קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1D ו-2D 1H

Summary

נקבע מבנה תמיסת ה-NMR של פפטיד מודל מטאלוצ'פרון עם Cu (I), ומתואר פרוטוקול מפורט מהכנת דגימה ואיסוף נתונים חד-ממדיים ודו-ממדיים למבנה תלת מימדי.

Abstract

קשירת נחושת (I) על ידי חלבוני הובלת מטאלוצ'פרון מונעת חמצון נחושת ושחרור היונים הרעילים שעלולים להשתתף בתגובות חמצון חיזור מזיקות. קומפלקס Cu (I) של מודל הפפטיד של חלבון מטאלוצ'פרון קושר Cu (I), הכולל את הרצף MTCSGCSRPG (מסומן בקו תחתון נשמר), נקבע בתמיסה בתנאים אינרטיים על ידי ספקטרוסקופיה של NMR.

NMR היא טכניקה מקובלת לקביעת מבני תמיסה של חלבונים ופפטידים. בשל הקושי בהתגבשות לספק גבישים בודדים המתאימים לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, טכניקת ה-NMR היא בעלת ערך רב, במיוחד מכיוון שהיא מספקת מידע על מצב הפתרון ולא על המצב המוצק. כאן אנו מתארים את כל השלבים הנדרשים לקביעת מבנה תלת מימדי מלא על ידי NMR. הפרוטוקול כולל הכנת דגימה בשפופרת NMR, איסוף ועיבוד נתונים חד-ממדיים ודו-ממדיים, הקצאת שיא ואינטגרציה, חישובי מכניקה מולקולרית וניתוח מבנה. חשוב לציין, הניתוח נערך לראשונה ללא קשרי מתכת-ליגנד מוגדרים מראש, כדי להבטיח קביעת מבנה אמינה בצורה בלתי מוטה.

Introduction

פפטידים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים של חלבונים, מובילי תרופות פוטנציאליים וסוכנים טיפוליים בפני עצמם. עם זאת, גודלם הקטן ומידת הגמישות הגבוהה שלהם מונעים לעתים קרובות קביעת מבנה על ידי קרני רנטגן עקב קשיים בהתגבשות.

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לשמש לקביעת מבנים ואינטראקציות של פפטידים. השיטה יכולה לתת מידע לגבי מבנה מקומי וכללי, אינטראקציות קשירה וזיקה נמוכה יותר, והיא ישימה לדגימות קשות מכיוון שניתן לעשות זאת במצב הפתרון.

הובלת נחושת במערכות ביולוגיות מושגת על ידי חלבוני נחושת מטלוצ'פרון תוך-תאיים הקושרים באופן ספציפי יוני Cu (I) ומעבירים אותם לחלבוני המטרה שלהם באמצעות סדרה של אינטראקציות חלבון-חלבון, כדי להגן על היונים מפני חמצון ולמנוע שחרור נחושת רעילה^2-5. אתר הקישור מאופיין ברצף המשומר, MXH/TCXanyXanyC, שהוכח הן על ידי NMR והן על ידי קריסטלוגרפיה כקושר את ה-Cu (I) על ידי ליגנדות התיולטו הרכות של שתי שאריות הציסטאין, אם כי הוצע גם ליגנד חיצוני נוסף^6-8. יחסי המבנה-תפקוד של חלבונים אלה היו נושא למחקר אינטנסיבי⁹.

במחקר המוצג כאן, סונתז מודל פפטיד הכולל את הרצף השמור של מטאלוצ'פרונים נחושת והגיב עם Cu (I) בסביבה אינרטית. הפרוטוקול המוצג מתאר את שלבי קביעת המבנה על ידי NMR, כולל הכנת דגימות, איסוף נתונים, עיבוד נתונים, יצירת מבנה וניתוח מבני. הניתוח נעשה בשני שלבים: ראשית נוצרו מבנים ללא מידע לגבי אופן הקישור של הפפטיד ליון הנחושת. לאחר שמצב הכריכה נקבע באופן אמפירי, אילוצים אלה הוצגו כדי לספק מבנה ברזולוציה גבוהה. אופן הכריכה הוא הנקודה המהותית במודל ולכן נקבע באופן בלתי משוחד.

הקביעה המבנית של NMR של פפטידי מודל היא טכניקה בעלת ערך רב המשמשת לעתים קרובות כימאים וביולוגים. ניתן ליישם אותו בקלות יחסית על פפטידים שונים בתנאים שונים, ובכך עשוי לשפוך אור על מנגנונים רלוונטיים¹⁰. הבנת תהליך הבהרת המבנה מספקת הבנה טובה יותר של נקודות החוזק והחולשה של המבנים המוצעים.

Protocol

1. הכנת מדגם

1. דגימת אפו: ממיסים כ-1-2 מ"ג של הפפטיד ב-450-500 מיקרוליטר של ממס בדרגת תמ"ג (הפתרונות המועדפים לדגימות ביולוגיות הם 10% D2O במים או d6-DMSO ^11-12 אם הדגימה אינה מתמוססת במים או מגיבה איתם).
2. דגימה מגיבה נחושת: ממיסים כ-1-2 מ"ג מהפפטיד עם כמות שווה ערך של מלח מתכת ב-450-500 מיקרוליטר של ממס ה-NMR.
3. מסננים את התמיסה באמצעות זכוכית סינטר, נייר סינון או כל טכניקה אחרת המתאימה לתרכובות הנחקרות ואינה סופחת אותן. זה חיוני כדי להסיר חלקיקים מתכתיים, שישפיעו על ההומוגניות.
4. העבירו את התמיסה לצינור NMR וסגרו אותו. ודא שאיכות הצינור מתאימה לחוזק המגנט בו נעשה שימוש (לפרטים נוספים ראה טבלת ציוד).
5. אם הדגימה רגישה לחמצן, יש לבצע שלבים אלה בסביבה אינרטית ולאטום את הצינור כדי למנוע חמצון.

2. איסוף ועיבוד נתוני NMR¹³

1. רשום ספקטרום 1D ¹H של הדגימות המגיבות לאפו ונחושת והשוואה. ספקטרום הפפטידים המכיל נחושת אמור להראות שינוי משמעותי של שינוי כימי באזור האמיד והפסגות נפתרו מכיוון שהאפו-פפטיד גמיש ומראה ממוצע של קונפורמציות, אך בתגובה עם נחושת, לאמידים הקשורים לפפטיד יש מבנה יחיד (איור 2).
   1. אם הספקטרום אינו משתנה, ההנחה היא שהתגובה נכשלה.
   2. אם הדגימה תהפוך לירוקה, הנחושת תחמצן באטמוספירה, מה שעלול לשנות את תכונות הקישור שלה.
   3. בשני המקרים הללו, יהיה צורך לבצע מחדש את הדגימה.
2. מצא תנאי טמפרטורה אופטימליים למדידות NMR הנותנים חפיפה מינימלית של שאריות האמיד עם רוחב קו צר.
3. הגדר ניסויי COSY¹⁴, TOCSY¹⁵ ו-NOESY¹⁶, או ROESY¹⁷ NMR בתנאים זהים (טמפרטורה, pH וכו') והפעל ברצף.
   1. ניסויי COSY (איור 3) ו-TOCSY (איור 4) יזהו אינטראקציות דרך קשרים של אינטראקציות פרוטון-פרוטון סמוכות וארוכות טווח, בהתאמה. ספקטרום COSY נותן מידע על מתאמים HN-Hα בעוד שספקטרום TOCSY נותן, בנוסף, מידע על HN ופרוטונים אליפטיים אחרים של H של שאריות מתואמות.
   2. ניסויי NOESY ו-ROESY (איור 5) מזהים קרבה דרך החלל ללא תלות בקשרים כדי לתת מידע מבני. הבחירה בין השניים היא על פי הגודל האפקטיבי של התרכובת וחוזק השדה. כמה שילובים כאלה נותנים אותות אפס תיאורטיים (איור 6) ויהיה צורך להריץ ניסוי ROESY כדי לזהות אינטראקציות NOE^10,18.
   3. אם הדגימה נמצאת במים, הניסויים צריכים לכלול מרכיב של דיכוי מים. זה מושג בצורה היעילה ביותר באמצעות שיפועים¹⁹. במקרה זה, כדאי להריץ מחדש את הדגימה, לאחר שהוקצתה, ב-D₂O טהור כדי להשיג אינטראקציות למימן Hα וביניהם.
   4. מטב את משך זמני הערבוב של TOCSY ו-NOESY או ROESY על ידי הפעלת מספר ניסויים קצרים כדי למצוא הצטברות אות מקסימלית עם אובדן מינימלי לדיפוזיה ספין. ודאו שזהו האזור הליניארי של עקומת ההצטברות. ערכים נפוצים עבור פפטידים בשדות MHz 600 כוללים זמני ערבוב של כ- msec 100 עבור TOCSY ו- msec 150 עבור ניסויי NOESY או ROESY.
   5. הריצו ניסויים חד-ממדיים בין כל ניסוי כדי לוודא שהרכב הדגימה נשאר קבוע לאורך כל רכישת הנתונים (איור 7).
4. עבד את הספקטרום באמצעות פונקציות אפודיזציה מתאימות כדי להשיג רזולוציה מקסימלית עם אובדן מינימלי של עוצמת האות, תוך הוספת מילוי אפס בממד t1.
   1. תקן עוד יותר את קו הבסיס בממד F2 ואז F1 עם פונקציה פולינומית ריבועית.
   2. כייל את ההסטה הכימית של הספקטרום בזהירות בהתאם לשיא המים הנותרים או DMSO בממיסים המתאימים בהתאם לסטייה שלהם מהתקנים הידועים (TMSP או TMS, בהתאמה).

3. שיא הקצאה ואינטגרציה באמצעות SPARKY²⁰

1. הכינו קבוצה של ספקטרום COSY ו-TOCSY על ספקטרום NOESY או ROESY (איור 8).
2. הקצה את כל פסגות ה-NOE בספקטרום על פי מתודולוגיית ההקצאה הרציפה שפותחה על ידי Wüthrich²¹.
   1. התחל עם הקצאת פסגות החופפות לאותות TOCSY באזור טביעת האצבע, מכיוון שזה יקל על ערכי הקצאת שיא עוקבים עם תוכנית SPARKY (איור 9). רשום את ההסטה הכימית של ההקצאה (איור 10), ^ו-3 ערכי JHNHα (איור 11).
3. תרגם פסגות לאילוצי מרחק וערכי 3 JHNHα לזוויות דיהדרליות.
   1. ניתן לעשות זאת על ידי שילוב הפסגות מתוך התוכנית ותרגומם לאילוצי מרחק באמצעות אינטראקציה של מרחק ידוע (כגון המרחק בין שני פרוטונים מקבוצת מתילן או אטומי מימן ארומטיים של חומצת אמינו ארומטית).
   2. אם הפסגות חופפות, ולא ניתן להשתמש בשיטות אינטגרציה, ניתן לתייג אותן כחזקות-בינוניות-חלשות-חלשות מאוד על ידי הערכה חזותית, וניתן לתרגם את הכינויים הללו למרחקים של עד 2.5, 3.5, 4.5 ו-5.5 Å, בהתאמה. זה יהיה היעיל ביותר בעבודה עם פפטידים.
   3. ³ערכי JHNHα מצביעים על זוויות דיהדרליות על פי משוואת קרפלוס שבה רוב ערכי הצימוד הנתונים יכולים לנבוע מיותר מזווית דיהדרלית אחת. אלה יכולים להעיד על מבנה משני (סלילי או יריעות), סליל אקראי או ממוצעים קונפורמטיביים שלו. לכן, חשוב להשתמש באילוצים בזהירות, או להשתמש בהם כאישור לתוצאות קונפורמציה.

4. חישובי מכניקה מולקולרית ליצירת אנסמבל מבנים באמצעות XPLOR22

1. ייבא את אילוצי המרחק והזוויות הדיהדרליות עם הפורמט הנכון עבור XPLOR. (איור 12, אילוצים בין-שיוריים בלבד). XPLOR תחפש מרחב קונפורמציה כדי למצוא מבנים הנצמדים לאילוצים כימיים גיאומטריים קנוניים, כגון אורכי קשר, זוויות, כיראליות וכו', בנוסף לאילוצי המרחק שנמצאו בניסוי, כדי ליצור אנסמבל שבו אף אחד מהפרמטרים לעיל אינו מופר. זה יהווה את ההרכב הפותח.
2. ריצת קביעת המבנה הראשונה תהיה ללא שימוש באילוצים כלשהם למתכת. זה יראה אילו שאריות משתתפות בכריכת מתכות ללא כל הטיה. דלג לשלב 4.4.
3. בנוסף לאילוצי המרחק הנגזרים מ-NMR, הוסף אילוצי קשירת מתכת לשאריות שנקבעו.
   1. הוסף פרמטרים מתאימים לתיאור יון המתכת והטופולוגיה שלו.
   2. יש להכניס את המידע הפיזיקלי המתאים (מסה, אורכי קשר עם אטומים אחרים, זוויות ופרמטרים של דחייה לא מקשרת) לקובץ הפרמטרים.
   3. הוסף את פרטי הכריכה לקובץ הטופולוגיה: אילו קשרים נוצרים ונשברים, ואילו מטענים צורניים משתנים כתוצאה מהכריכה.
4. צור הרכב קטן של בדרך כלל 10 חברים.
   1. הציגו את האילוצים בהדרגה, החל מאינטראקציות עמוד שדרה לעמוד השדרה, לאחר מכן עמוד שדרה לשרשרת צד, לאחר מכן אינטראקציות צד לשרשרת צד, ועברו מאינטראקציות תוך-שיוריות, רציפות לטווח ארוך יותר ויותר. זה מקל על זיהוי טעויות במשימה.
   2. הציגו את אנרגיית ה-NOE כפוטנציאל באר ריבועית עם קבוע כוח קבוע של 50 קק"ל/מול•^{Å 2}. חישול מדומה צריך להיעשות עם 1,500 צעדים של 3 שניות ב-1,500 K ו-3,000 צעדים של 1 fsec במהלך הקירור ל-500 K. לבסוף, צמצם את המבנים באמצעות מזעור אנרגיית שיפוע מצומד עבור 4,000 איטרציות; אלו הם משתנים הניתנים לשינוי בתוך XPLOR.
5. צור הרכב סופי של בדרך כלל 50 חברים. בצע שלבים משלב 4.4 על כל האנסמבל.
   1. דווח על המספר של כל סוג של אינטראקציה NOE שנמצאה, כפי שמוצג באיור 13.
6. צור אנסמבל של מבנים הנצמדים לגיאומטריה כימית קאנונית ולאילוצים האמפיריים הנגזרים מתמ"ג.
   1. דווח על המספר הכולל של קונפורמציות, מספר אלה שיש להם הפרות של האילוצים הנגזרים מ-NMR, וה-RMSD של כל המכלול, הן עמוד השדרה, והן כל ערכי ה-RMSD של האטומים הכבדים.

5. ניתוח מבנה

1. ההרכב שנפתר מייצג את המרחב הקונפורמטיבי שאומץ על ידי הפפטיד במהלך מדידת ה-NMR. הגמישות המקומית עשויה להשתנות באזורים שונים של המולקולה וניתן לייחס זאת לסיבות מבניות או תפקודיות (מטרת הניתוח המבני היא לקבוע את הבסיס המבני ליציבות ומנגנון הפעולה).
   1. ייבא את כל הקונפורמציות של המבנה לתוכנית MolMol23 כדי ליצור הרכב התחלתי (איור 14).
2. לבחון את ההרכב כדי לקבוע את היציבות המקומית של המולקולה.
   1. קבע את ערכי ה-RMSD של עמוד השדרה והשרשרת הצדדית על ידי בחירת אזורי ארבעת השאריות הבאים לאורך הרצף ובקשת התוכנית לחשב את ה-RMSD למבנה האנרגיה הנמוך ביותר או לממוצע.
   2. קבע אילו אזורים של המולקולה מראים יציבות מקומית (איור 15) על ידי התוויית ה-RMSD המקומי כפונקציה של רצף.
   3. שכבו את ההרכב לאורך אזור זה של המולקולה והשתמשו בהרכב זה לניתוח נוסף (איור 16).
3. בחר קונפורמציות באנרגיה נמוכה הנצמדות לאילוצים הנגזרים מ-NMR (ללא הפרה). אלה יהוו את "הרכב האנרגיה הנמוכה".
   1. דווח על מספר הקונפורמציות בהרכב, הקריטריונים לבחירתם וערכי RMSD כפי שהוגדרו בשלב 4.6.1.
   2. אם מצב כריכת המתכת כבר נקבע, המשך לשלב הבא. אחרת: נתח את מכלול האנרגיה הנמוכה וקבע אילו שרשראות צד של שאריות נמצאות בסמיכות נכונה זו לזו כדי להיות מסוגלים לקשור את יון המתכת. לאחר שנקבעו, חזור לשלב 3.3 ובצע מחדש את הניתוח כולל נתוני קשירת הנחושת (איור 17 עבור האנסמבל ואיור 18 עבור הקונפורמר באנרגיה נמוכה).
4. לבחון את ההרכב ולקבוע את המבנה המשני המקומי בתוך המולקולה באמצעות פרמטרי החיפוש המוגדרים כברירת מחדל של תוכנית MolMol. מבנים משניים מוחזקים על ידי קשרי מימן ומציינים אזורים יציבים של המולקולה.
   1. קבע את המבנה המשני של כל קונפורמטור (איור 19).
      1. צור טבלה של אחוז הקונפורמרים של ההרכב המציג כל מבנה משני.
      2. קבע אם אזורי המבנה המשני חופפים את האזורים שנקבעו כאזורים היציבים על ידי מקומי-RMSD. זה קורה לעתים קרובות.
5. קבע מרחקים וקשרי מימן בתוך המולקולה.
   1. ייבא את האנסמבל ל-Chimera²⁴.
   2. השתמש בכימרה כדי לקבוע מרחקים תוך-מולקולריים בין אטומים החשודים כקשירת מתכת. חשב את המרחקים הממוצעים בהרכב.
   3. השתמש בכימרה כדי לקבוע קשרי מימן תוך-מולקולריים בכל קונפורמטור של ההרכב (איור 20), תוך שימוש בפרמטרי ברירת המחדל של קשרי מימן רגועים (ב-20%) של התוכנית.
   4. צור טבלה של אחוז הקונפורמרים של ההרכב המציג כל קשר מימן. קשרי מימן החוזרים על עצמם ברוב הקונפורמציות מצביעים על קשר יציב המוסיף ליציבות המבנה.
6. קבע אינטראקציות אלקטרוסטטיות בתוך המולקולה.
   1. זהה אינטראקציות בין שרשראות צד טעונות.
   2. צור טבלה של אחוז הקונפורמרים של ההרכב המציג כל אינטראקציה אלקטרוסטטית.
7. חשב את התפלגות הפוטנציאל האלקטרוסטטי באמצעות שדה הכוח Amber²⁵ בתוכנית Delphi²⁶.
   1. בחר קונפורמציה מייצגת אחת מהאנסמבל שעליה ניתן לבצע את חישובי הפוטנציאל האלקטרוסטטי.
   2. להפיק פוטנציאל אלקטרוסטטי באמצעות משוואת פואסון-בולצמן וחישוב קולומבי מלא. הפרמטרים הנדרשים כוללים את החוזק היוני של התמיסה, הערכים הדיאלקטריים של התמיסה (80 למים; 40 ל-DMSO); הפפטיד הפנימי (בדרך כלל בסביבות 5.0); גודל הגריד (בדרך כלל 65'65'65 נקודות); והמרחק המינימלי בין הפפטיד לקצה הרשת (10 Å). התוצאות בדרך כלל חזקות למדי ביחס לערכים אלה מכיוון שהתוצאה העיקרית נשלטת על ידי הפפטיד עצמו (איור 21).
   3. בחנו את הפוטנציאל האלקטרוסטטי הממופה על פני השטח של הפפטיד (איור 22).
   4. בחן את משטחי האיזו פוטנציאל האלקטרוסטטיים, המתארים מיקומים בעלי אותו פוטנציאל. מצא איזו-משטחים המרמזים על רלוונטיות ביולוגית, כגון משטחים חיוביים או שליליים מורחבים שעשויים למשוך או לדחות חלבונים או ליגנדים אחרים, או התפלגויות המצביעות על משמעות, כגון התפלגות אמפיפתית או טלאים בעלי תכונות שונות (איור 23).
8. סכם את כל הממצאים המבניים כדי לראות כיצד הם מחזקים זה את זה.
9. חזור על שלבים 4.3-5.7.4 כאשר רלוונטי.

Results

כחלק ממחקר מתמשך של מודלים של חלבונים קושרי נחושת, המבנה של הרצף השמור MT/HCXXC בתוך הפפטיד הליניארי MTCSGCSRPG נקבע על ידי NMR של מצב התמיסה. הפפטיד הגיב עם CuCl בסביבה אינרטית וה-pH נמדד כ-~3.0 על ידי מקל אוניברסלי. אזור האמיד של הפפטיד הראה התרחבות עם תגובה עם נחושת, מ-6.7-8.5 ל-6.6-9.0 ppm (איור 2). הרחבת קו עקב חמצון נחושת קל ניכרת בקו הבסיס.

דגימת הפפטיד שהגיב לנחושת הייתה יציבה עם הזמן (איור 7) והספקטרום נפתר היטב (איור 8) ונתן 81 אינטר...

Discussion

תרומתו של מידע מבני להבנת מנגנוני הקישור מקובלת היטב. פפטידים שימושיים כמודלים לקשירת חלבונים ואינטראקציות; עם זאת, הם אינם מתאימים לשיטה העיקרית לקביעת מבנה, קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. תמ"ג שימושי במיוחד עבור מערכות אלה, מכיוון שניתן לפתור את המבנים בקלות בתמיסה. זה במיוחד במקרה של חיקוי מטאלוצ'פרון הדורשים בנוסף קביעת מבנה בסביבה אינרטית כדי למנוע חמצון של יון המתכת.

פפטיד MTCSGCSRPG, המכיל את מוטיב MT/HCXXC המשומר, קשור ל-Cu (I) כפי שניכר בשינוי המשמעותי של הספקטרום מצורת האפו לפפטיד המגיב ע...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avance DMX 600 MHz ספקטרומטר	Bruker
NMR צינורות דגימה	Wilmad	535-PP
	MBraun	LM05-019
ליופילייזר	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	בהתאמה אישית	>95% טוהר
נחושת (1) כלוריד	Aldrich	224332
חומצה הידרוכלורית	BioLab	231-595-7
נתרן הידרוקסיד	גדות	1310-73-2
d6-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
תחמוצת דאוטריום	Aldrich	151882