תיקון: פרוטוקולים להכנת דגימות, דימוי ואנליזה עבור מיקרוסקופיית סריקה עם קצה-סכין (Knife-edge Scanning Microscopy)

סיכום

בוצע תיקון למאמר פרוטוקולים להכנת דגימות, דימות ואנליזה עבור מיקרוסקופיית סריקה בעלת קצה סכין (Knife-edge Scanning Microscopy). בוצעו שינויים חשובים בפרוטוקול לצביעת Nissl.

תקציר

בוצע תיקון למאמר Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. בוצעו שינויים חשובים בפרוטוקול לצביעת Nissl.

פרוטוקול

בוצע תיקון למאמר פרוטוקולים להכנת דגימות, דימוי ואנליזה עבור מיקרוסקופיית סריקה בעלת קצה סכין (Knife-edge Scanning Microscopy). פרוטוקול צביעת הניסל (Nissl staining) שונה מ-:

2. הכנת הדגימה: Nissl

1. את העכבר מרדימים הרדמה עמוקה באמצעות הזרקה תוך-בטנית של ketamine ו-xylazine, ולאחר מכן מבצעים פרפוזיה טרנס-קרדיאלית באמצעות 50 mL של phosphate-buffered saline (pH 7.4) בטמפרטורת החדר, ולאחריה 250 mL של 10% neutral buffered formalin (pH 7.4) בטמפרטורת החדר, ולבסוף 3.0 cc של דיו סיני (India ink) ללא דילול.
2. פרפוזיה של הגוף כולו עם תמיסת מלח וחומר מקבע נחוצה כדי לנקות את הדם ממערכת הלב והכלי הדם ולקבע את הרקמות. פרפוזיה עם דיו סיני נחוצה כדי למלא באופן מלא את כלי הדם של מערכת הלב והכלי הדם.
3. את המוח המתקבל מייבשים לאחר מכן באמצעות סדרה של אתנול בריכוזים מדורגים (25%{}-100%) ואז מטמיעים אותו בפלסטיק araldite לפי הפרוטוקול בסעיפים 1.8-1.9 לעיל. אם תוצר ההטמעה הוא LR white, יש לעקוב אחר הפרוטוקול בסעיף 1.10 לעיל.
4. את העכבר מרדימים הרדמה עמוקה באמצעות הזרקה תוך-בטנית של ketamine ו-xylazine, ולאחר מכן מבצעים פרפוזיה טרנס-קרדיאלית באמצעות 50 mL של phosphate-buffered saline (pH 7.4) בטמפרטורת החדר, ולאחריה 250 mL של 10% neutral buffered formalin (pH 7.4) בטמפרטורת החדר, ולבסוף 3.0 cc של דיו סיני (India ink) ללא דילול.
5. פרפוזיה של הגוף כולו עם תמיסת מלח וחומר מקבע נחוצה כדי לנקות את הדם ממערכת הלב והכלי הדם ולקבע את הרקמות. פרפוזיה עם דיו סיני נחוצה כדי למלא באופן מלא את כלי הדם של מערכת הלב והכלי הדם.
6. את המוח המתקבל מייבשים לאחר מכן באמצעות סדרה של אתנול בריכוזים מדורגים (25%{}-100%) ואז מטמיעים אותו בפלסטיק araldite לפי הפרוטוקול בסעיפים 1.8-1.9 לעיל. אם תוצר ההטמעה הוא LR white, יש לעקוב אחר הפרוטוקול בסעיף 1.10 לעיל.
7. את העכבר מרדימים הרדמה עמוקה באמצעות הזרקה תוך-בטנית של ketamine ו-xylazine, ולאחר מכן מבצעים פרפוזיה טרנס-קרדיאלית באמצעות 50 mL של phosphate-buffered saline (pH 7.4) בטמפרטורת החדר, ולאחריה 250 mL של 10% neutral buffered formalin (pH 7.4) בטמפרטורת החדר, ולבסוף 3.0 cc של דיו סיני (India ink) ללא דילול.
8. פרפוזיה של הגוף כולו עם תמיסת מלח וחומר מקבע נחוצה כדי לנקות את הדם ממערכת הלב והכלי הדם ולקבע את הרקמות. פרפוזיה עם דיו סיני נחוצה כדי למלא באופן מלא את כלי הדם של מערכת הלב והכלי הדם.
9. את המוח המתקבל מייבשים לאחר מכן באמצעות סדרה של אתנול בריכוזים מדורגים (25%{}-100%) ואז מטמיעים אותו בפלסטיק araldite לפי הפרוטוקול בסעיפים 1.8-1.9 לעיל. אם תוצר ההטמעה הוא LR white, יש לעקוב אחר הפרוטוקול בסעיף 1.10 לעיל.

אל:

2. הכנת דגימות: Nissl

1. פרוטוקול זה עוקב מקרוב אחר הפרוטוקול של Mayerich et al.⁷
2. העכבר עובר הרדמה עמוקה באמצעות הזרקה תוך-peritoneal של ketamine ו-xylazine, ולאחר מכן עובר פרפוזיה transcardially באמצעות 50 mL של phosphate-buffered saline בטמפרטורת החדר (pH 7.4), ולאחריה 250 mL של 4% phosphate-buffered paraformaldehyde קר (pH 7.4).
3. לאחר מכן העכבר עובר פרפוזיה עם 100 mL של תמיסת צבע thionin בריכוז 0.1% במים דאיוניים, והגוף מונח במקרר (4 °C) למשך 24 שעות.
4. לאחר 24 שעות, המוח מוצא מהגולגולת ומונח בתמיסה טרייה של 0.1% thionin ונשמר ב-4 °C למשך 7 ימים. משך הזמן הממושך של הליך זה נועד להבטיח חדירה מלאה של thionin אל תוך הדגימה הבלוקית (en bloc).
5. לאחר מכן המוח עובר הסרת צבע והתייבשות דרך סדרה מדורגת של אתנול, החל מ-50% אתנול ומים ועד ל-100% אתנול על פני תקופה של 6 שבועות. החלפות האתנול מ-50% עד 70% נשמרות במקרר (4 °C) וכל החלפות האתנול מעל 70% נשמרות בטמפרטורת החדר.
6. לאחר שלוש החלפות של אצטון (2-4 ימים בכל תמיסה בטמפרטורת החדר), המוח מוטמע בבلاست araldite בהתאם לפרוטוקול בסעיפים 1.8-1.9 לעיל. אם Medium ההטמעה הוא LR white, יש לעקוב אחר הפרוטוקול בסעיף 1.10 לעיל.