מאמר שיטה

זיהוי אוכלוסיות נוירונים חושיים ספציפיים לחקר תעלות יונים מבוטאות

DOI:

10.3791/50782

⸱

24 בדצמבר 2013

 ,  , 
1Baker Laboratory of Pharmacology, Department of Pharmacology, Kirksville College of Osteopathic Medicine, AT Still University of Health Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים חושיים מאותתים מידע חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית. זיהוי נוירונים אפרנטיים ספציפיים יעזור בהבנת הפיזיולוגיה שלהם. אנו מתארים שיטה של תיוג לאחור לזיהוי נוירונים אפרנטיים, וחוקרים את תעלות היונים עם שער המתח בתאי עצב אלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוציטוכימיה של מהדק טלאי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים חושיים מעבירים אותות מחלקים שונים בגוף למערכת העצבים המרכזית. הסומה של נוירונים אלה ממוקמת בגרעיני השורש הגבי המרפדים את עמוד השדרה. הבנת הקולטנים והערוצים המתבטאים על ידי נוירונים חושיים אלה יכולה להוביל לטיפולים חדשים למחלות. השלב הראשוני הוא לזהות את תת-הקבוצה הספציפית של נוירונים חושיים מעניינים. כאן אנו מתארים שיטה לזיהוי נוירונים אפרנטיים המעצבבים את השרירים על ידי תיוג לאחור באמצעות צבע פלואורסצנטי DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate). הבנת התרומה של תעלות יונים לעירור של מוליכי שרירים יכולה לעזור לשלוט טוב יותר בריגוש יתר הנגרמת על ידי מצבי מחלה מסוימים כגון מחלת כלי דם היקפיים או אי ספיקת לב. השתמשנו בשתי גישות כדי לזהות את תעלות היונים התלויות במתח המתבטאות על ידי נוירונים אלה, אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי ואימונוציטוכימיה. בעוד שאלקטרופיזיולוגיה בתוספת חוסמים פרמקולוגיים יכולים לזהות סוגי תעלות יונים פונקציונליים, השתמשנו באימונוציטוכימיה כדי לזהות ערוצים שעבורם חוסמים ספציפיים לא היו זמינים וכדי להבין טוב יותר את דפוס התפלגות תעלות היונים באוכלוסיית התאים. ניתן ליישם טכניקות אלה באזורים אחרים של מערכת העצבים כדי לחקור קבוצות נוירונים ספציפיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרעיני שורש גב (DRG) מורכבים מסומה מתאי עצב המעצבבים חלקים שונים בגוף, וניתן לקבל תובנות חשובות מחקר נוירונים חושיים עם מטרות עצבוב שונות1. שיטות עקיפות או פולשניות שונות משמשות לבידוד וזיהוי נוירונים אפרנטיים למשל הזרקת סמנים לעצב כמו פלואורוגולד1, הזרקת צבע לשרירים בשיטה כירורגית2. מבין הצבעים השונים ששימשו בהצלחה לתיוג נוירונים ודרכי עצב, צבעים פלואורסצנטיים כמו DiI נמצאים בשימוש נרחב במעקב נוירו-אנטומי בשל ספיגתם המהירה על ידי מסופי נוירונים, שימור לטווח ארוך בנוירונים והיעדר העברה בין נוירונים3. ניתן לדמיין בקלות את הנוירונים המגיעים המסומנים ב-DiI באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי למחקר מפורט. עם זאת, מגבלה אחת היא שסמנים כגון DiI יכולים ללכת לאיבוד מהתאים במהלך חדירת התאים הדרושה לאימונוציטוכימיה עם אפיטופים תוך-תאיים4. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת ב-DiI המוזרק לשריר השלד כדי לזהות נוירונים מגיבים לשריר ב-DRG. אנו מתארים גם שיטת חדירה לתאים השומרת על DiI בנוירון תוך מתן גישה לנוגדנים לאפיטופים תוך-תאיים. אנו מדגימים שימוש הן באלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי והן באימונוציטוכימיה כדי לחקור את הנוירונים המזוהים הללו, כמו גם לתאר את היתרונות המובהקים של כל טכניקה בחקר תעלות יונים השולטות בריגוש עצבי. לבסוף, אנו מתארים בעיות פוטנציאליות שיכולות לעכב את הפרשנות של נתונים אלקטרופיזיולוגיים. השתמשנו בשיטות אלה כדי לזהות נוירונים אפרנטיים שריריים ועוריים ולקבוע את תעלות הנתרן עם שער המתח (NaV) המתבטאות בתאי עצב מזוהים אלה8. עם זאת, ניתן להתאים שיטות אלה למגוון תכשירים לחקר תת-קבוצות מזוהות של נוירונים המעצבבים רקמת מטרה מסוימת או גרעין מוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל העבודה בבעלי חיים חייבת להתבצע על פי הנחיות מוסדיות והנחיות לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים ותיוג

  1. הרדמת חולדות: להרדים חולדה (בדרך כלל 150-400 גרם) באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת של קטמין (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף), קסילזין (5 מ"ג/ק"ג) ואצפרומזין (1 מ"ג/ק"ג). בדוק אם יש רפלקסים על ידי צביטה בכף הרגל, המתן עד שלא תהיה תגובה. מכיוון שתגובת ההרדמה משתנה בין בעלי חיים, עדיף לקבוע את השפעת חומרי ההרדמה על ידי בדיקת רפלקסים לכאב.
  2. תמיסת DiI: שקלו אבקת DiI והמיסו ב-100% DMSO סטרילי כדי להשיג תמיסה של 1.5% (15 מ"ג/מ"ל). אחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר באווירה יבשה עד לשימוש.
  3. זריקות DiI: לגלח את השיער מעל אזור העגל בשתי רגלי החולדה המורדמת באמצעות סכין גילוח חשמלי.
    1. מלאו מזרק סטרילי של 1 מ"ל (11/4 במחט של 27 גרם) ב-200 מיקרוליטר של תמיסת DiI של 1.5%. הכנס לאט את המחט במקביל לציר הארוך של כל שריר גסטרוקנמיוס, והזריק 100 מיקרוליטר DiI לשריר תוך כדי גיבוי איטי של המחט מהשריר (~10 שניות) מבלי לסגת מהשריר.
    2. לפני הוצאת המחט מהשריר, משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי להבטיח שהצבע כבר לא זורם מהקצה, המתן 10 שניות ולאחר מכן משוך את המחט מהשריר. שלב זה מונע דליפה של DiI מהמחט אל העור, מה שעלול לסמן מוליכים עוריים.
    3. חזור על הפעולה עבור הרגל השנייה.
    4. אפשר 4-5 ימים להעברת ה-DiI מהשריר ל-DRG.

2. דיסקציה ובידוד עצבי

  1. פתרונות:
    1. הכן את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ואת תמיסת המלח המאוזנת של ארל (EBSS) בהתאם להוראות היצרן, סנן, עקר ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. מצע תרבית (MEM Plus): מערבבים 89 מ"ל חומר חיוני מינימלי (MEM), 10 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS), 1 מ"ל תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. תמיסת פוליליזין: ממיסים אבקת פולי-ליזין הידרוברומיד (10 מ"ג/100 מ"ל) בתמיסת נתרן בוראט 0.1 M, pH 8.4, מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. כיסויי ציפוי
    1. נקה את כיסויי הזכוכית (עגולים 12 מ"מ) באתנול 70% למשך 3-4 שעות וייבש באוויר במכסה המנוע הסטרילי.
    2. הנח את הכיסויים המיובשים בתמיסת הפוליליזין O/N.
    3. מוציאים מתמיסת הפוליליזין ושוטפים במים מזוקקים סטריליים פעמיים למשך 5 דקות כל אחד כדי להסיר עודפי פוליליזין.
    4. הפרד את הכיסויים, יבש במכסה המנוע ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הגדרה לדיסקציה
    1. מניחים על הקרח עם 10 מ"ל HBSS, צלחת פטרי 35 מ"מ וצלחת פטרי 100 מ"מ.
    2. שקלו אנזימים: 7 מ"ג קולגנאז, 1 מ"ג DNAse ו-10 מ"ג טריפסין.
    3. מחממים אמבט מים רועדים ל-37 מעלות צלזיוסומכניסים לאמבטיה שפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל המכילה 10 מ"ל EBSS לחימום.
  4. דיסקציה:
    1. הקרבת חולדה על פי פרוטוקול שאושר על ידי IACUC. Carbon dioxide שימש להמתת חסד של החולדה.
    2. הסר במהירות את הגב על ידי חיתוך העור בגב, הסר את רקמת החיבור והשריר לאורך עמוד השדרה לחשיפה טובה יותר והסר את החלק המותני של עמוד השדרה (קצה אזור בית החזה לעצם הכסל; איור 1).
    3. הנח את עמוד החוליה המבודד בצלחת פטרי 100 מ"מ, ובעזרת פיפטה סטרילית של פסטר מרחו תמיסת HBSS צוננת כדי לשמור על התכשיר לח וקר.
    4. חותכים את השרירים מצידי עמוד החוליות. בצע כריתת למינקטומיה גבית, באמצעות מספריים או מספריים, והסר בעדינות את העצם הסוגרת את השקעים המכילים את ה-DRG.
    5. יש למרוח שוב ושוב HBSS קר כקרח (~1 מ"ל) במהלך הליך זה.
    6. בודד את ה-DRG על ידי חיתוך העצבים ההיקפיים והמרכזיים (השארת 1-2 מ"מ של עצב כדי להקל על הטיפול בגרעין)
    7. הנח את ה-DRG המבודד בצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה מאגר HBSS קר כקרח.
    8. חזור על הפעולה עד שכל ה-L-4 וה-L-5 DRG מבודדים. ניתן לבודד ולעבד DRG בית החזה בנפרד כבקרה שלילית לתיוג DiI.
    9. מניחים את המנה עם DRG מבודד מתחת למיקרוסקופ דיסקציה ומסירים את עודפי העצבים וכלי הדם באמצעות מספריים מיקרו ומלקחיים.
    10. חתוך את ה-DRG לחשיפה טובה יותר לאנזימים, אך אל תבטל את ה-DRG.
  5. דיסוציאציה של נוירונים DRG:
    1. יש להוסיף את האנזימים למצע ה-EBSS החם (הנשמר באמבט המים). יש לנער לזמן קצר כדי להתמוסס, ולסנן לעקר.
    2. בעזרת פיפטת פסטר סטרילית, הנח את כל ה-DRG בתמיסת האנזים. צמצם את נפח ה-HBSS שמתווסף עם DRG מכיוון שה-HBSS ידלל את תערובת האנזים. גז את הבקבוק ב-95% O2 ו-5% CO2 למשך 60 שניות לפני שמכסה היטב את הבקבוק.
    3. דגרו את הבקבוק באמבט המים הרועדים המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב-240 סל"ד.
    4. בתום הדגירה, נער במרץ את הבקבוק פי 50 כדי לנתק את ה-DRG5.
    5. בתנאים סטריליים, הוסף 5 מ"ל של MEM Plus לבקבוק כדי לעצור את האנזימים.
    6. מעבירים את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 16 x גרם למשך 6 דקות.
    7. הסר והשליך את הסופרנטנט, הוסף 5 מ"ל של MEM Plus לדגימה. יש לשלש בעדינות בעזרת פיפטה כדי לפרק את הגלולה.
    8. חזור על שלב הצנטריפוגה, הסר והשליך את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר של MEM Plus. יש למשוך בעדינות עם קצה פיפטה של 1 מ"ל על פיפטה ליצירת תרחיף תאים.
    9. הנח מכסה זכוכית מצופה פולי-ליזין אחד לתוך צלחת סטרילית ריקה בגודל 35 מ"מ. הוסף טיפה (~50 מיקרוליטר) של מתלה התא למרכז הכיסוי.
    10. חזור על הפעולה עד למיצוי תמיסת התא.
    11. הנח את הכלים בקוטר 35 מ"מ באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה אחת כדי לאפשר לתאי העצב להיצמד לכיסויים.
    12. מוסיפים 2 מ"ל מדיה נוספים לכל מנה ומחזירים לחממה.

3. תיקון מהדק הקלטה

  1. פתרונות להקלטה: פתרונות אלה מיועדים להקלטת זרמי Nav. דוגמאות לפתרונות עם הרכב שונה ניתן למצוא בהפניות אלה5-7.
    1. תמיסה חיצונית: (במ"מ) 45 NaCl, 100 N-methyl-d-glucamine (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES ו-10 גלוקוז, עם pH = 7.4 ואוסמולריות = 320 mOsm.
    2. תמיסה פנימית: (במ"מ) 104 NMG•Cl, 14 קריאטין•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA, ו-0.3 Tris2•GTP עם pH 7.4 ואוסמולריות = 300 mOsm.
  2. מדידת זרמים יוניים:
    1. משוך אלקטרודות הקלטה מנימי זכוכית על מושך אלקטרודות ולטש בחום את הקצוות באמצעות מיקרו-פורג'. ההתנגדות של האלקטרודות היא בדרך כלל 2-3 MΩ
    2. זהה את נוירוני ה-DRG המסומנים ב-DiI באמצעות מיקרוסקופ עם אפיפלואורסצנציה וקוביית TRITC. ל-DiI יש אורך גל עירור של 550 ננומטר ואורך גל פליטה של 570 ננומטר.
    3. מלאו את אלקטרודת הזכוכית בתמיסה פנימית (רק תיוק ~ 1 ס"מ מקצה האלקטרודה) והקישו בעדינות כדי להסיר בועות כלואות. מניחים במחזיק האלקטרודות ומעבירים לתא באמצעות מיקרומניפולטור.
    4. לאחר שהאלקטרודה נוגעת בתא, הפעל יניקה עדינה דרך צינור היניקה, עד שנוצר אטימה הדוקה (נקבעת על ידי העלייה בהתנגדות האלקטרודות).
    5. מהדק את מתח הממברנה בפוטנציאל ההחזקה הרצוי (בדרך כלל -60 עד -120 mV).
    6. השג את תצורת מהדק התיקון של כל התא על ידי הפעלת יניקה חזקה יותר כדי להסיר את תיקון הממברנה בקצה האלקטרודה. המעבר לתצורת תא שלם נצפה חשמלית כעלייה בזרם הקיבולי8-10.
    7. פיצוי על ההתנגדות הטורית באמצעות מעגלי הקיזוז של מגבר מהדק התיקון (השתמש בקיזוי של 80% לפחות)8,10.

4. אימונוציטוכימיה

  1. תקן את הנוירונים על הכיסויים עם 4% פרפורמלדהיד למשך שעה אחת ולאחר מכן חלחל עם 2% Tween 20 במי מלח חוצץ פוספט (PBS) למשך 10 דקות.
  2. דגרו את התאים הקבועים O/N בתמיסה חוסמת (סרום רגיל או אלבומין בסרום בקר) בתוספת הנוגדן הראשוני, שהוא נוגדן שפותח כדי להיקשר לאנטיגן ספציפי מעניין.
  3. דגירה של קבוצת בקרה של נוירונים O/N בתמיסה חוסמת שחסרה את הנוגדנים העיקריים.
  4. שטפו את הכיסויים עם מאגר PBS 3 פעמים למשך 5 דקות ולאחר מכן 2 כביסות של 5 דקות כל אחת עם 1% Tween 20 כדי להסיר נוגדן ראשוני לא קשור.
  5. דגירה של כיסויי בדיקה ובקרה עם הנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטי המתאים, הנקשר לנוגדנים הראשוניים כדי לאפשר הדמיה.
  6. שטפו את הכיסויים עם PBS 3x למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים.
  7. התקן את החלקות הכיסוי על מגלשת זכוכית נקייה באמצעות מדיית הרכבה.
  8. מרחו לק שקוף על קצה הכיסוי כדי לקבע את מקומו. לאחר הייבוש, דמיינו את הנוירונים וצלמו תמונות באמצעות התוכנה הנלווית למיקרוסקופ הקרינה.
    הערה: בעבודה זו נעשה שימוש במיקרוסקופ של ניקון עם תוכנת NIS-elements BR 3.2. זמן החשיפה היה ממוטב ונשאר זהה עבור שקופיות בקרה ובדיקה.
  9. מדוד את עוצמת הקרינה וגודל התא מתאי עצב בודדים באמצעות תוכנת הדמיה כגון ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות השיטה המתוארת כאן, זיהינו נוירונים מגיבים שרירים ב-DRG והמשכנו לקבוע את תעלות הנתרן עם שער המתח (NaV) המתבטאות על ידי נוירונים אלה. תאי עצב שרירים מסומנים ב-DiI (איור 1C) היוו חלק קטן מכלל אוכלוסיית הנוירונים ב-DRG עם ממוצע של 16% מהנוירונים (167/1047) מסומנים. הכימות נעשה תחילה על ידי מדידת הקרינה באמצעות ImageJ והתוויית היסטוגרמות של נתוני העוצמה כדי לקבוע את הסף לנוירונים המסומנים חיובית. הסף נקבע על ידי התאמת התפלגות גאוס לשיא הגדול של נוירונים לא מסומנים, שסיפקו עוצמה ממוצעת וסטיית תקן (SD) ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוליכי שרירים שמקורם בשרירי התלת ראשי (למשל גסטרוקנמיוס) שימשו במספר מחקרים כדי לחקור את רפלקס הלחץ על המאמץ (EPR)13. בהתחשב בעניין בחקר נוירונים חושיים המתווכים את ה-EPR, שרירי הגסטרוקנמיוס נבחרו להזרקת צבע. DiI נבחר בשל אופיו הליפופילי ומכיוון שהוא אינו הולך לאיבוד מהנוירון על ידי דיפוזיה דרך קרום הפלזמה השלם3,14. באמצעות שיטה זו כמדריך, ניתן להזריק את הצבע לכל איבר מטרה מעניין כדי לזהות את הנוירונים המעצבבים. חיפוש בספרות יספק את המידע הדרוש לאיתור אתר ההזרקה הטוב ביותר ואת ה-DRGs שיש לב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי AR059397 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (KSE).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NaV 1.8AbcamAb93616
NaV 1.1 / 1.6 / 1.7 ו- 1.9מעבדות אלמון, ירושלים, ישראלASC- 001/ 009 /008 /017
נוגדנים משניים אלקסה פלואורInvitrogen
עיזים רגיל
פלואורו-ג'למדעי מיקרוסקופיה17985
סרום אלקטרונית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, P., McLachlan, E. M. Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats. J. Neurosci. 23, 10559-10567 (2003).
  2. Wang, H. J., et al. Endogenous reactive oxygen species modulates voltage-gated sodium channels in dorsal root ganglia of rats. J. Appl. Physiol. 110, 1439-1447 (2011).
  3. Köbbert, C., et al. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
  4. Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J. Neurosci. Methods. 174, 71-81 (2008).
  5. Ikeda, S. R., Schofield, G. G., Weight, F. F. Na+ and Ca2+ currents of acutely isolated adult rat nodose ganglion cells. J. Neurophysiol. 55, 527-539 (1986).
  6. Yarotskyy, V., Elmslie, K. S. Roscovitine Inhibits CaV3.1 (T-Type) Channels by Preferentially Affecting Closed-State Inactivation. J. Pharmacol. Exp.Ther. 340, 463-472 (2012).
  7. Ganapathi, S. B., Kester, M., Elmslie, K. S. State-dependent block of HERG potassium channels by R-roscovitine: implications for cancer therapy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, 701-710 (2009).
  8. Jones, S. W. Neuromethods Vol. 14 Neurophysiological Techniques: Basic Methods and Concepts. Baker, G. B., Vanderwolf, C. H., Boulton, A. A. , The Humann Press, Inc. 143-192 (1990).
  9. Penner, R. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. rwin 1, Plenum Press. 3-30 (1995).
  10. Marty, A. aN., Erwin, Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. rwin 2, Plenum Press. 31-52 (1995).
  11. Ramachandra, R., McGrew, S. Y., Baxter, J. C., Kiveric, E., Elmslie, K. S. Tetrodotoxin-resistant voltage-dependent sodium (NaV) channels in identified muscle afferent neurons. J. Neurophysiol. , (2012).
  12. Ramachandra, R., McGrew, S. Y., Baxter, J. C., Howard, J. R., Elmslie, K. S. NaV1.8 channels are expressed in large, as well as small, diameter sensory afferent neurons. Channels. 7, 0-1 (2013).
  13. Smith, S. A., Mitchell, J. H., Garry, M. G. The mammalian exercise pressor reflex in health and disease. Exp. Physiol. 91, 89-102 (2006).
  14. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12, 333-335 (1989).
  15. von Bartheld, C. S., Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J. Histochem. Cytochem. 38, 725-733 (1990).
  16. Fuller, B. C., Sumner, A. D., Kutzler, M. A., Ruiz-Velasco, V. A novel approach employing ultrasound guidance for percutaneous cardiac muscle injection to retrograde label rat stellate ganglion neurons. Neurosci. Lett. 363, 252-256 (2004).
  17. Takahashi, Y., Nakajima, Y. Dermatomes in the rat limbs as determined by antidromic stimulation of sensory C-fibers in spinal nerves. Pain. 67, 197-202 (1996).
  18. Zhou, W., Jones, S. W. Surface charge and calcium channel saturation in bullfrog sympathetic neurons. J Gen Physiol. 105, 441-462 (1995).
  19. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  20. Margas, W., Mahmoud, S., Ruiz-Velasco, V. Muscarinic Acetylcholine Receptor Modulation of Mu ({micro}) Opioid Receptors in Adult Rat Sphenopalatine Ganglion Neurons. J. Neurophysiol. 103, 172-182 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch ClampDiIDRG

מאמרים קשורים