הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

נוירונים להקים חיוני מעגלים המורכבים לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה על ידי לפרט דנדריטים לקבל מידע ואקסונים, לעתים קרובות די ארוך, כדי לתקשר עם הנוירונים במורד הזרם. התוצאה neurite ממלאת תפקיד מהותי במהלך התפתחות עוברית והתמיינות ותחזוקה של neurites עצביות תומכת באופן ביקורתי את התפקוד של מערכת העצבים. תהליכים מדלקת עצבים גם תכונה קריטית בפגיעה עצבית והתחדשות, כמו גם הפרעות במערכת עצבים. לימודי אדריכלות עצבית הוא חיוניים כדי להבין הן את המוח הבריא והחולה. למרבה המזל, מערכות תרבית תאים עצביות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית קיימות שיכול לשחזר מבנים תאיים מורכבים והטרוגנית. בהתבסס על הבהרה של פלטפורמות ניסיוניות מוצקות, אסטרטגיות יעילות להדמיה המאפשרות ניתוחים איכותיים וכמותית של מורפולוגיה עצבית יש צורך. שימושי במיוחד הייתלהיות מתודולוגיה מפורטת המספקת פלטפורמה אחידה המאפשרת הדמית neurites, שני אקסונים ודנדריטים בקנה המידה ננומטרי.

במיקרוסקופ אלקטרונים מסורתי דורש שימוש בממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף, אשר יכולה לגרום לעיוותים בדגימות ממצבם האמיתי. עד כה, רוב האפיונים מבניים בקנה המידה ננומטרי מבוססים על תאים גדולים יותר או רקמות שנחשפים לכימיקלים קשים כגון - ובכך להגביל את הפרשנות של הממצאים ^4,9,25. יתר על כן, לחדירת קרן אלקטרונים, חתך נדרש לאורגניזמים או בליטות סלולריות מציגים עובי גדול מ 1 מיקרומטר ^12. לבסוף, מחולק או הסתובב תוצאות רקמות באוסף של ערכות נתונים פרוסה ספציפית בדידות, מה שהופך מסורבלת להגדרת התכונה המוארכת של neurites. אפילו לcryo-EM, שבו חתך דגימה קפוא התייבשות הוא אפשרי, השיטה מציגה artif דחיסהפועל ^1.

בשנים האחרונות, חוקרים למדו איך לגדל תאי עצב בהיפוקמפוס ישירות על רשתות EM ו באתאן הנוזלי כדי לחזות בהמשך neurites באמצעות cryo-ET ^8,10,18,23 הקפאת הבזק. עם זאת, מחקרים כאלה או להשתמש בהתקן מותאם אישית ^10,23, או פרטי חוסר בצעד הסופג ליצירת קרח זגוגי מספיק דק להדמיה שגרתית ^8,18. לדוגמא, מחקר אחד ממליץ על השימוש של 30-40 שניות לסופגים רשת EM ^10, עם זאת, ערך זה הוא מותאם לא לשימוש כללי, אלא הוא ספציפי לאותו מכשיר ההקפאה לצלול בהזמנה אישית. שימוש במכשיר בהזמנה אישית ולא אחד ¹⁷ זמינים מסחרי לשמירה על לחות לפני מדגם ההקפאה לצלול יכול להוות מכשול לשחזור נרחב.

בעוד שמחקרים אלה היו פורץ באופן חזותי neurites ידי cryo-ET, נקטנו צעד נוסף כדי לחקור את applicability של cryo-ET למגוון רחב של דגימות עצביות (נוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי). בנוסף, אנו דנים בשתי תוצאות אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גם חפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה.

הגדרת טכניקה מפורטת לשימור באופן חזותי כל neurites בקנה המידה ננומטרי במצב כמעט טבעי היה לשפר את היכולת ליותר חוקרים לבצע מחקרי ultrastructural. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומפורט תוך שימוש בציוד זמין מסחרי כדי להכין נוירונים מבולבל, בלא כתם לדמיין neurites. זהו צעד ראשון חשוב לקראת המפרט את ultrastructure של neurites בריאה וכדי להניח את היסודות להבנה מה הבדלים מבניים קיימים בדגמי מחלה של מערכת עצבים. מאז cryo-ET יכול לפתור את תכונות neurite מבולבל, בלא כתם ב 3-D בקנה המידה ננומטרי, השיטה תגרום אפשרי כפי שמעולם לא יהיה זהביטוי להגדרת ארכיטקטורה מדלקת עצבים ^12.

1. הכנת מאכלים עם EM רשתות עבור נוירונים העיקרי ציפוי

1. בדוק את התקינות של פחמן מחורר על רשתות EM הזהב באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של לפחות 25X. לעשות חורי פחמן בטוחים> 98% בשלמותה.
2. לציפוי נוירונים עיקרי, השתמש במבער בונזן להבה לעקר רשתות EM ובמקביל להבהיר להם הידרופילי. להשתמש בפינצטה כדי להרים את רשת EM על ידי הקצה שלה, לא את אזור gridded המרכזי. זהירות: לעולם אל תשאיר את מבער בונזן מואר ללא השגחה, ולא להשתמש בכפפות או פינצטה עם רכיבי פלסטיק בעת ביצוע הפעולות הבאים:
   1. לפני שהדלקתי את המבער בונזן, הגדר את התאמות האוויר וגז למיקום מינימאלי פתוח.
   2. להדליק את המבער בונזן באמצעות צור חלוץ או מצית.
   3. שנה את התאמות האוויר וגז כדי להשיג אש קטנה, כחולה פנימית בתוך להבה גבוהה יותר, קלה יותר כחול / סגולה. קצה הלהבה הפנימית הוא החלק החם ביותר של הלהבה. הידית מתחתNeath צורב מתאים את כמות הגז שנכנס לצינור צורב, ואילו החבית של המבער ניתן להפעיל כדי להתאים את כמות האוויר שנכנס למבער. הפיכת כיוון השעון התאמת האוויר מקטינה את האוויר (וכתוצאה מלהבה סגולה) ונגד כיוון שעון מגביר את האוויר (וכתוצאה מלהבה צהובה).
   4. באמצעות פינצטה מתכת (ללא חלקי פלסטיק) כדי להחזיק את רשת EM, להעביר אותו במהירות דרך הלהבה פעמיים, מול פחמן בצד למעלה. צד פחמן יופיע יותר מט (פחות מבריק) ועם יותר מגוון אפרפר יותר מהצד השני.
   5. מייד להעביר את הרשת (פחמן בצד למעלה) למרכז צלחת הזכוכית תחתונה ממוקמת בתוך 10 סנטימטר של המבער בונזן. השתמש ברשת EM אחד לכל צלחת (איור 1). להשתמש רק בזכוכית התחתונה מנות הpresterilized, כלומר באמצעות גמא הקרנה.
3. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את תקינות הרשת (חורי פחמן ללא פגע) תוך שמירת רשת EM בתוך זכוכית בוטהמנה om (כדי למנוע זיהום). כאשר פונה לכל חומר על הרשת או כל דבר שבאות במגע עם תאי העצב, השתמש בהליך סטרילי וטיפים פיפטה סטרילית.
4. במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות הליך סטרילי, להחיל 250 μl של חומר הציפוי המתאים לאט ובזהירות לאזור הזכוכית המרכזי של צלחת פטרי. ודא שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת EM.
   1. לנוירונים בהיפוקמפוס, השתמש פולי-L-ליזין (PLL, 1 מ"ג / מיליליטר) כחומר הציפוי, שהוכן כמתואר ¹⁹ בעבר. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. לגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG), להשתמש בתערובת חלבון דביקה המופרש על ידי Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כחומר ציפוי, להכין באופן הבא. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם.
      1. להפשיר בקבוק המניהשל תערובת החלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל תאי סרקומה עכבר (EHS) הלילה ב 4 ° C.
      2. שמור על קור תערובת חלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר, ואת כל הרכיבים המשמשים לייצור הפתרון, כלומר על ידי שמירה על אותם על קרח.
      3. בעוד על קרח, לדלל תערובת חלבונים הדביקה הזה במדיום Neurobasal להניב דילול 01:20 (כלומר לדלל 500 μl של תערובת החלבונים הדביקה ל10 מיליליטר של Neurobasal).
      4. פער בדילול תערובת חלבונים דביק לתוך 1 מיליליטר aliquots, ולאחסן באופן מיידי כל aliquots נוספים ב -20 ° C.
      5. החל 250 μl לרשת EM, לכל צלחת, כפי שתואר בסעיף 1.4.
5. מכסה את צלחת פטרי עם הראש שלה ודגירה (או עם PLL לדגימות בהיפוקמפוס, או עם תערובת החלבונים הדביקה לדגימות DRG) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במכסת המנוע בתרבית הרקמה.
6. ASPIלדרג כל PLL (עבור דגימות בהיפוקמפוס) או תערובת הדביקה החלבון (לדגימות DRG) מהכלים. כדי לעשות זאת, השתמש במערכת הוואקום במכסת המנוע בתרבית הרקמה. השתמש בקצה פיפטה סטרילית המצורף לצינור הוואקום. להימנע ממגע ישיר עם רשת EM.
7. השתמש פיפטה אוויר העקירה מתכווננת ליישם בזהירות 250 μl של PBS סטרילי (פוספט שנאגרו מלוח) לרשת EM באזור הזכוכית המרכזית של כל צלחת פטרי, כך שרשת EM מכוסה באופן מלא על ידי PBS. ואז, לשאוב את PBS מכל מנה. חזור 3x.
8. לאפשר המנות עם רשתות EM לייבוש מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה במשך 15 דקות. לוודא שהם יבשים לחלוטין על ידי בדיקה מתחת למיקרוסקופ האור בחדר בתרבית הרקמה. ודא שאין בועות של לחות ברשת. אם כן, בזהירות לשאוב הבא לרשת EM לחסל לחות נוספת זה. יש להשתמש ברשת המצופה באופן מיידי לציפוי תאי העצב.

2. הכנה וPlating ראשי נוירונים בEM רשתות

1. לצלחת נוירונים עיקרי, לנתח ראשון, trypsinize (באמצעות טריפסין 2.5%) וtriturate לנתק hippocampi (או גנגליון השורש הגבי של עוברי עכברים ישנים 18 יום) לתאים בודדים, כמתואר ¹⁹ בעבר.
   1. Triturate היא מונח נפוץ בשימוש על ידי neurobiologists לתאר גושים מתנערים של תאים לתוך תאים בודדים, בעיקר על ידי שימוש בפיפטה זכוכית עם קצה אש מלוטשת. התוצאה מושגת על ידי ציור בזהירות ובאיטיות ומשחרר את התאים, מעלה ומטה, מספר רב של פעמים (~ 30V) באמצעות פיפטה.
2. בצע את ההליכים כפי שתוארו לעיל לנתיחה DRG ותא בידוד ^24, בשים לב לשימוש טריפסין 0.25% (בHBSS) כדי לבודד את הנוירונים DRG חולדה, ולא להשתמש באנזימים הציעו (פפאין, collagenase / dispase) שמתאימים יותר לעכבר נוירונים DRG.
3. לחשב את מספר תאי העצב הבודד (כלומר באמצעות hemocytometer)ולהשתמש בערך זה כדי לחשב את הנפח המתאים של תאים שיחולו על כל מנה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / מ"ל ​​לכל צלחת. הנפח המרבי ליישם הוא 250 μl. שים לב שזה רק ממלא את האזור המרכזי הזכוכית, לא את כל המנה.
4. דגירה את הכלים ל30 דקות בCO ₂ באינקובטור ב 37 ° C. לאפשר לתאים להתאושש ולדבוק.
5. לאט לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של תקשורת חיממה לכל מנה, נזהר שלא להפריע לרשת EM. הסוג של מדיה תלוי בסוג התא (בהיפוקמפוס או DRG).
   1. הכן את המדיה המתאימה לאף אחד מתאי עצב בהיפוקמפוס ¹⁹ או נוירונים גנגליון השורש הגבי ^24, אשר שחמם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. דגירה צלחות הלילה בחממת CO _2.
   2. לנוירונים בהיפוקמפוס, לשנות את התקשורת ביום שלמחרת. שינוי מחצית התקשורת בכל יומיים ואילך ל14 ימים. לחמם את התקשורת באמבט המים C ° 37 לפני השימוש. לנוירונים DRG, ביום שלמחרת לנתיחה / ציפוי, להכין מלאי חדש של תקשורת עם סוכן אנטי mitotic (uridine ו5'-Fluoro-2'-deoxyuridine) להפוך את פתרון מניות 10 מ"מ של כל אחד, בנפרד; להשתמש סופי ריכוז של 10 מיקרומטר לכל אחד. הסר מחצית תקשורת DRG (875 μl) ולהוסיף 875 μl של תקשורת טרי עם הסוכן אנטי mitotic.
      1. לנוירונים DRG, כל יומיים בשבוע הראשון, חלופי שינוי תקשורת בין כלי תקשורת אנטי mitotic ותקשורת DRG הסטנדרטי. בשבוע השני, לשנות את תקשורת DRG סטנדרטית בכל יומיים.

3. Vitrifying נוירונים בEM רשתות

1. הכן את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון רשתות EM זהב בטמפרטורת קירור: מכשיר vitrification עם תא לחות ^17, פינצטה מיוחדת עדין נקודה למכונת vitrification, פינצטה נקודה ארוכה שטוחה, דיואר (ים) של חנקן נוזלי (LN _2), גמיכל oolant, תיבת אחסון רשת EM, נייר סינון ללא סידן.
2. הפעל את מכשיר vitrification. הגדר את הלחות ל100% וטמפרטורה ל32 ° C. בסעיף "המסוף", הגדר את זמן כתם לאפס שניות. זה מאפשר למדריך לסופג דרך צד החלון של תא הלחות של המכונה vitrification.
3. ידית נייר סינון ללא סידן עם כפפות, שכבותיהם כך ששלושה עיתונים נערמים. חותכים את הערימה לרצועות רחבה 0.5 סנטימטר כי הם ~ עוד 2 סנטימטר. לכופף אותם בזווית של ° 90 כך שצד אחד של הנייר יש 0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר (איור 2). בעזרת פינצטה, להסיר את הנייר באמצע ומניח אותו על נייר סינון ללא סידן נוסף עד לשימוש.
4. שים את כפתור אחסון רשת בבעל הכפתור בתוך תא התהליכים. למלא את התא הפנימי של מיכל נוזל הקירור עם חנקן נוזלי ולחכות עד אידוי מוחלט. למלא את התא החיצוני של המיכל נוזל קירור דואר עם חנקן נוזלי עד שהוא משיג טמפרטורה יציבה שלימשיך לשלב הבא. למלא את התא הפנימי עם אתאן גזי טוהר גבוה שיהיה לדחוס למצב נוזלי בתוך התא מקורר.
5. הזז את הצלחת (es) מהחממה לצלחת קלקר 100 מ"מ גדול להובלה לחדר vitrification, אם לא בסביבה הקרובה. השתמש בפינצטה vitrification מיוחדת כדי לבחור את רשת EM זהירות מהצלחת. שים לב באיזה צד נוירונים גדלים על רשת EM; העמדה משנה לשלב הבא. השתמש בנעילה הזזה השחורה בפינצטה כדי לנעול מאובטח פינצטה על רשת EM.
6. הכנס את פינצטה לתוך מכונה vitrification צד שכזו של רשת EM שבנוירונים הם דבקו פרצופים לשמאל, הרחק מהחור בצד הפתיחה של המכונה vitrification. לחזור בי פינצטה מיוחדת למכונה vitrification.
7. מניחים את מיכל נוזל הקירור בבעל המתאיםשל המכונה vitrification. יש למלא אותו עם LN נאות ₂ ואתאן הנוזלי. באמצעות פקודת המסך המתאימה של המכונה vitrification, להעלות את תא נוזל הקירור כלפי מעלה עד שהוא הסמיק עם החלק התחתון של תא הלחות.
8. עם פינצטה הנקודה שטוחה, לתפוס קצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יותר (0.5 סנטימטר 0.5 x הפנים סנטימטר) הוא בניצב לפינצטה. פניה זו באה במגע ישיר עם רשת EM לסופג (איור 2). בזהירות להכניס את נייר הסינון לצד החור של תא הלחות של המכונה vitrification (איור 2 א). יציבות תצמיד את נייר רשת EM (הצד הפונה הרחק מהדגימה) ל10 שניות. מחק את הנייר אחר כך ומייד לצלול להקפיא את הדגימה באתאן הנוזלי באמצעות האוטומציה של המכונה vitrification.
9. להעביר רשת EM-התייבשות הקפואה שלך בזהירות לאחד החריצים באחדכפתורי אחסון רשת. חזור על התהליך עבור רשתות EM נוספות במנות. כפתורי אחסון רשת EM משמשים בניסויים אלה יכולים לאחסן רשתות EM מרובות התייבשות קפוא.

4. אוסף תמונה, עיבוד, וביאור

1. להמשיך לאסוף micrographs אלקטרונים 2-D ו / או סדרה להטות 3-D של ⁵ neurites באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-בתנאי במינון נמוך. תמונות 2-D נועדו להעריך את האיכות של הרשת במונחים של עובי קרח והתחומים האפשריים להיות שימושי סדרה להטות 3-D ל.
   1. במקרה זה, את כל התמונות נאספו באמצעות מצלמת CCD 4k x 4k המצורפת למיקרוסקופ אלקטרונים 200 קילו וולט מצויד בבעל העברת cryo להטות חנקן הנוזלי יחיד, בהגדלה מיקרוסקופ 20k ביעד underfocus של 7 מיקרומטר ודגימה של 4.4 A / פיקסל.
   2. כדי להשיג tomogram 3D של המדגם, לנקוט בשורה של תמונות הקרנה תוך הטיית אל המדגם באופן הדרגתיאונג ציר מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) אחד. בהתחשב בזוויות ההטיה והגדרות ניסיוניות אחרות, יש כמה תוכנות שונות זמינות כדי לאסוף את הסדרה להטות ⁵ באופן אוטומטי. הסדרה להטות 3-D מוצגת כאן נאספו באותו מיקרוסקופ באמצעות תוכנת רכישת סדרה להטות חצי אוטומטית-26 על פני טווח של -60 ° 60 ° ב 5 ° מרווחים עם מינון מצטבר של ~ 60 דואר / ^2.
2. לשחזר את סדרת ההטיה של neurites באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ²¹ כפי שתוארה קודם לכן לדוגמאות אחרות ^5,29.
3. צבע תסמן את תכונות 3-D של neurites ידי פילוח הראשון tomogram ויצירת מודל פני השטח באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 3-D כפי שתואר בעבר ^5.

לפני הקפאה והדמיה באמצעות cryo-ET, יש לנקוט בתמונות מיקרוסקופ אור של רשת EM שבו נוירונים גדלים. Neurites צריכה להיות לעין בלי חפיפה משמעותית אחד עם השני. קופסא צבעונית באיור 3A מייצגת אזור זה זנק ב להראות בהגדלה גבוהה יותר באיור 3 ב, שבי neurites משתרעת על פני סריג של הרשת. כל רשת מרובע מורכב מסרט פחמן מחורר התומך בתאי העצב וneurites. חורים אלה הם לכאורה בתמונת cryo-EM במינון נמוך שנלקחה ב4k הגדלה, אשר מציגה את גוף תא העצב כאובייקט גדול יחסית, כהה, אלקטרונים צפופים (איור 3 ג), שממנו neurites פרויקט כלפי חוץ.

חלק ממנוחת neurite מעל חור בפחמן נבחר בקופסא צבעונית באיור 3C, ודהר-בהגדלה גבוהה (20k) באיור 3D. בהגדלה זו, מבנים הסלולר פנימיים ברורים הכוללים microtubules, שלפוחית, ומיטוכונדריה צריכים להיות ברורים באופן ברור (איור 3D), במיוחד בקרח בצורה אופטימלית הרזה כמו שנוצרו על ידי ביצוע פרוטוקול זה. המבנים השחורים הכהים במרכז התמונה (איור 3D) הם חלקיקי קרח משושה שנחשבים כזיהום וצריך בדרך כלל להימנע, עם זאת, בהתחשב בכך שהם מאוד דלילים ומחוץ לneurites עצמם, הם לא מתערבים עם שיקום וצבע יאור של המבנים הפנימיים לניתוח ופרשנות (איור 4). במינון נמוך, תמונה בהגדלה נמוכה נוספת היא שמוצגת באיור 5, שממנו יכול להיות ממוקם neurite, שלאחריו ניתן לקחת כמה תמונות 2-D ודיגיטלי מאוחה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כדי ליצור מונטאז (איור 6).

הראשוניריכוז נמוך ציפוי (50,000 תאים / מיליליטר לכל צלחת) של הנוירונים ברשתות EM מאפשר לתאי עצב שהם מרווחים מספיק רחוק זה מזה, כדי להבטיח להדמיה ברורה של neurites (איור 3 ג); ריכוזים גבוהים יותר ממומלץ (> 50,000 תאים / מיליליטר לכל צלחת ) יכול לגרום לתמונות הכי מוצלח של neurites הצפופה שקשה להתחקות אחר או תכונת מרכיבים תאיים (7 ב דמויות ו7C).

איור 1. ערכה לגידול הנוירונים ברשתות EM בתוך זכוכית תחתונה מנות. () זכוכית תחתונה מנות מוצגות, באופן חלקי עם תקשורת סלולרי (ורוד). (ב) כל מנה מכילה רשת EM זהב אחד, כפי שמבט קרוב יותר מגלה. ציפוי (C) של Eרשת M עם פולי-ליזין מוצגת כצד-cutaway קריקטורה. צלחת תחתית הזכוכית מורכבת מcoverslip זכוכית מרובע שמחובר לחלק התחתון של צלחת תרבות פלסטיק, המשתרע על פתח עגול שנחצב במקור מתוך בתחתית. מנות תחתית כוס אלה גמא מעוקר ומסחרי קנה כתערובת של עוגיות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. סכמטי סופג ידני של EM רשתות עם הנוירונים דבקו. () תקריב של החריץ של המכונה vitrification הזזה כניסה (חץ שחור) ללחות / הקאמרית סופג, שבו פינצטה תוכנס למחוק את הדגימה באופן ידני. (ב)ערכת קריקטורה המראה כיצד נייר הסינון ללא סידן (0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר) צריך להיות מטופלים באמצעות פינצטה שטוחה הנקודה ומוכנסת דרך חריץ הכניסה לתא הלחות של המכונה vitrification לסופג רשת EM שבו נוירונים הם דבקו (טיפה של תקשורת סלולרי ורודה מוצגת). רשת EM מוחזקת על ידי פינצטה מיוחדת עדינה נקודה בתוך תא הלחות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. חזותי נוירונים קפוא, התייבשות במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM). (א) תמונת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 10X השטח של רשת EM שבי נוירונים עיקרי חולדה היה Gro המרכזיכנף עבור 2 שבועות. (ב) הוגדלו-בתצוגה של התיבה אקווה שמוצגת ב( א '), שבו נוירונים ותחזיות neurite גלויים (חיצים הוורודים). (ג) אלקטרונים מיקרוסקופ בהגדלה של 4K neurite מקרין החוצה מהגוף תא העצב (חץ אדום). באופן סכמטי המתאים לאזור (כלומר התיבה האדומה) בתוך אחד מריבועי הרשת שמוצגים ב( ב '). קופסא הכחולה היא הצגה מקרוב ב( ד '), שבו התכונות הפנימיות של neurite נראות בבירור ב20k הגדלה (מיטוכונדריה חץ הירוקה; microtubules חץ כתום; חץ כחול שלפוחית). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. שיקום 3-D וביאור של tomogram האקסון DRG חולדה. () פרוס טומוגרפית מתוך ערימה משוחזרת של תמונות שצולמו בזוויות הטיה שונות של האקסון DRG אחד. (ב) מקבילים ביאור 3-D של אותו האקסון. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5. תמונת cryo-EM 2-D של נוירון DRG עכברוש (מרכז שמאל) עם תחזיות אקסון (תיבה אדומה) בשעה 4k ההגדלה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

<img alt="איור 6" fo:תוכן-width = "6in" עבור: רוחב src = "/ files/ftp_upload/50783/50783fig6highres.jpg" "> "500px"
איור 6. מונטאז' של ארבע תמונות cryo-EM 2-D של האקסון DRG חולדה אחת. כל תמונה צולמה ב20k ההגדלה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 7. תמונות 2-D cryo-EM של neurites. () האקסון DRG החולדה צילמו מקרוב בסמוך לסומה התא. (B, C) ​​דוגמאות בשל צפיפות יתר של neurites ריכוז ציפוי גבוה של הנוירונים ברשתות EM. כל neurites היו שבועיים פלאש קפוא לאחר ציפוי ברשתות EM זהב. כל התמונות צולמו ב20k;. ההגדלה לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 8. שיקום 3-D וביאור של tomogram neurite היפוקמפוס חולדה. () פרוס טומוגרפית מתוך ערימה משוחזרת של תמונות שצולמו בזוויות הטיה שונות של neurite היפוקמפוס אחד. (ב) מקבילים ביאור 3-D של אותו neurite. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.