץ. אבי עבור תאימות בין הפלטפורמה. קבע שיעור השמעה ב 200 אלפיות שנייה לכל מסגרת. את קבצי AVI. נוצרו על ידי אלמנטי ש"ח אז ניתן לדחוס עוד יותר עם תוכנת המרה אחרת לסוג הקובץ הרצוי.

תוצאות

התחבורה אנטרוגדית

יישום של פרוטוקול זה לזיהומים של תרבויות SCG ניתק עם PRV 348, זן PRV רקומביננטי לבטא חלבוני איחוי קרום GM-mCherry GFP-Us9 ו, יש להקל הדמיה של התחבורה אנטרוגדית של virions (איור 3 וסרט משלימה 4). שילוב של החלבונים האלה ההיתוך לתוך תוצאות נגיפיות חלקיקים באיתורם בהובלת puncta ותנאי ההדמיה האמורים למזער את הקיזוז של כל fluorophore על חלקיק בתנועה במהלך מיתוג מסנן. בחלון הדמיה של שלוש ...

דיון

המטרה של הדמיה תא החי היא התבוננות בתהליכים ביולוגיים כפי שהם מתרחשים ללא שינוי משמעותי על ידי הפעולה של התבוננות. מטרה זו מושגת על ידי אופטימיזציה של שלוש משתנה: איכות סביבה, מהירות של הדמיה, ותאורת פלואורסצנטי. משתני היתר תלויים אלה חייבים להיות מאוזנת כדי להשיג תנאי הדמיה קיימא. הפרוטוקולים שהוצגו לנצל תנאים מסוימים כדי להפיק את התוצאות המייצגות. אנו נדון באיכות הסביבה ונזק תצפיתי בקצרה לפני מפרט את השיטות הספציפיות שהוצגו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבות תחתית זכוכית 35 מ"מ	MatTek Corporation; אשלנד, MA	P35G-1.5-20-C
35 מ"מ μ-Dish	Ibidi USA LLC, ורונה, WI	81156
גוף מיקרוסקופ	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
מיקרוסקופ ממונע שלב X-Y קודם	מדעי; Rockland, MA	H117 ProScan
	עליונים Prior Scientific	HF110 גלגל מסנן 10 מצבים
	מיסיסוגה, אונטריו קנדה	X-Cite 120Q
מסנני פלואורסצנציה רב-פסים ערכות Chroma	Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry -
EM-CCD	אנדור טכנולוגיה ארה"ב; דרום וינדזור, CT	iXon3 897
Chamlide שלב החממה הסביבתית המובילה	Live Cell Instruments; סיאול, דרום קוריאה	אובייקטיבי TC-L-10
	Bioptecs; באטלר, בקר 150803 פנסילבניה	150819-12-08 תוכנת ניתוח תנורי חימום
	Nikon Instruments Inc.; מלוויל, ניו יורק	NIS אלמנטים

גלגלי מסנן ממונעים שטוחים מקור תאורה פלואורסצנטי Lumen Dynamics; מצלמת ET מחמם עדשות