עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי Th17 הם תת קבוצה ברורה של תאי T שנמצא לייצר אינטרלוקין 17 (IL-17), ונבדלים בפונקציה מתת התא האחר T כולל Th1, Th2, ותאי T רגולטוריים. Th17 תאים צמחו כאשם מרכזי בתגובות חיסוניים דלקתיות נלהבים מדי קשורות עם הרבה הפרעות אוטואימוניות. בשיטה זו אנו מטהרים לימפוציטים מסוג T מבלוטות הלימפה של הטחול ועכברי C57BL / 6, ולעורר תאי CD4 + T מטוהרים תחת שליטה וסביבות Th17 וישכנע. הסביבה וישכנע Th17 כוללת גירוי בנוכחות נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28, IL-6, וTGF-β. לאחר דגירה לפחות 72 שעות ועד חמישה ימים על 37 מעלות צלזיוס, תאים מנותחים לאחר מכן ליכולת לייצר IL-17 באמצעות cytometry זרימה, qPCR, וELISAs. יכולים להיות מנוצלים על תאי CD4 + CD25-T Th17 המובחן כדי להבהיר את התפקיד שתאי Th17 לשחק בתחילת ההתקדמות של אוטואימוניות ודה מארח נוסףfense. יתר על כן, התמיינות Th17 של CD4 + CD25-לימפוציטים מדגמי נוקאאוט / מחלה עכבריות מובחנים יכולה לתרום להבנה של פלסטיות גורל תא שלנו.
מבוא
לימפוציטים מסוג CD4 + T (תאי T) לשחק תפקיד קריטי בהגנה בתיווך מערכת חיסון כנגד מיקרואורגניזמים מזהמים. לעומת זאת, תאי T גם קשר אינטימי עם תחילת ההתקדמות של מחלות אוטואימוניות כגון סוכרת מסוג 1, זאבת אדמנתית מערכתית, ודלקת מפרקים שגרונית. לימפוציטים מסוג CD4 + T להיות מופעלים באמצעות שילוב של קולטן תא T אינטראקציות (TCR) עם אנטיגן מאותו המקור / מורכב histocompatibility גדול השנייה מולקולות (MHCII), ואינטראקציות הקולטן CD28 עם B7.1/B7.2 ligands 15. בנוסף למתן גירוי TCR CD28 ושיתוף גירוי, תאי מציגי אנטיגן גם לספק סביבת ציטוקינים, הקובעת את מצב ההתמיינות של הלימפוציטים T, ובכך לכוון את התגובה של הלימפוציטים T לאנטיגן נתו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השימוש בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש.
1. הכנת תערובות ומדיה
- pH סטרילי PBS: 7.3 (1 ליטר)
0.23 גרם לאא 2 PO 4
1.15 גרם Na 2 HPO 4
9.0 גרם NaCl
קח את נפח עם מים די. לעקר עם החיטוי. - תא תרבות מדיה (100 מיליליטר)
89 RPMI מיליליטר
10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול הבחנה זו Th17 מתחיל עם ההסרה של הטחול ובית השחי, זרוע, mesenteric, צוואר הרחם, ובלוטות לימפה מפשעתי. ניתן למצוא ייצוג של המיקומים של כל אחד באיורים 2 ו -3. איורים 1 ו 5 שניהם מספקים ייצוג חזותי של השיטות שתוארו בפרוטוקול זה.
פרוטוקול Th17 זה מתמקד בבידול מאוכלוסיית הלימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T. חשוב לציין באיזו יעילות הפרדת תא Pro autoMACS מעשירה CD4 הר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן יש לנו תיארתי את הפרוטוקול כדי להשיג בידול Th17 במבחנה. המחקר של בידול Th17 חשוב, כמו בידול של T לימפוציטים מסוג למשנה Th17 הוא קריטי לחיסול היעיל של פתוגנים אנושיים 13. לעומת זאת, ייצור IL17 נקשר עם התקדמות מחלה אוטואימונית 13. השיטה של בידול Th17 ישימה להגדרות מחקר רבות כפי שהוא יכול להיות מיושם על מודלים עכבריים מובהקים רבים של רגולציה ואוטואימוניות חיסונית. שיטה זו מסייעת לענות על שאלות בנוגע ליכולתם של לימפוציטים מסוג T, להתמיין לתא Th17, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין גילויים להכריז.
תודות
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי פרסים NIH / NCATS הקליני וTranslational המדע לאוניברסיטת פלורידה TL1 TR000066 וUL1 TR000064, תוספת גיוון מההורה גרנט R01AI056152 מהמכון הלאומי לבריאות, מענק מגיב BD Biosciences, ואת האוניברסיטה פלורידה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>מגיב / חומר< / חזק> | |||
| סטרילי פוליאסטרן פטרי צלחת פישר | סיינטיפיק | 0875713A | 60 מ"מ x 15 מ"מ |
| autoMACS מאגר ריצה | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| שקופיות מיקרוסקופ פרימיום, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1" 1 מ"מ |
| 5 מ"ל 21G1 מזרק ומחט ללא לטקס | BD Biosciences | 309632 | |
| קורנינג 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה | סיגמא-אולדריץ' | CLS430791 | |
| ניילון 40 מיקרון | מיאמי חקלאות ימית | ניילון 40/26 | |
| צלחת תרבית רקמות מיקרו-טסט 96 באר U תחתון | BD Biosciences | 35-3077 | |
| קורנינג קוסטאר 24 באר צלחות תרבית תאים | סיגמא-אולדריץ' | CL3524 | |
| שפופרות אפנדורף 1.5 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 05-408-129 | |
| אוגר מטוהר NA/LE נגד עכבר CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| אוגר מטוהר NA/LE נגד עכבר CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| עכבר IL-6 חלבון רקומביננטי | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R& D Systems | 240-B-002 | |
| תמיסה כחולה טריפאן 0.4 | סיגמא-אולדריץ' | 66H2364 | |
| Pac חולדה כחולה נגד עכבר CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC חולדה נגד עכבר CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE מצומד נגד עכבר CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-Mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| ערכת התחלה לצביעה ציטוקינים תוך תאיים-עכבר | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ ערכת בידוד תאי T רגולטורית, עכבר | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt– טנול | MP ביו-רפואי | 194834 | מסוכן |
| פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) | |||
| יונומיצין מלח סידן | סיגמא-אולדריץ' | 13909-1ML | מסוכן |
| ברפלדין A (BFA) | MP ביו-רפואי | 159027 | |
| ELISA IL-17A לכידת מ-Ab | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A זיהוי mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A תקן | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ צנטריפוגה | ThermoScientific | ||
| סדרת Napco 8000 WJ CO2 חממה | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal | Cycler Biorad |
מקורות
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
