הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

70.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50783

⸱

12 בפברואר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

תקציר

Neurites, גם דנדריטים ואקסונים, הם תהליכים תאיים עצביים המאפשרים ההולכה של דחפים חשמליים בין תאי עצב. הגדרת המבנה של neurites היא קריטית להבנה כיצד תהליכים אלה להעביר חומרים ואותות שתומכים בתקשורת הסינפטי. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כבר משמש באופן מסורתי כדי להעריך את תכונות ultrastructural בתוך neurites, עם זאת, החשיפה לממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף יכולה לעוות מבנים. מטרה שלא סופקו חשובה היא גיבוש נהלים המאפשרים להערכות מבניות אינם מושפעות מממצאים כאלה. הנה, הקמנו פרוטוקול מפורט ולשעתק לגידול וneurites כל הקפאה-הבזק של נוירונים עיקרי שונה ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבדיקה שלהם עם טומוגרפיה האלקטרונים cryo-(cryo-ET). טכניקה זו מאפשרת להדמיה 3-D של neurites הקפואה, התייבשות ברזולוציה ננומטר, בהנחיית assessment של ההבדלים מורפולוגיים שלהם. הפרוטוקול שלנו מניב תצוגה חסרת תקדים של הגנגליון הגבי שורש neurites (DRG), ויזואליזציה של neurites בהיפוקמפוס במדינה הקרובה למולדתם. ככזה, שיטות אלה ליצור בסיס למחקרים עתידיים בneurites של שני נוירונים נורמלים ואלה מושפעים מהפרעות נוירולוגיות.

מבוא

נוירונים להקים חיוני מעגלים המורכבים לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה על ידי לפרט דנדריטים לקבל מידע ואקסונים, לעתים קרובות די ארוך, כדי לתקשר עם הנוירונים במורד הזרם. התוצאה neurite ממלאת תפקיד מהותי במהלך התפתחות עוברית והתמיינות ותחזוקה של neurites עצביות תומכת באופן ביקורתי את התפקוד של מערכת העצבים. תהליכים מדלקת עצבים גם תכונה קריטית בפגיעה עצבית והתחדשות, כמו גם הפרעות במערכת עצבים. לימודי אדריכלות עצבית הוא חיוניים כדי להבין הן את המוח הבריא והחולה. למרבה המזל, מערכות תרבית תאים עצביות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית קיימות שיכול לשחזר מבנים תאיים מורכבים והטרוגנית. בהתבסס על הבהרה של פלטפורמות ניסיוניות מוצקות, אסטרטגיות יעילות להדמיה המאפשרות ניתוחים איכותיים וכמותית של מורפולוגיה עצבית יש צורך. שימושי במיוחד הייתלהיות מתודולוגיה מפורטת המספקת פלטפורמה אחידה המאפשרת הדמית neurites, שני אקסונים ודנדריטים בקנה המידה ננומטרי.

במיקרוסקופ אלקטרונים מסורתי דורש שימוש בממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף, אשר יכולה לגרום לעיוותים בדגימות ממצבם האמיתי. עד כה, רוב האפיונים מבניים בקנה המידה ננומטרי מבוססים על תאים גדולים יותר או רקמות שנחשפים לכימיקלים קשים כגון - ובכך להגביל את הפרשנות של הממצאים 4,9,25. יתר על כן, לחדירת קרן אלקטרונים, חתך נדרש לאורגניזמים או בליטות סלולריות מציגים עובי גדול מ 1 מיקרומטר 12. לבסוף, מחולק או הסתובב תוצאות רקמות באוסף של ערכות נתונים פרוסה ספציפית בדידות, מה שהופך מסורבלת להגדרת התכונה המוארכת של neurites. אפילו לcryo-EM, שבו חתך דגימה קפוא התייבשות הוא אפשרי, השיטה מציגה artif דחיסהפועל 1.

בשנים האחרונות, חוקרים למדו איך לגדל תאי עצב בהיפוקמפוס ישירות על רשתות EM ו באתאן הנוזלי כדי לחזות בהמשך neurites באמצעות cryo-ET 8,10,18,23 הקפאת הבזק. עם זאת, מחקרים כאלה או להשתמש בהתקן מותאם אישית 10,23, או פרטי חוסר בצעד הסופג ליצירת קרח זגוגי מספיק דק להדמיה שגרתית 8,18. לדוגמא, מחקר אחד ממליץ על השימוש של 30-40 שניות לסופגים רשת EM 10, עם זאת, ערך זה הוא מותאם לא לשימוש כללי, אלא הוא ספציפי לאותו מכשיר ההקפאה לצלול בהזמנה אישית. שימוש במכשיר בהזמנה אישית ולא אחד 17 זמינים מסחרי לשמירה על לחות לפני מדגם ההקפאה לצלול יכול להוות מכשול לשחזור נרחב.

בעוד שמחקרים אלה היו פורץ באופן חזותי neurites ידי cryo-ET, נקטנו צעד נוסף כדי לחקור את applicability של cryo-ET למגוון רחב של דגימות עצביות (נוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי). בנוסף, אנו דנים בשתי תוצאות אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גם חפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה.

הגדרת טכניקה מפורטת לשימור באופן חזותי כל neurites בקנה המידה ננומטרי במצב כמעט טבעי היה לשפר את היכולת ליותר חוקרים לבצע מחקרי ultrastructural. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומפורט תוך שימוש בציוד זמין מסחרי כדי להכין נוירונים מבולבל, בלא כתם לדמיין neurites. זהו צעד ראשון חשוב לקראת המפרט את ultrastructure של neurites בריאה וכדי להניח את היסודות להבנה מה הבדלים מבניים קיימים בדגמי מחלה של מערכת עצבים. מאז cryo-ET יכול לפתור את תכונות neurite מבולבל, בלא כתם ב 3-D בקנה המידה ננומטרי, השיטה תגרום אפשרי כפי שמעולם לא יהיה זהביטוי להגדרת ארכיטקטורה מדלקת עצבים 12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מאכלים עם EM רשתות עבור נוירונים העיקרי ציפוי

  1. בדוק את התקינות של פחמן מחורר על רשתות EM הזהב באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של לפחות 25X. לעשות חורי פחמן בטוחים> 98% בשלמותה.
  2. לציפוי נוירונים עיקרי, השתמש במבער בונזן להבה לעקר רשתות EM ובמקביל להבהיר להם הידרופילי. להשתמש בפינצטה כדי להרים את רשת EM על ידי הקצה שלה, לא את אזור gridded המרכזי. זהירות: לעולם אל תשאיר את מבער בונזן מואר ללא השגחה, ולא להשתמש בכפפות או פינצטה עם רכיבי פלסטיק בעת ביצוע הפעולות הבאים:
    1. לפני שהדלקתי את המבער בונזן, הגדר את התאמות האוויר וגז למיקום מינימאלי פתוח.
    2. להדליק את המבער בונזן באמצעות צור חלוץ או מצית.
    3. שנה את התאמות האוויר וגז כדי להשיג אש קטנה, כחולה פנימית בתוך להבה גבוהה יותר, קלה יותר כחול / סגולה. קצה הלהבה הפנימית הוא החלק החם ביותר של הלהבה. הידית מתחתNeath צורב מתאים את כמות הגז שנכנס לצינור צורב, ואילו החבית של המבער ניתן להפעיל כדי להתאים את כמות האוויר שנכנס למבער. הפיכת כיוון השעון התאמת האוויר מקטינה את האוויר (וכתוצאה מלהבה סגולה) ונגד כיוון שעון מגביר את האוויר (וכתוצאה מלהבה צהובה).
    4. באמצעות פינצטה מתכת (ללא חלקי פלסטיק) כדי להחזיק את רשת EM, להעביר אותו במהירות דרך הלהבה פעמיים, מול פחמן בצד למעלה. צד פחמן יופיע יותר מט (פחות מבריק) ועם יותר מגוון אפרפר יותר מהצד השני.
    5. מייד להעביר את הרשת (פחמן בצד למעלה) למרכז צלחת הזכוכית תחתונה ממוקמת בתוך 10 סנטימטר של המבער בונזן. השתמש ברשת EM אחד לכל צלחת (איור 1). להשתמש רק בזכוכית התחתונה מנות הpresterilized, כלומר באמצעות גמא הקרנה.
  3. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את תקינות הרשת (חורי פחמן ללא פגע) תוך שמירת רשת EM בתוך זכוכית בוטהמנה om (כדי למנוע זיהום). כאשר פונה לכל חומר על הרשת או כל דבר שבאות במגע עם תאי העצב, השתמש בהליך סטרילי וטיפים פיפטה סטרילית.
  4. במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות הליך סטרילי, להחיל 250 μl של חומר הציפוי המתאים לאט ובזהירות לאזור הזכוכית המרכזי של צלחת פטרי. ודא שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת EM.
    1. לנוירונים בהיפוקמפוס, השתמש פולי-L-ליזין (PLL, 1 מ"ג / מיליליטר) כחומר הציפוי, שהוכן כמתואר 19 בעבר. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. לגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG), להשתמש בתערובת חלבון דביקה המופרש על ידי Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כחומר ציפוי, להכין באופן הבא. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם.
      1. להפשיר בקבוק המניהשל תערובת החלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל תאי סרקומה עכבר (EHS) הלילה ב 4 ° C.
      2. שמור על קור תערובת חלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר, ואת כל הרכיבים המשמשים לייצור הפתרון, כלומר על ידי שמירה על אותם על קרח.
      3. בעוד על קרח, לדלל תערובת חלבונים הדביקה הזה במדיום Neurobasal להניב דילול 01:20 (כלומר לדלל 500 μl של תערובת החלבונים הדביקה ל10 מיליליטר של Neurobasal).
      4. פער בדילול תערובת חלבונים דביק לתוך 1 מיליליטר aliquots, ולאחסן באופן מיידי כל aliquots נוספים ב -20 ° C.
      5. החל 250 μl לרשת EM, לכל צלחת, כפי שתואר בסעיף 1.4.
  5. מכסה את צלחת פטרי עם הראש שלה ודגירה (או עם PLL לדגימות בהיפוקמפוס, או עם תערובת החלבונים הדביקה לדגימות DRG) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במכסת המנוע בתרבית הרקמה.
  6. ASPIלדרג כל PLL (עבור דגימות בהיפוקמפוס) או תערובת הדביקה החלבון (לדגימות DRG) מהכלים. כדי לעשות זאת, השתמש במערכת הוואקום במכסת המנוע בתרבית הרקמה. השתמש בקצה פיפטה סטרילית המצורף לצינור הוואקום. להימנע ממגע ישיר עם רשת EM.
  7. השתמש פיפטה אוויר העקירה מתכווננת ליישם בזהירות 250 μl של PBS סטרילי (פוספט שנאגרו מלוח) לרשת EM באזור הזכוכית המרכזית של כל צלחת פטרי, כך שרשת EM מכוסה באופן מלא על ידי PBS. ואז, לשאוב את PBS מכל מנה. חזור 3x.
  8. לאפשר המנות עם רשתות EM לייבוש מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה במשך 15 דקות. לוודא שהם יבשים לחלוטין על ידי בדיקה מתחת למיקרוסקופ האור בחדר בתרבית הרקמה. ודא שאין בועות של לחות ברשת. אם כן, בזהירות לשאוב הבא לרשת EM לחסל לחות נוספת זה. יש להשתמש ברשת המצופה באופן מיידי לציפוי תאי העצב.

2. הכנה וPlating ראשי נוירונים בEM רשתות

  1. לצלחת נוירונים עיקרי, לנתח ראשון, trypsinize (באמצעות טריפסין 2.5%) וtriturate לנתק hippocampi (או גנגליון השורש הגבי של עוברי עכברים ישנים 18 יום) לתאים בודדים, כמתואר 19 בעבר.
    1. Triturate היא מונח נפוץ בשימוש על ידי neurobiologists לתאר גושים מתנערים של תאים לתוך תאים בודדים, בעיקר על ידי שימוש בפיפטה זכוכית עם קצה אש מלוטשת. התוצאה מושגת על ידי ציור בזהירות ובאיטיות ומשחרר את התאים, מעלה ומטה, מספר רב של פעמים (~ 30V) באמצעות פיפטה.
  2. בצע את ההליכים כפי שתוארו לעיל לנתיחה DRG ותא בידוד 24, בשים לב לשימוש טריפסין 0.25% (בHBSS) כדי לבודד את הנוירונים DRG חולדה, ולא להשתמש באנזימים הציעו (פפאין, collagenase / dispase) שמתאימים יותר לעכבר נוירונים DRG.
  3. לחשב את מספר תאי העצב הבודד (כלומר באמצעות hemocytometer)ולהשתמש בערך זה כדי לחשב את הנפח המתאים של תאים שיחולו על כל מנה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / מ"ל ​​לכל צלחת. הנפח המרבי ליישם הוא 250 μl. שים לב שזה רק ממלא את האזור המרכזי הזכוכית, לא את כל המנה.
  4. דגירה את הכלים ל30 דקות בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. לאפשר לתאים להתאושש ולדבוק.
  5. לאט לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של תקשורת חיממה לכל מנה, נזהר שלא להפריע לרשת EM. הסוג של מדיה תלוי בסוג התא (בהיפוקמפוס או DRG).
    1. הכן את המדיה המתאימה לאף אחד מתאי עצב בהיפוקמפוס 19 או נוירונים גנגליון השורש הגבי 24, אשר שחמם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. דגירה צלחות הלילה בחממת CO 2.
    2. לנוירונים בהיפוקמפוס, לשנות את התקשורת ביום שלמחרת. שינוי מחצית התקשורת בכל יומיים ואילך ל14 ימים. לחמם את התקשורת באמבט המים C ° 37 לפני השימוש.
    3. לנוירונים DRG, ביום שלמחרת לנתיחה / ציפוי, להכין מלאי חדש של תקשורת עם סוכן אנטי mitotic (uridine ו5'-Fluoro-2'-deoxyuridine) להפוך את פתרון מניות 10 מ"מ של כל אחד, בנפרד; להשתמש סופי ריכוז של 10 מיקרומטר לכל אחד. הסר מחצית תקשורת DRG (875 μl) ולהוסיף 875 μl של תקשורת טרי עם הסוכן אנטי mitotic.
      1. לנוירונים DRG, כל יומיים בשבוע הראשון, חלופי שינוי תקשורת בין כלי תקשורת אנטי mitotic ותקשורת DRG הסטנדרטי. בשבוע השני, לשנות את תקשורת DRG סטנדרטית בכל יומיים.

3. Vitrifying נוירונים בEM רשתות

  1. הכן את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון רשתות EM זהב בטמפרטורת קירור: מכשיר vitrification עם תא לחות 17, פינצטה מיוחדת עדין נקודה למכונת vitrification, פינצטה נקודה ארוכה שטוחה, דיואר (ים) של חנקן נוזלי (LN 2), גמיכל oolant, תיבת אחסון רשת EM, נייר סינון ללא סידן.
  2. הפעל את מכשיר vitrification. הגדר את הלחות ל100% וטמפרטורה ל32 ° C. בסעיף "המסוף", הגדר את זמן כתם לאפס שניות. זה מאפשר למדריך לסופג דרך צד החלון של תא הלחות של המכונה vitrification.
  3. ידית נייר סינון ללא סידן עם כפפות, שכבותיהם כך ששלושה עיתונים נערמים. חותכים את הערימה לרצועות רחבה 0.5 סנטימטר כי הם ~ עוד 2 סנטימטר. לכופף אותם בזווית של ° 90 כך שצד אחד של הנייר יש 0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר (איור 2). בעזרת פינצטה, להסיר את הנייר באמצע ומניח אותו על נייר סינון ללא סידן נוסף עד לשימוש.
  4. שים את כפתור אחסון רשת בבעל הכפתור בתוך תא התהליכים. למלא את התא הפנימי של מיכל נוזל הקירור עם חנקן נוזלי ולחכות עד אידוי מוחלט. למלא את התא החיצוני של המיכל נוזל קירור דואר עם חנקן נוזלי עד שהוא משיג טמפרטורה יציבה שלימשיך לשלב הבא. למלא את התא הפנימי עם אתאן גזי טוהר גבוה שיהיה לדחוס למצב נוזלי בתוך התא מקורר.
  5. הזז את הצלחת (es) מהחממה לצלחת קלקר 100 מ"מ גדול להובלה לחדר vitrification, אם לא בסביבה הקרובה. השתמש בפינצטה vitrification מיוחדת כדי לבחור את רשת EM זהירות מהצלחת. שים לב באיזה צד נוירונים גדלים על רשת EM; העמדה משנה לשלב הבא. השתמש בנעילה הזזה השחורה בפינצטה כדי לנעול מאובטח פינצטה על רשת EM.
  6. הכנס את פינצטה לתוך מכונה vitrification צד שכזו של רשת EM שבנוירונים הם דבקו פרצופים לשמאל, הרחק מהחור בצד הפתיחה של המכונה vitrification. לחזור בי פינצטה מיוחדת למכונה vitrification.
  7. מניחים את מיכל נוזל הקירור בבעל המתאיםשל המכונה vitrification. יש למלא אותו עם LN נאות 2 ואתאן הנוזלי. באמצעות פקודת המסך המתאימה של המכונה vitrification, להעלות את תא נוזל הקירור כלפי מעלה עד שהוא הסמיק עם החלק התחתון של תא הלחות.
  8. עם פינצטה הנקודה שטוחה, לתפוס קצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יותר (0.5 סנטימטר 0.5 x הפנים סנטימטר) הוא בניצב לפינצטה. פניה זו באה במגע ישיר עם רשת EM לסופג (איור 2). בזהירות להכניס את נייר הסינון לצד החור של תא הלחות של המכונה vitrification (איור 2 א). יציבות תצמיד את נייר רשת EM (הצד הפונה הרחק מהדגימה) ל10 שניות. מחק את הנייר אחר כך ומייד לצלול להקפיא את הדגימה באתאן הנוזלי באמצעות האוטומציה של המכונה vitrification.
  9. להעביר רשת EM-התייבשות הקפואה שלך בזהירות לאחד החריצים באחדכפתורי אחסון רשת. חזור על התהליך עבור רשתות EM נוספות במנות. כפתורי אחסון רשת EM משמשים בניסויים אלה יכולים לאחסן רשתות EM מרובות התייבשות קפוא.

4. אוסף תמונה, עיבוד, וביאור

  1. להמשיך לאסוף micrographs אלקטרונים 2-D ו / או סדרה להטות 3-D של 5 neurites באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-בתנאי במינון נמוך. תמונות 2-D נועדו להעריך את האיכות של הרשת במונחים של עובי קרח והתחומים האפשריים להיות שימושי סדרה להטות 3-D ל.
    1. במקרה זה, את כל התמונות נאספו באמצעות מצלמת CCD 4k x 4k המצורפת למיקרוסקופ אלקטרונים 200 קילו וולט מצויד בבעל העברת cryo להטות חנקן הנוזלי יחיד, בהגדלה מיקרוסקופ 20k ביעד underfocus של 7 מיקרומטר ודגימה של 4.4 A / פיקסל.
    2. כדי להשיג tomogram 3D של המדגם, לנקוט בשורה של תמונות הקרנה תוך הטיית אל המדגם באופן הדרגתיאונג ציר מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) אחד. בהתחשב בזוויות ההטיה והגדרות ניסיוניות אחרות, יש כמה תוכנות שונות זמינות כדי לאסוף את הסדרה להטות 5 באופן אוטומטי. הסדרה להטות 3-D מוצגת כאן נאספו באותו מיקרוסקופ באמצעות תוכנת רכישת סדרה להטות חצי אוטומטית-26 על פני טווח של -60 ° 60 ° ב 5 ° מרווחים עם מינון מצטבר של ~ 60 דואר / 2.
  2. לשחזר את סדרת ההטיה של neurites באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 21 כפי שתוארה קודם לכן לדוגמאות אחרות 5,29.
  3. צבע תסמן את תכונות 3-D של neurites ידי פילוח הראשון tomogram ויצירת מודל פני השטח באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 3-D כפי שתואר בעבר 5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לפני הקפאה והדמיה באמצעות cryo-ET, יש לנקוט בתמונות מיקרוסקופ אור של רשת EM שבו נוירונים גדלים. Neurites צריכה להיות לעין בלי חפיפה משמעותית אחד עם השני. קופסא צבעונית באיור 3A מייצגת אזור זה זנק ב להראות בהגדלה גבוהה יותר באיור 3 ב, שבי neurites משתרעת על פני סריג של הרשת. כל רשת מרובע מורכב מסרט פחמן מחורר התומך בתאי העצב וneurites. חורים אלה הם לכאורה בתמונת cryo-EM במינון נמוך שנלקחה ב4k הגדלה, אשר מציגה את גוף תא העצב כאובייקט גדול יחסית, כהה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנחנו מראים שנוירונים חולדה עובריים (גנגליון שורש הגבי והיפוקמפוס) ניתן לגדל במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM) וקפוא בקרח זגוגי רזה מספיק neurites להיות צילמה באמצעות 2-D cryo-EM וcryo-3-D ET. בעוד neurites בהיפוקמפוס בעבר צילמה באמצעות cryo-ET 8,10,18,23, פרוטוקול מפורט מספיק לשכפול מוצלח באמצעות מכשירים זמינים מסחרי כבר חסרים. יתר על כן, בעוד שהמחקר שלהם הוא החלוצה השימוש של cryo-ET להמחשת neurites בהיפוקמפוס, המחקרים שלנו לחקור את הישימות של cryo-ET ליותר מסוג אחד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מחקר זה כבר נתמך על ידי מענקי NIH (PN2EY016525 וP41GM103832). SHS נתמכה על ידי מענק מהתכנית ללימודי ההדרכה Nanobiology בינתחומי של מרכז קק WM להבינתחומי Bioscience הדרכה של חוף מפרץ קונסורציומים (NIH גרנט מס T32EB009379).

SHS גזור, גדל ומזוגג DRG ותאים בהיפוקמפוס, שנאסף cryo-EM ונתונים cryo-ET של DRG ואקסונים בהיפוקמפוס; שוחזר וצבע-מבואר סדרת ההטיה. MRG גזור וסיפק תאים בהיפוקמפוס במעבדה של MNR. SC סייע בביאור סדרת הטיה. SHS הוכשר על ידי CW על כיצד לנתח ולגדול נוירונים. SHS, WCM והמקלחת הגו את הניסויים. SHS הכין את כתב היד עם קלט ממחברים אחרים.

וידאו זה צולם במרכז לסלולרי הדמיה וNanoAnalytics (C-Cina) של Biozentrum של tהוא באזל האוניברסיטה. C-Cina משתלב במחלקה לBiosystems מדע וההנדסה (D-BSSE) של המכון הטכנולוגי של ציריך, הממוקם בבאזל, שוויץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Dumont #7 פינצטהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72803-01לטיפול ברשתות EM
כלי תחתית מזכוכיתMatTek Corp.P35G-1.5-10Cלגידול
מדגם רשתות מיקרוסקופיה אלקטרוניתQuantifoilHoley Carbon, Au 200, R 2/2לגידול
מדגם נייר סינון נטול סידןWhatman1541-055לדוגמא ספיגה
פינצטה ארוכה גדולה עם נקודה שטוחהExcelta CorporationE003-000590, 25-SAלדוגמא ספיגה 
מכשיר ויטריפיקציה ופינצטהFEIVitrobot Mark IIIלהקפאת מדגם
קופסאות אחסון MinigridTed Pella, Inc.160-40לאחסון רשתות EM
מחזיק העברת קריוGatan626 מחזיק העברת קריו חנקן נוזלי הטיה אחתלדוגמאות הדמיה
תוכנת רכישה סדרת הטיה למחצהאוטומטית SerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/לדוגמאות הדמיה
תוכנה לעיבוד תמונהIMOD eTomohttp://bio3d.colorado.edu/imod/לעיבוד תמונה
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ל-cryoEMJEOL, טוקיו200-kV JEM2100 LaB6 מיקרוסקופ אלקטרוניםלהדמיה
4k x 4k CCD מצלמהGatanN/Aלהדמיה
תוכנת הערות תלת מימדVisage Imaging GmbHAmira/Avizoלעיבוד נתונים תלת מימדיים
תוכנה לתפירה דיגיטלית של תמונות דו-ממדיותAdobeAdobe Photoshopלעיבוד נתונים דו-ממדיים
DMEM, גלוקוז גבוהInvitrogen11965-118לתרבית היפוקמפוס
חומצה בוריתסיגמא אולדריץ'B-0252לתרבית היפוקמפוס
נתרן טטרבוראטסיגמא אולדריץ'B-9876לתרבית היפוקמפוס
פולי-L-ליזין סיגמא אולדריץ'P2636-500MGלתרבית היפוקמפוס
מערכת סינוןקורנינג430758לתרבית ההיפוקמפוס
מדיום נוירובזאליInvitrogen21103-049לתרבית DRG
תוסף B-27Invitrogen17504-044לתרבית DRG
פניצילין/סטרפטומיציןInvitrogen15140-122לתרבית DRG
GlutaMAXInvitrogen35050-061לתרבית DRG
חולדה רקומביננטית b-NGFR& D Systems556-NGלתרבית DRG
UridineSigmaU3003-5Gלתרבית DRG
5'-Fluoro-2'-deoxyuridineSigmaF0503-100MGלתרבית DRG
MatrigelBD Biosciences356234לתרבית DRG

מקורות

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146(2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.