הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Summary

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

Abstract

מאמצים כבר התמקדו בפיתוח במבחני חוץ גופית ללימוד microvessels משום in vivo מחקרים בבעלי החיים נמצאים זמן רב יותר, יקר, ותצפית וכימות הם מאוד מאתגרים. עם זאת, יש לי קונבנציונלי במבחני microvessel מבחנה מגבלות כאשר מייצגים in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה תלת ממדי (3D) ומתן זרימת נוזל רציף. באמצעות שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה, פיתחנו endothelialized חתך עגול רב מעמיק microchannels-on-a-chip, אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זלוף הרציף המבוקר זרימה. Photoresist reflowable חיובי שימש לפברק עובש הורים עם רשת microchannel חתך חצי עגולה. על ידי היישור והמליטה של ​​שני polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated מעובש האב, רשת microchannel גלילית נוצרה. בקטרים ​​של microchannels יכולים להיות מבוקרים היטב. בנוסף לכך, תאים ראשוניים אדם טבור וריד אנדותל (HUVECs) נזרעו בתוך השבב הראו כי התאים מרופדים משטח הפנימי של microchannels תחת זלוף המבוקר שנמשך פרק זמן בין 4 ימים ועד 2 שבועות.

Introduction

Microvessels, כחלק ממערכת מחזור הדם, לתווך האינטראקציות בין דם וברקמות, תומך בפעילות המטבולית, להגדיר microenvironment רקמות, ולשחק תפקיד קריטי במצבים פתולוגיים רבות ובריאות. שחזור של microvessels תפקודי במבחנה יכול לספק פלטפורמה למחקר של תופעות כלי דם מורכבות. עם זאת, מקובל במבחני microvessel מבחנה, כגון מבחני נדידת תאי אנדותל, מבחני היווצרות צינור אנדותל, מבחני טבעת אבי העורקים חולדה ועכבר, לא מצליחין לשחזר את in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה (3D) תלת ממדים ובקרת זרימה רציפה ^1-8. מחקרים של microvessels באמצעות מודלים של בעלי חיים ובמבחני vivo, כגון assay אנגיוגנזה בקרנית, assay אנגיוגנזה קרום chorioallantoic אפרוח, וassay תקע Matrigel, הם יותר גוזלים זמן, גבוהים בעלות, מאתגרים ביחס להתבוננות וquantifications, ולהעלות סוגיות אתיות ^{1, 9-13.}

התקדמות בmicromanufacturing וטכנולוגיות שבב microfluidic אפשרה מגוון של תובנות המדעים ביו תוך צמצום העלויות והמורכבויות הניסיוניות הגבוהות הקשורות בבעלי חיים ובvivo ¹⁴ מחקרים, כגון תנאים ביולוגיים לשלוט בקלות ובאופן הדוק וסביבות fluidic דינמיות, שלא היה היה אפשרי עם טכניקות macroscale קונבנציונליות.

כאן, אנו מציגים גישה לבנות endothelialized microchannels-on-a-chip אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת על ידי שימוש בשילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה.

Protocol

1. ייצור photolithography של עובש מאסטר Photoresist

הפרוטוקול הבא מציג את התהליך לפברק את microchannels עם קטרים ​​בין 30-60 מיקרומטר. כדי לקבל microchannel בקוטר קטן (פחות מ 30 מיקרומטר), ציפוי ספין יחיד של photoresist יש צורך.

1. העבר photoresist הזרמה מחדש מהמקרר ב 4 מעלות צלזיוס לחדר הנקיה 24 שעות לפני השימוש ולאפשר לו להתחמם לטמפרטורת חדר.
2. יש לנקות את פרוסות סיליקון ולאפות אותו במשך שעה אחת בכל 150 ° C כדי לאפשר לו להתייבש. ההתייבשות תסייע להידבקות photoresist מצע סיליקון.
3. ספין מעיל השכבה הראשונה של photoresist באמצעות המתכון הבא:

שלב	זמן (שניות)	מהירות (סל"ד)	ההאצה
1	2	300	הגבוה ביותר
2	10	0
3	3	300	הגבוה ביותר
4	60	600	הגבוה ביותר
5	10	500	הגבוה ביותר
6	10	600	הגבוה ביותר

4. ואז, לאפות את רקיק על פלטה חמה עם טמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר לאפות הרכה בעובי של photoresist יהיה 20-30 מיקרומטר.
5. ספין מעיל שכבה שנייה של photoresist בעקבות אותו המתכון המשמש לשכבה הראשונה.
6. לאפות רך רקיק שוב על ידי הצבתו על פלטה חמה עם טמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר לאפות רך זה העובי של photoresist יהיה 40-60 מיקרומטר.
7. ליצור דפוסי אב חיוביים על ידי חשיפת photoresist לאור UV עם מינון חשיפה של 14,500 mJ / ² ס"מ באמצעות מסכת סרט.
8. לדלל את היזם עם מים (DI) deionized (1:2 (V / V)). שוטפים את פרוסות שוב ושוב בפתרון עד שהדפוס הוא מפותח. לאחר מכן לשטוף עם מים די רקיק ולייבש אותו באמצעות גז חנקן.
9. הזרמה מחדש: הנח את פרוסות על פלטה חמה עם טמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ומכסים בצלחת פטרי זכוכית כדי למנוע אידוי ממס. הסר את רקיק מהפלטה החמה ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת חדר. עובי photoresist לאחר הזרמה מחדש יהיה 50-60 מיקרומטר.

2. ייצור יתוגרפיה רך של רשת microchannel PDMS

1. הכן את פתרון polydimethylsiloxane (PDMS) במשקל היחס של 10:1 (בסיס: סוכן ריפוי) ולערבב אותו ביסודיות בעזרת מערבל צנטריפוגלי פלנטרית.
2. להטיל את פתרון PDMS על תבנית המאסטר photoresist הוזרם מחדש. הנח את PDMS casted בייבוש למשך 15 דקות לדגה. השתמש בגז חנקן כדי להסיר כל בועות שנותרו במידת צורך.
3. אופים בתנור PDMS בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות כדי לאפשר לו לרפא. ואז להסיר את שכבת PDMS נרפא מעובש האב.
4. השתמש אגרופן חידד ליצור חורי כניסה / יציאה על ידי ניקוב חורים ברשת הערוץ. נקה את פני השטח של PDMS שימוש בגז חנקן.
5. טיפול בשתי שכבות PDMS עם פלזמה חמצן במשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה בלחץ הפעלה של טור 4.5 x 10 ^-2 וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל ³ / דקה. לאחר מכן, ליישר את פני השטח של PDMS ידני תחת מיקרוסקופ אופטי. השתמש בטיפת מים במידת צורך לשליטה טובה יותר ביישור.
6. אופים את המכשיר בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשיג מליטה קבועה.

3. תרבות HUVEC וזריעה בצ'יפ

1. תרבות HUVECs עם מדיום התרבות עם L-גלוטמין בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). עבור הקטעי ניסוי דואר בין 2 ל 5 היו בשימוש.
2. ברגע שהם HUVECs מחוברות, לספור את התאים ולקצור אותם על ידי השטיפה הראשונה את התאים עם HEPES נאגר תמיסת מלח (HEPES-BSS), ולאחר מכן טיפול בתאים עם טריפסין / EDTA דגירה של 2-6 דקות על 37 ° C. לאחר trypsinization הושלם, לנטרל את טריפסין / EDTA עם פתרון נטרול טריפסין. צנטריפוגה ולהשעות את התאים במדיום התרבות עם 8% dextran כדי לאסוף אותם. Dextran שימש כדי להגדיל את הצמיגות בינונית כדי לסייע בזריעת תאים טובה יותר וקובץ מצורף.
3. פנק את המכשיר עם פלזמה חמצן במשך 5 דקות עם לחץ הפעלה של 10 ^-2 טור x 4.5 וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל ³ / דקה. ואז לטעון את המכשיר עם מים די ולטפל עם אור UV במשך 8 שעות בבטיחות ביולוגית ברדס למינרית לעיקור.
4. יום אחד לפני שהתאים מוכנים, לשטוף את המכשיר עם 1x בופר פוספט (1x PBS) ולאחר מכן עם מעיל פיברונקטין (100 מיקרוגרם / מ"ל, דילuted עם 1x PBS) ודגירה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. לאחר ציפוי פיברונקטין, לשטוף את המכשיר עם 1x PBS לאחר מכן לטעון עם מדיום לתרבות. דגירה את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
6. לטעון את תאי HUVEC ב8% מדיום תרבות dextran עם ריכוז תא של 3-4 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. מקום טיפת μl 20 של תאים בכניסה לאחד את המכשיר ולהטות אותו כדי להציג את התאים לתוך ערוץ microfluidic. לאחר 15-20 דקות התאים יתחילו לצרף את הקירות הצדדיים של הערוצים. לסובב את המכשיר כל 15 דקות כדי ליצור התפלגות אחידה יותר של תאים. במידת צורך, ניתן לבצע טעינה נוספת.

4. התקנת זלוף לטווח ארוך

לאחר 5-6 שעות של תרבות סטטי, את HUVECs המצורף יתחיל להתפזר באופן מלא. הגדר זלוף באמצעות מערכת משאבת מזרק נשלט מרחוק עם זרם קבוע של 10 μl / שעה. זלוף יכול להיות מותאם Fאו שיעור גבוה יותר זרימה, ויכול להימשך פרק זמן שבין 4 ימים לשבועות 2.

5. מכתים תא ואפיון מיקרוסקופ

1. כאשר התאים מגיעים למפגש בתוך המכשיר, ראשית, לשטוף את המכשיר עם 1x PBS להסיר את המדיום באופן יסודי. ואז לטעון את המכשיר עם צבע אדום מדוללים עם מדלל (4 μl-1 מ"ל). טען את הצבע הדומה להליך טוען תא. דגירה את המכשיר בחושך במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף את המכשיר עם התרבות בינונית כדי לעצור את הכתמים. דגירה ארוכה של הצבע יכולה לגרום לרעילות וdisadhesion סלולריות.
2. טען את המכשיר בצבע כחול מדוללים עם 1x PBS (2 טיפות לכל מ"ל). דגירה בחושך במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף ביסודיות את המכשיר עם 1x PBS.
3. לבחון את מכתים התא תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך. אם הכתמים היו טובים, לטעון את microchannels עם מדיום קיבוע (3.5% בדילול paraformaldehyde עם 1x PBS), ואז לצלולהמכשיר בתיקון בינוני ולכסות אותו לחלוטין עם רדיד אלומיניום. אחסן את המכשיר במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע את המכשיר מהתייבשות וphotobleaching. המכשיר הקבוע מוכן כעת להדמית confocal, אשר יכול להיעשות על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal.

Results

הגישה שלנו לפברק רשת microchannel רב מעמיקה מחקה את גיאומטריות 3D המורכבות של in vivo microvessels, שבו יש לי microchannels מעוגל חתכים ^15. בנוסף, בקטרים ​​של ערוצי הסתעפות הוריים ובת הערוצים כ לציית לחוק של מוריי לשמירה על זרימת הנוזל ברמה נדרשת, כך שהתנגדות הערוץ הכללית היא נמוכה, ומהירויות זרימה יותר אחידות בכל הרשת ^16-18. התהליכים והתוצאות עבור הייצור של עובש אב photoresist חצי עגול ורשת PDMS חתך עגולה microchannel הודגמו בסרט 1, איור 2, ...

Discussion

1. ייצור עובש מאסטר

אחד העקרונות המנחים את עיצוב ולmorphometry כלי דם ידוע כדין של מוריי ^16, שבו נקבע כי חלוקת קטרי כלי ברחבי הרשת נשלטת על ידי שיקול מינימום אנרגיה. גם הוא קובע כי הקובייה של הקטרים ​​של כלי הורה בהסתעפות שווה לסכום את הקוביות של הקטרים ​​של בת כלי (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>מגיב / חומר< / חזק>
Reflow פוטו-רזיסט	AZ חומרים אלקטרוניים	מפתח AZP4620
	AZ חומרים אלקטרוניים AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 תרבות בינונית	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 ו-PKH26GL
Fibronectin	Gibco
	Sigma	G7513
פוספט חוצץ מי מלח	Invitrogen	14040-133
HEPES תמיסת מלח חוצצת	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
תמיסת נטרול טריפסין	Lonza	CC-5002
PDMS סוכן ריפוי	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
תאי אנדותל ראשוניים של וריד הטבור	האנושי Lonza	CC-2517
סרום בקר עוברי	Lonza	14-501F
מדלל C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, בדיקות מולקולריות	R37605
Dextran	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
<חזק>ציוד
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ LITE
Desiccator	BelArt מוצרים	999320237
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	Eclipse Ti
מערכת משאבת מזרק	הרווארד	אולטרה
למינארי	Thermo Scientific	1300 סדרה A2
מיקסר צנטריפוגלי פלנטרי	Thinky	ARE-310
תנור איזוטמפ	פישר מדעי	13-246-516GAQ
מיקרוסקופ אופטי	Zeiss	Invertoskop 40C
מנקה פלזמה	האריק פלזמה	PDC-32G
פלטה חמה	Barnstead / Thermolyne Cimarec	SP131635
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss	LSM 510