מאמר שיטה

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

DOI:

10.3791/50794

⸱

8 בדצמבר 2013

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נעשה שימוש בשיטות הקלטת הדמיה אלקטרופיזיולוגיות ופלואורסצנטיות סימולטניות כדי לחקור את תפקידם של שינויים בפוטנציאל או בזרם הממברנה בוויסות ריכוז הסידן התוך תאי. תנאים סביבתיים משתנים, כגון מחזור האור-חושך, יכולים לשנות את פעילות הרשת העצבית והעצבית ואת הביטוי של משפחה של גנים של שעון ביולוגי בתוך הגרעין הסופרכיאזמטי (SCN), מיקומו של השעון הביולוגי הראשי במוח היונקים. העברה סינפטית מעוררת מובילה לעלייה בריכוז Ca2+ הפוסט-סינפטי שמאמינים כי הוא מפעיל את מסלולי האיתות שמשנים את הביטוי הקצבי של גנים של שעון ביולוגי. פרוסות היפותלמוס המכילות את ה-SCN הוצמדו באמצעות מיקרו-אלקטרודות מלאות בתמיסה פנימית המכילה את מחוון הסידן ביס-פורה-2. לאחר שנוצר אטימה בין המיקרואלקטרודה לממברנה העצבית SCN, הממברנה נקרעה באמצעות יניקה עדינה ובדיקת הסידן התפזרה לתוך הנוירון ומילאה גם את הסומה וגם את הדנדריטים. מדידות רציומטריות כמותיות של ריכוז הסידן התוך-תאי נרשמו במקביל לפוטנציאל או זרם הממברנה. באמצעות שיטות אלה ניתן לחקור את תפקידם של שינויים בריכוז הסידן התוך תאי המיוצר על ידי פעילות סינפטית וירי פוטנציאלי פעולה של נוירונים בודדים. במצגת זו אנו מדגימים את השיטות לרישום בו זמנית של פעילות אלקטרופיזיולוגית יחד עם סידן תוך תאי מנוירונים בודדים של SCN הנשמרים בפרוסות מוח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ידוע ששינויים בביטוי גנים מתרחשים בתאי עצב כתוצאה מהאיתות הסינפטי. איתות על ידי המוליך העצבי המעורר גלוטמט יכול לדה-פולריזציה של פוטנציאל הממברנה העצבית ולהוביל בסופו של דבר לשעתוק ותרגום גנים1,2. הפעלת קולטנים יונוטרופיים על ידי גלוטמט מאפשרת ליוני סידן חוץ-תאיים להיכנס לתא, אשר נחשב כממלא תפקיד קריטי כשליח שני בהפעלת שעתוק גנים. הערכת הקשר בין פעילות חשמלית של הממברנה, כגון תדירות ירי פוטנציאלית פעולה, ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי דורשת שילוב של שתי שיטות - הידוק טלאי תא שלם והדמיה כמותית של בדיקות סידן פלואורסצנטיות3-5, מה שמאפשר לחקור את הקשר בנוירונים בודדים. טכניקת ההקלטה של תא בודד מאפשרת להקליט את הפעילות של נוירונים בודדים בחלקים הניתנים לזיהוי של המוח. טכניקת הקלטת התא השלמה מאפשרת לשלוט במתח או בזרם הממברנה ומאפשרת מניפולציה ניסיונית של זרמי תעלת יונים ספציפיים. שימוש במיקרופיפטות מלאות בבדיקות סידן פלואורסצנטיות מבטיח גם שהנוירון מלא היטב בבדיקת סידן. לטכניקה זו יש יתרון ברור בעבודה עם תכשירי פרוסות מוח מתכשירי פרוסות בוגרים, מכיוון שקשה במיוחד לטעון נוירונים אלה באמצעות בדיקות פרמונדסצנטיות נפוצות יותר של תאים ומפחיתים בעיות פלואורסצנטיות פוטנציאליותברקע 6-8.

אור הוא הדרך העיקרית שבה יונקים מכוונים את השעון הביולוגי שלהם, הממוקם בגרעין ההיפותלמי הסופרכיאזמטי (SCN). מידע אור המועבר ברשתית מועבר 9-11 דרך מערכת הרטינו-היפותלמוס (RHT) שם משתחרר גלוטמט ב-SCN12,13. גלוטמט פותח קולטנים יונוטרופיים NMDA ו-AMPA הממוקמים על נוירוני SCN המייצרים זרם של סידן ונתרן, ויוזמים מפל איתות תוך-תאי שמוביל בסופו של דבר לשינוי הביטוי של משפחה של גני שעון14-17 ושינויים בפאזה של השעון הביולוגי18-20. עם זאת, סידן יכול להיכנס לתאי עצב ישירות דרך קולטני גלוטמט יונוטרופיים או דרך דה-פולריזציה של הממברנה והפעלה של תעלות סידן תלויות מתח (VDCC)21. לכן פיתחנו פרוטוקול ניסיוני כדי לחקור את הקשר בין ריכוז הסידן התוך-תאי לפעילות החשמלית של הממברנה בתאי עצב SCN, כמו שקורה עם ירי פוטנציאלי פעולה ומקלט סינפטי22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פרוסות מוח היפותלמוסיות

  1. השג, מראש, אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לכל הליך הקשור לבעלי חיים. ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן עולים בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת חסד של בעלי חיים 2013 ואושרו מראש על ידי IACUC של אוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע.
  2. הכן 500 מ"ל ממאגר החיתוך ללא MgCl2 ו-CaCl2 (טבלה 1). מבעבעים את התמיסה עם 95% O2 ו-5% CO2 בטמפרטורת החדר ואז מוסיפים את MgCl2 ו-CaCl2 תוך כדי המשך אוורור. התאם את האוסמולריות ל -300 mOsm עם סוכרוז. האוסמולריות נמדדת באמצעות אוסמומטר לחץ אדים.
  3. הכן 1 ליטר של מדיית ההקלטה ללא MgCl2 ו-CaCl2 (טבלה 2). מבעבעים את התמיסה עם 95% O2 ו-5% CO2 ואז מוסיפים את MgCl2 ו-CaCl2 תוך כדי המשך אוורור. התאם את ה-pH ל-7.2-7.4 עם NaOH (10 N) ואת האוסמולריות ל-300 mOsm עם סוכרוז. התוספת של מאגר HEPES היא אופציונלית ושימשה לייצוב נוסף של ה-pH.
  4. ניתן לאחסן את פתרונות החיתוך וההקלטה במקרר מספר ימים לפני השימוש.
  5. מכינים 3% אגרוז ויוצקים לצלחת פטרי סטרילית (בעומק 6 מ"מ) ומקררים.
  6. חותכים שלוש קוביות אגרוז בערך 6 מ"מ x 6 מ"מ x 6 מ"מ
    7. .
  7. הרדמה עמוקה של חולדת ספראג-דולי בת ארבעה עד שמונה שבועות עם איזופלורן. בדיקת עומק ההרדמה. עומק ההרדמה נחשב מתאים כאשר אין רפלקס נסיגה של הגפה האחורית לאחר צביטה של כרית כף הרגל. לאחר הרדמה מתאימה, החולדה מורדמת על ידי עריפת ראש מהירה.
  8. הסר במהירות את המוח תוך הקפדה לחתוך תחילה את עצבי הראייה, והניח בתמיסת חיתוך קרה כקרח רוויה ב-5% CO2 ו-95% O2 והניח להתקרר למשך 2-3 דקות.
  9. חתוך את המוח. הניחו את המוח בעזרת מלקחיים על נייר סינון עגול לח (עם תמיסת חיתוך) המונח על צלחת פטרי מזכוכית המונחת על קרח.
  10. חתכו את המוח בצורה קורונלית כדי להסיר את המוח הקטן וגזע המוח שנותרו, ואז את קליפת המוח הרוסטרלית ואת הצדדים, כדי להשאיר גוש מוח המכיל את ההיפותלמוס תוך שמירה קפדנית על הצד המכיל SCN, עצבי ראייה וכיאזמה אופטית.
  11. מורחים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילי גדול מספיק כדי לחבר את המוח ואת גושי האגרוז בתא חיתוך מיקרוטום קר כקרח אך יבש.
  12. העבירו את הצד הזנבי של גוש המוח הקר כקרח כלפי מטה אל הדבק כאשר הצד המכיל את ה-SCN ממוקם לחיתוך ראשון כאשר עצבי הראייה יוצרים "V" מצביע כלפי מעלה.
  13. מניחים את קוביות האגרוז בשלושת הצדדים האחרים. מלאו את החדר במאגר חיתוך קר כקרח מבעבע ברציפות עם 5% CO2 ו-95% O2. הדבק הציאנואקרילי יתמצק עם לחות המחזיקה את המוח ואת גושי האגרוז במקומם.
  14. חותכים פרוסות היפותלמוס עטרה (בעובי 220-250 מיקרומטר) המכילות את ה-SCN עם מיקרוטום הלהב הרוטט. בדרך כלל נבחרת פרוסה שבה הכיאזמה האופטית היא בקוטר של כ-2-4 מ"מ, והיא נראית כמו פס לבן עם SCN רק גבי שמופיע כשתי "חריצות" קטנות בכיאזמה האופטית משני צדי החדרהשלישי (איור 1A).
  15. הנח את הפרוסות בתא ההקלטה (36 מעלות צלזיוס) המותקן על הבמה של מיקרוסקופ Leica DMLFS. החדר מלא בתמיסת הקלטה זורמת ברציפות (2 מ"ל לדקה) מאווררת עם 95% O2 ו-5% CO2 ומחוממת מראש עם תנור חימום מוטבע.
  16. בצע מהדק תיקון של תא שלם והקלטות הדמיית סידן בתאי עצב SCN 0.5-8 שעות לאחר הכנת הפרוסה.

2. תיקון מהדק הקלטה

  1. הכן את תמיסת האלקטרודה (תוך-תאית) במחצית מנפח המים הסופי הכולל.
  2. התאם את התמיסה ל-pH 7.3 עם KOH (1 N).
  3. מוסיפים את יתרת המים. האוסמולריות הסופית של התמיסה צריכה להיות בטווח של 280-290 mOsm.
  4. העבירו את תמיסת האלקטרודה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר, הכניסו (0.5 מ"ל) לצינורות מיקרופוגה, ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  5. הכן את תמיסת מלאי מלח ההקספוטלסיום bis-fura-2 (10 מ"מ) על ידי ערבוב של 1 מ"ג מלח הקספוטלוגים bis-fura-2 עם 99.29 מיקרוליטר של 0.2 מיקרומטר מים מסוננים.
  6. מכניסים לצינורות נפרדים (2-5 מיקרוליטר כל אחד) ומקפיאים (-20 מעלות צלזיוס).
  7. הפשירו כמות גדולה של תמיסה פנימית ואת הגשושית Ca2+ זמן קצר לפני השימוש. הוסף 2 מיקרוליטר מתמיסת מלאי ביס-פורה-2 ל-400 מיקרוליטר של התמיסה הפנימית לריכוז סידן סופי של 50 מיקרומטר. טריטואט בקצרה כדי לערבב את הפתרונות. ריכוז בדיקת הסידן (10-250 מיקרומטר) משתנה בהתאם לתכנון הניסוי ולמערכת ההדמיה. שימו לב שביס-פורה-2 מורכב משתי מולקולות פורה-2 מקושרות.
  8. משוך אלקטרודות תיקון של תא שלם, בשני שלבים לקוטר קצה חיצוני של כ-1 מיקרומטר והתנגדות של 7-10 MΩ כאשר הם מלאים בתמיסה התוך-תאית.
  9. מלא מחדש את האלקטרודה בכמה מיקרוליטר מהתמיסה הפנימית המכילה את בדיקת הסידן המסוננת במסנן מזרק 4 מ"מ (0.2 מיקרומטר) לדגימות בנפח נמוך דרך צינור מיקרופיל.
  10. הפעל כמות קטנה של לחץ חיובי על האלקטרודה כשהיא מונחית לתוך תא ההקלטה תחת תאורת אור אדום תוך כדי צפייה על צג וידאו.
  11. הנח את המיקרו-אלקטרודה מעל ה-SCN באמצעות יעד הספק נמוך (4X). ה-SCN מזוהה כשני אזורים שקופים משני צידי החדר השלישי והגב לכיאזמה האופטית (איור 1A).
  12. העבר את המיקרוסקופ להגדלה בעוצמה גבוהה (40X או 63X). ניתן למקד תת-אזורים של ה-SCN ונוירוני SCN בודדים לרישום בהגדלה גבוהה יותר.
  13. הפעל לחץ חיובי עדין על המיקרואלקטרודה כשהיא מתקדמת על פני השטח של נוירון.
  14. הפעל לחץ שלילי עדין על המיקרו-אלקטרודה ליצירת אטימה עם התנגדות של 3-10 GΩ.
  15. כוונן את מתח הממברנה ל-60 mV עם המגבר הנשלט באמצעות תוכנת רכישה.
  16. הפעל לחץ שלילי נוסף על האלקטרודה כדי לקרוע את קרום התא למצב תא שלם.
  17. עם הכניסה למצב תא שלם, הנוירונים של SCN, סומה ודנדריטים מתמלאים בבדיקה פלואורסצנטית.
  18. מתח הממברנה נמדד במצב מהדק זרם או זרם במצב מהדק מתח בזמן שנתוני תמונת בדיקת הסידן מנוטרים ומאוחסנים (מתואר להלן). צפה בתמונות שנרכשו יחד עם גרף של נתוני פלואורסצנציה ביחס של 340 ננומטר/380 ננומטר במהלך הניסוי.

3. מדידת Ca2+ תוך-תאי

  1. מדידות Ca2+ כמותיות מתקבלות על ידי הקלטת זוג תמונות על ידי ריגוש מהיר של הרקמה עם אור UV ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר באמצעות מונוכרונומטר עם רוחב פס של 10 ננומטר ומועברות דרך מסנן אופטי UG11 כדי להגביל אורכי גל הרמוניים מעל 400 ננומטר, 400 ננומטר DCLP דיכרואי ונפלט אור דרך מסנן פליטה של 510±40 ננומטר.
  2. התמונות נרכשות באמצעות מצלמת CCD מקוררת עם זמן רכישה ו-binning מותאמים כדי למזער את ההלבנה ולמקסם את מהירות ההקלטה.
  3. תוכנת הדמיה כמותית משמשת לרכישה והצגה של התמונות.
  4. בחר אזורי עניין מהתמונה הראשונית להמרה לנתוני יחידת עוצמת פלואורסצנטיות יחסית (כלומר סומה, דנדריט וכו'). בחרו גם אזור למדידת הקרינה ברקע (איור 1B).
  5. תמונות גולמיות ונתונים אופטיים כמותיים נשמרים ללא הרף במהלך הניסוי. לאחר הניסוי התמונות השמורות בדרך כלל מנותחות מחדש כאשר ניתן להקדיש זמן רב יותר לבחירה מדויקת יותר של אזורי העניין שיש לכמת.
  6. ניתן להציג את הנתונים כריכוז הסידן התוך תאי המשוער (Est[Ca2+]i). היחס (R) של האור הנפלט בעקבות עירור וחיסור רקע ב-340 ננומטר חלקי 380 ננומטר יחד עם הקרינה המקסימלית והמינימלית ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר משמש לחישוב ריכוז הסידן4. חיסור רקע וחישובים אחרים מבוצעים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים.
  7. ניתן לבצע קביעה במבחנה של פלואורסצנציה מקסימלית ומינימלית של ביס-פורה-2 באמצעות 10 מ"מ CaCl2 עבור Ca2+ קשור ו-10 מ"מ EGTA עבור תנאים חופשיים של Ca2+. קבוע הניתוק Ca2+, Kd של הגשושית נחשב ל-370 ננומטר עבור ביס-פורה-2 (Invitrogen).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוסות מוח היפותלמוסיות, רשמנו בו זמנית שינויים בסידן התוך-תאי במצב תא שלם בתנאי מהדק מתח וזרם. המיקרו-אלקטרודה המוצגת באיור 1A מונמכת למקומה בהגדלה גבוהה (מטרות UV 40X או 63X) עם כמות קטנה של לחץ חיובי מופעל. לאחר נגיעה בנוירון, נוצר חותם ג'יגה-אום עם יניקה עדינה. במצב מהדק מתח לאחר הגדרת פוטנציאל קרום התא ל-60 mV, יניקה נוספת שוברת את הממברנה ויוצרת את כל תצורת התא. הנוירון יתמלא במהירות בבדיקה כאשר הוא נראה על הצג. ניתן לדמיין תהליכים דנדריטיים במישור מוקד דומה לזה של הסומה (איור 1A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות שתוארו לעיל מספקות כלי רב עוצמה לרישום בו זמנית של הקשר בין הפעילות החשמלית של קרום הנוירונים לריכוז הסידן התוך תאי. לשיטה מספר חוזקות בכך שהיא משלבת שתי שיטות מאופיינות היטב - הקלטת מהדק תיקון תא שלם ומדידת סידן תוך תאי באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. הגישה שלנו דומה לאלה שתוארו על ידי חוקרים אחרים6,23.

יש לקחת בחשבון מספר פריטים בעת השימוש בשיטה. הראשון הוא השימוש בכל תצורת תיקון התא, מה שמוביל לדיאליזה של התוכן הסלולרי עם תמיסת המיקרואלקטרודה התוך-תאית. הדיאליזה יכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה מומנה על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (GM096972).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NaClפישר סיינטיפיק ושות'S271-3
KClפישר סיינטיפיק ושות'P217-500
NaH2PO4• H2OSigma Chemical Co.S-9638
MgCl2• 6H2OFisher Scientific Co.M33-500
CaCl2• 2H2OFisher Scientific Co.C79-500
D-גלוקוזפישר סיינטיפיק ושות'D16-500
NaHCO3Fisher Scientific Co.S233-500
סוכרוזפישר סיינטיפיק ושות'S5-500
אשלגן D-גלוקונאטסיגמא-אולדריץ'G4500
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח דיפוטסיום דיהידרטסיגמא-אולדריץ'A8937
גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח טריססיגמא-אולדריץ'G9002
אגרוז (אולטרה-טהור)לייף טכנולוגיות15510-027ג'ל נקבוב לתוך צלחת פטרי סטרילית שכבה בעובי 6 מ"מ
KOHSigma-AldrichP-6310
NaOHSigma-AldrichS-5881
Bis-fura-2, מלח הקספוטגןInvitrogenB6810תא Impermean
שםהציוד מספרקטלוגיהחברה תגובות
MicrotomeLeicaVT1000Sחיתוך רקמות
דבק ציאנואקרילי (Roti-Coll1)Carl Roth GmbH+CoArt-Nr. 0258.1
חולץ מיקרואלקטרודותNarshige International ארה"בPP-83
מיקרואלקטרודות צינורות נימייםמכשירי דיוק עולמיים1B150F-4
מיקרופיל 34 גרםמכשירי דיוק עולמייםMF34G-5
מסנן מזרקCorning#431212
מיקרוסקופLeicaDM LFSעם מטרות 4X, 40X UV ו-63X UV, ואפיפלואורסצנטי
מצלמת CCDHamamatsuORCA ER12 סיביות CCD
Fura-2 קוביית מסנןChroma71500Aסט עם מסנן UG11
פוליכרום IVTill Photonics GmBHמונוכרונומטר
משקפי בטיחות חוסמים אולטרה סגולאולטרה סגולים
מגבר EPC-9HEKA Eletronik
Metafluorמולקולרייםתוכנת הדמיה
PatchmasterHEKA Eletronikתוכנת רכישת נתונים
איגור גרסה 6אלקטרופיזיולוגיה & Ca2+ ניתוח נתונים
VAPRO 5520Westcorאוסמומטר לחץ אדים
מוצרים מכשירים גל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
  2. Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells. J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).
  3. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  4. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  5. Higley, M. J., Sabatini, B. L. Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations. Neuron. 59, 902-913 (2008).
  6. Colwell, C. S. Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).
  7. Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).
  8. Irwin, R. P., Allen, C. N. GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network. Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).
  9. Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock. Science. 295, 1070-1073 (2002).
  10. Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 295, 1065-1070 (2002).
  11. Hartwick, A. T., et al. Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells. J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).
  12. Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).
  13. Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).
  14. Shigeyoshi, Y., et al. Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript. Cell. 91, 1043-1053 (1997).
  15. Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light. Cell. 91, 1055-1064 (1997).
  16. Yan, L., Silver, R. Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts. Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).
  17. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation. Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).
  18. Ding, J. M., et al. Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 266, 1713-1717 (1994).
  19. Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide. J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).
  20. Ding, J. M., et al. A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock. Nature. 394, 381-384 (1998).
  21. Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse. J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).
  22. Irwin, R. P., Allen, C. N. Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons. J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).
  23. Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging. Methods. 18, 215-221 (1999).
  24. Spruston, N., Johnston, D. Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).
  25. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
  26. Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).
  27. Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons. J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).
  28. Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations. Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).
  29. Poenie, M. Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction. Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch ClampingBis fura 2

מאמרים קשורים