מאמר שיטה

אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום: שיטה יעילה לאיתור וזיהוי סוגי תאי אב במהלך נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים

DOI:

10.3791/50769

⸱

30 באוגוסט 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך נוירוגנזה של היפוקמפוס במבוגרים, קבוצה מובחנת של סמנים גנטיים מתבטאת כאשר תא גזע עצבי שקט מתקדם ברצף ומתפתח לנוירון משולב תפקודית במעגל. באמצעות אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום, סוגי תאי אב שאחרת קשה לזהות מזוהים עם יעילות משופרת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מסורתיות של אימונוהיסטוכימיה (IHC) לאחר קיבוע רקמות מאפשרות הדמיה של סוגי תאים שונים. אלה ממשיכים בדרך כלל ביישום נוגדנים לקשירת אנטיגנים וזיהוי תאים בעלי מאפיינים שהם פונקציה של הביולוגיה וההתפתחות הטבועים. נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגרים היא תהליך רציף שבו תא גזע עצבי שקט יכול להיות מופעל ולהתקדם בשלבים של התפשטות, התמיינות, התבגרות ואינטגרציה תפקודית. כל שלב נבדל עם מורפולוגיה אופיינית וויסות של גנים. זיהוי שלבים אלה חשוב כדי להבין את מנגנוני הרגולציה הפועלים וכל שינוי בתהליך זה העומד בבסיס הפתופיזיולוגיה של הפרעות מתישות. גישת אחזור האנטיגן המושרה בחום שלנו משפרת את עוצמת האות שמזוהה ומאפשרת זיהוי נכון של סוג תא האב. כפי שנדון במאמר זה, זה מאפשר לנו במיוחד לעקוף את הבעיות הנוכחיות בזיהוי סוגים מסוימים של תאי אב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירוגנזה, יצירת נוירונים חדשים מתאי גזע עצביים, ידועה כיום כמתרחשת באופן קבוע בבגרות בשני אזורים מיוחדים במוח. אלה כוללים את האזור התת-חדרי (SVZ) של פקעת הריח ואת האזור התת-גרגירי (SGZ) של הבליטה המשוננת בהיפוקמפוס. במהלך העשור האחרון, תחום הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס למבוגרים ראה עבודה משמעותית. האזור משך עניין רב מכיוון שתאי עצב שזה עתה נולדו ב-SGZ תורמים לגמישות עצבית משופרת שיכולה לקיים תפקודי מוח ספציפיים1-5. נוירוגנזה של היפוקמפוס במבוגרים מעורבת כממלאת תפקידים חשובים בוויסות מצב הרוח, התחדשות ולמידה וזיכרון. לפיכך, נעשה מאמץ מרוכז להבין את ההתפתחות והוויסות של נוירונים בנישה נוירוגנית עשירה זו.

היבט בלתי נמנע וחשוב בחקר נוירוגנזה בהיפוקמפוס במבוגרים הוא זיהוי שלבים נפרדים שתא גזע עצבי מופעל עובר בדרכו להפוך לתא עצב מתפקד לחלוטין. בתהליך זה, תא הגזע העצבי השקט מופעל וממשיך דרך סדרה של סוגי תאי אב פעילים מוקדמים ופעילים מאוחרים (איור 1). ניתן לזהות אוכלוסיות מובחנות אלה של אבות עצביים על ידי מורפולוגיה וביטוין של סמנים מולקולריים כגון MCM2, nestin, Tbr2 ו-Doublecortin (DCX) ו-NeuN המנחים את ההמרה של RGLs לסוגי תאי האב שלהם. נסטין הוא חלבון נימה ביניים המתבטא על פני תאים דמויי גליה רדיאליים וכמה סוגי תאי אב מוקדמים. סמן נוסף הוא Tbr2 המתבטא באופן ספציפי בתאי האב המגבירים. ביטוי הטרנסגן Tbr2 כבוי בתחילה בתאי Type-1 (דמויי גליה רדיאלית), מופעל על פני אבות Type-2a, Type-2ab ו-Type-2b ונכבה בין תאי העצב Type-3 והלא בשלים המובחנים יותר (איור 1). DCX הוא סמן נדידה עצבי המתבטא באבות העצביים Type-2ab, Type-2b ו-Type-3. באמצעות שילוב זה של שלושה סמנים, אנו יכולים לסמן תת-סוגים שונים של אבות עצביים. אלה כוללים את Type-1 (MCM2+nestin+Tbr2-), Type-2a (MCM2+nestin+Tbr2+), Type-2ab (חלקי MCM2+nestin-Tbr2+ וחלקי MCM2+Tbr2+DCX-), Type-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) ו-Type-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). ניתן לזהות תאים פוסט-מיטוטיים כגון הנוירונים הלא בשלים והמשולבים מבחינה תפקודית על ידי שימוש ב-DCX ובסמן העצבי הבוגר, NeuN.

שיטות מסורתיות של IHC משתמשות בנוגדנים כדי לזהות אנטיגנים לסוגי תאים ספציפיים על סמך ביטוי הגנים שלהם. ניתן להשתמש בהדמיה שלאחר מכן באמצעות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית לזיהויים. עם זאת, כיום קיימות בעיות בשיטות אלה שאינן מאפשרות זיהוי יעיל של התאים דמויי הגליה הרדיאלים וסוגי תאי האב המוקדמים. קשה לזהות את סוגי התאים הספציפיים הללו מכיוון שהנוגדן המופעל אינו מסוגל לחדור ולקשור ביעילות את חלבון הנסטין . נסטין הוא חלבון נימה ביניים המרכיב את התהליכים הרדיאליים המיוצרים על ידי התא דמוי גליה רדיאלי. הקישור הלא יעיל של נוגדן לאנטיגן יכול להיות תוצאה של גורמים רבים כולל זמן קיבוע, טמפרטורה וטכניקה בשימוש6-7. כדי לעזור לפתור בעיות כאלה, פיתחנו שיטת אחזור אנטיגן או "הרתחה". מלבד נסטין, שיטה זו של אחזור אנטיגן משפרת גם את הצביעה עבור סמנים אחרים כגון Ki67, BrdU, חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP), Tbr2 ו-MCM2. השיטה שלנו משלבת יחד גישות כימיות ופיזיקליות. זה כרוך בקיבוע כימי של הרקמה בפרפורמלדהיד ולאחר מכן רתיחה בטמפרטורה גבוהה של קטעי היפוקמפוס עטרה דקים במאגר של דנטורנט וטיפול כאוטרופי. זה משפר את הנגישות של האנטיגן לנוגדן, משפר את ספציפיות הנוגדנים ומאפשר זיהוי משופר של סוגי תאי אב. הגישה שלנו פשוטה לשימוש ודורשת בעיקר כלים וריאגנטים שכבר זמינים במעבדה. השתמשנו בו באופן נרחב כדי לחקור את ההתפתחות של תאי גזע עצביים ואת הוויסות שלהם באמצעות גורמים סביבתיים גנטיים או חיצונייםפנימיים 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פרה-אימונוהיסטוכימיה: זלוף והיסטולוגיה

  1. השתמש בעכברים לפי פרוטוקול טרנס-קרדיאלי כללי המותאם לעכברים וחלץ את המוח ל-4% פרפורמלדהיד (PFA)9.
  2. השאירו את המוח ב-PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (למשל צינור חרוטי של 10 מ"ל מלא ב-PFA). יש לשמור ב-PFA למשך 12-24 שעות לפחות, לא יותר מ-36 שעות לקיבוע מלא. לאחר קיבוע לילה, רוקנו את ה-PFA מהצינור החרוטי אך השאירו את המוח בפנים. יוצקים 30% סוכרוז לתוך הצינור ושוטפים את המוח למשך 5 שניות קצרות כדי להסיר שאריות PFA. לבסוף, מלאו שוב שפופרת המכילה מוחות עם 30% סוכרוז. שמור את המוח בסוכרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור.
  3. חותכים קטעי מוח של 40 מיקרומטר על מיקרוטום. התייעץ עם אטלס מוח של עכבר כדי להתחיל לאסוף קטעים מתחילת הבליטה המשוננת ועד סופה. שמרו קטעים בתמיסה נגד הקפאה (מתכון פשוט הוא 300 גרם סוכרוז ב 500 מ"ל, 0.1 M PBS ו -300 מ"ל אתילן גליקול) עד שהם מוכנים לאימונוהיסטוכימיה.
  4. הרכיבו את הרקמה החתוכה על שקופיות מיקרוסקופ שתוכננו במיוחד כדי להיצמד חזק לרקמה. שקופיות אלו מספקות אחיזה חזקה לרקמות בשלב הרתיחה. לאחר הרכבת הטישו, נא לתת לשקופית להתייבש למשך 10 דקות או עד שהיא יבשה לחלוטין. ניתן לזרז את הייבוש אם המגלשה מונחת על משטח אנכי כשהקצה התחתון של המגלשה מונח על מגבת נייר. אם מותקנת יותר משקופית אחת, ניתן להשאיר את השקופיות האחרות יבשות במהלך תקופה זו (1-2 שעות זה בסדר) עד שיהיו מוכנות להמשיך לשלב הבא.
  5. לאחר שהשקופית יבשה, יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת ולייבש שוב (PBS buffer = 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.0119 M Na2PO4). זה מבטיח שכל כימיקל קודם (כגון גליצרול מתמיסת אחסון נגד הקפאה) מוסר מספיק ואינו יכול לפגוע בדבקות הרקמה בשקופית.

2. הכנת ריאגנטים וציוד קל

  1. הכן תמיסה A (0.1 M או 19.21 גרם / ליטר חומצת לימון) ותמיסה B (0.1 M או 24.9 גרם / ליטר tris-sodium citrate) בה ירתחו קטעי רקמה.
  2. בצילינדר מדורג, שלבו 9 מ"ל של תמיסה A ו-41 מ"ל של תמיסה B. הוסיפו 450 מ"ל של ddH2O לתערובת זו.
  3. יוצקים את התערובת הזו למיכל ריק (למשל קופסת קצות פיפטה ריקה) הבטוח לשימוש במיקרוגל.

3. אחזור אנטיגן המושרה על ידי חום

  1. מרתיחים תמיסה המיוצרת בשלב 2 למשך 5 דקות בהגדרה סטנדרטית במיקרוגל רגיל. התמיסה תתחיל לרתוח בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומעלה.
  2. לאחר השלמת הרתיחה, הוציאו בזהירות את המיכל מהמיקרוגל והניחו לתוכו שקופיות מיובשות, וודאו שפני המגלשה עם חלקי ההיפוקמפוס פונים כלפי מטה וחשופים לחלוטין לנוזל. במידת האפשר, הניחו שקופיות בזווית כנגד קירות הקופסה וערמו סביבן שקופיות אחרות. ודא שה"התאמה" שלהם בתוך הקופסה הדוקה כך שלמגלשות לא יהיה מקום לנוע זו על גבי זו.
  3. מרתיחים את התערובת הזו עם שקופיות במשך 7 דקות בהגדרות סטנדרטיות במיקרוגל. התמיסה תרתח במהלך תקופה זו בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומעלה.
  4. בשלב הרתיחה הזה, מלאו שני דליי קרח באמצע הדרך בקרח.
  5. לאחר השלמת הרתיחה בשלב 3.3, הוציאו את המיכל מהמיקרוגל והניחו אותו בתוך אחד מדלי הקרח. יוצקים את שאר הקרח מהדלי השני מסביב למיכל ומכסים אותו לחלוטין. תן לזה לשבת שעה.

4. צביעת נוגדנים ראשונית ומשנית

  1. בתום תקופת ההמתנה של שעה, הוציאו את השקופיות מהמיכל ושטפו עם מאגר TBS-T 3x למשך 5 דקות כל אחת. ניתן להשתמש בכל מכשיר לביצוע שטיפות בסיסיות אלה. (מאגר TBS = 50 מ"מ Tris HCl, 150 מ"מ NaCl, TBS-T = 0.05% מאגר Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% מאגר TBS-T בסרום חמור).
  2. לאחר הכביסה, הניחו לשקופיות להתייבש במקום חשוך (למשל בתוך מגירת ספסל, הניחו מגבת נייר בתוך המגירה והטו את המגלשה אליה) למשך 5-10 דקות או עד שהמגלשה יבשה לחלוטין. במהלך תקופה זו, הכינו תא לצביעת נוגדנים ראשונית למשך הלילה. תא מכתים פשוט עשוי לכלול מיכל עם שטח פנים גדול מלא ב-ddH2O ו-stage בתוך המיכל, שעליו ניתן להניח את המגלשה מעל ddH2O.
  3. לאחר שהמגלשה התייבשה, צייר קו מתאר סביב חלקי הרקמה באמצעות עט דוחה מים. במהלך שלב 4.5, מתווה זה משמש כמחסום המונע מתערובת הנוגדנים לזרום.
  4. הכן את תערובת הנוגדנים העיקרית ב-TBS-TT. לפחות 500 מיקרוליטר נדרשים כדי לכסות שקופית שלמה אחת, למשל, אם מלאי הנוגדנים הוא בריכוז של 1:500, הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן מסוים ל-500 מיקרוליטר של TBS-TT). השתמש בנוגדנים ראשוניים כאמור בטבלת הריאגנטים.
  5. הנח את השקופית המיובשת על גבי הבמה בתא הצביעה. הוסף 500 מיקרוליטר מהנוגדנים העיקריים לאט וכסה את כל פני השטח. מכסים את כל המכשיר ועוטפים בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור החיצוני. תן לזה לשבת לילה בטמפרטורת החדר.
  6. למחרת, שטפו את המגלשה שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם מאגר TBS-T. הניחו לו להתייבש באזור חשוך כמתואר בשלב 4.2.
  7. הכן תערובת נוגדנים משנית בדומה לשלב 4.4. עיין בטבלת הריאגנטים לנוגדנים משניים.
  8. הנח את השקופית המיובשת בתא הצביעה כמתואר בשלבים 4.2 ו-4.5. הוסף 500 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים לאט וכסה את כל פני השטח. עטפו את תא הצביעה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור חיצוני. הניחו לו לשבת מכוסה ומוגן מפני אור חיצוני למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.
  9. לאחר השלמת הצביעה המשנית, שטפו את השקופית שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם מאגר TBS-T. תן לשקופית להתייבש באזור חשוך. לאחר הייבוש, הניחו תמיסת הרכבה וכסו את השקופית בהחלקת כיסוי בזהירות ומונעים הכנסת בועות. תן לשקופית לשבת באזור חשוך לפחות שעתיים לפני הניתוח הבא.
  10. בצע ניתוח זמן-lapse או קונפוקלי על הרקמה המוכתמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירוגנזה בהיפוקמפוס של מבוגרים היא תהליך רצפי שבו ניתן לזהות את סוג תא המוצא המייצג בכל שלב באמצעות שילוב של סממנים. קיבוע כימי קפדני ושחזור אנטיגנים משפרים את היעילות והנגישות של סממנים שקשה לזהותם בדרך אחרת. אחד מאלו הוא nestin, המבטא בקרב תאי גזע עצביים דמויי גליא רדיאלית וכמה מסוגי תאי מוצא פעילים מוקדמים. Nestin עשוי להיות חלבון מפתח בזיהוי סוגי תאי מוצא מוקדמים, שכן ביטויו אובד כאשר תא הגזע או תא המוצא מבצעים לאחר מכן התמיינות לנוירון בוגר.

דיאגרמה סכמטית של התהליך הרצפי של נוירוגנזה בה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר לאחזור אנטיגן וצביעה מוצלחת של סוגי תאי אב הם: 1) שימוש ברקמה מקובעת היטב בעובי העטרה האופטימלי; 2) מתן זמן מספיק לרתיחה ולקירור לאחר מכן במהלך שליפת האנטיגן; 3) מיומנות ידנית בהרכבת קטעי קורונל קבועים ומניעת נזקם בעת ביצוע פעולה זו.

זה קריטי ב-IHC להשתמש ברקמה מוחדרת שעברה קיבוע מספיק אך לא קיבוע יתר. קושי עיקרי יכול להיות חוסר הנגישות של האנטיגן לנוגדן. השיטה שלנו נועדה לשפר את הנגישות. החדרה נכונה של החיה במהלך הניתוח וקיבוע לאחר מכן חיונית כצעד ראשון. בפרוטוקול שלנו, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתודולוגיה פותחה במקור במעבדתו של ד"ר הונגג'ון סונג במכון להנדסת תאים, המחלקה לנוירולוגיה, בית הספר לרפואה של ג'ונס הופקינס. עבודה זו מומנה על ידי NIMH (R00MH090115), NARSAD, קרן מחקר הסרטן של מאיו של מסדר האחווה של הנשרים וחבילת סטארט-אפ מקרן מאיו שהוענקה ל-M.H.J. ולתוכנית המחקר המדעי הבסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (A3014385) שהוענקה ל-W.R.K.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
SuperFrost Plus SlideFisherbrand12-550-15מספק היצמדות חזקה לרקמת ההיפוקמפוס במהלך הרתיחה
PVA/DABCO מדיה הרכבהסיגמא אולדריץ'10981-100 מ"ל
נסטין (עוף) Aves LabNESסמן תאי גזע עצביים
GFAP (ארנב)Dako צפון אמריקהZ033401-2אסטרוציטים וסמן תאי גזע עצביים
MCM2 (עכבר)מעבדת התמרה BD610701סמן התפשטות
DCX (עז)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC8066סמן נוירונים לא בוגר
Tbr2 (ארנב)AbcamAb23345סמן אב מגביר
NeuN (עכבר)MilliporeMAB377סמן נוירונים בוגר
Cy2 (נגד ארנב)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2 (נגד עוף)Jackson Immunoresearch303-165-006
Cy5 (נגד עכברים)Jackson Immunoresearch315-175-047
Cy5 (נגד עז)Jackson Immunoresearch305-165-047
DAPILife Technologies CorporationD1306
Dako PenS2002Dakoעט דוחה מים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  10. Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system. FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).
  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים