מאמר שיטה

ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים המופקים משפכים: גידול, תחזוקה ואפיון בסיסי

16.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

29 בדצמבר 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

במאמר זה

סיכום

מודגמת צמיחה כרונואמפרומטרית של ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים אנודיים בכור אצווה מוזנת באמצעות מערך של שלוש אלקטרודות, הנשלט על ידי פוטנציוסטט. העברת האלקטרונים החוץ-תאית מאופיינת באמצעות וולטמטריה מחזורית בנוכחות תורם האלקטרונים ובהיעדר תורם האלקטרונים. מודגם ניתוח נתונים בסיסי.

תקציר

הצמיחה של ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים אנודיים מחיסון שפכים בכור אצווה מוזנת מודגמת באמצעות מערך של שלוש אלקטרודות הנשלט על ידי פוטנציוסטט. בכך השימוש בפוטנציוסטטים מאפשר התאמה מדויקת של פוטנציאל האלקטרודה ומבטיח תנאי תרבות מיקרוביאלית הניתנים לשחזור. במהלך הגידול הייצור הנוכחי מנוטר באמצעות כרונואמפרומטריה (CA). בהתבסס על נתונים אלה, צפיפות הזרם המקסימלית (jmax) והיעילות הקולומבית (CE) נדונים כמדדים לאפיון הביצועים הביו-אלקטרו-קטליטיים. וולטמטריה מחזורית (CV), לא הרסנית, כלומר שיטה לא פולשנית משמשת לחקר העברת אלקטרונים חוץ-תאית (EET) של חיידקים אלקטרואקטיביים. מדידות CV מבוצעות על אלקטרודות ביופילם אנודיות בנוכחות המצע המיקרוביאלי, כלומר תנאי תחלופה, ובהיעדר המצע, כלומר תנאי אי-תחלופה, תוך שימוש בקצבי סריקה שונים. לאחר מכן, ניתוח נתונים מודגם ופרמטרים תרמודינמיים בסיסיים של ה-EET המיקרוביאלי נגזרים ומוסברים: פוטנציאל שיא (Ep), צפיפות זרם שיא (jp), פוטנציאל פורמלי (Ef) והפרדת שיא (ΔEp). בנוסף, מתייחסים למגבלות השיטה ולניתוח הנתונים המתקדם ביותר. לפיכך, מאמר וידאו זה יספק מדריך לשלבי הניסוי הבסיסיים ולניתוח הנתונים הבסיסיים.

מבוא

הבהרת היסודות של העברת אלקטרונים חוץ-תאית מיקרוביאלית (EET) וניצולה במערכות מהונדסות היא תחום חיוני וגדל במהירות של מחקר ופיתוח1-3. חקר המיקרואורגניזמים האלקטרואקטיביים (או הביו-אלקטרוקטליטיים או הפעילים האלקטרוכימיים) הללו, כולל זנים טהורים כמו גם תרבויות משותפות מוגדרות וקונסורציום מורכב, דורש ארסנל מורכב של טכניקות, שיטות ופרוטוקולים4. שיטות אלו נובעות מדיסציפלינות מדעיות מגוונות, כגון אלקטרוכימיה, מדעי החומרים, מיקרוביולוגיה, ומספקות תובנות ברמות היררכיות שונות, כלומר. מכל הביופילם המיקרוביאלי ועד למולקולות בודדות. לפיכך, אלקטרוכימיה ושיטות אלקטרוכימיות מייצגות את הבסיס לכל הפעילויות.

באופן מסורתי, הגדרות מסוג תאי דלק שימשו לעתים קרובות לגידול ותחזוקה של תרביות מיקרוביאליות אלקטרואקטיביות בארכיטיפ של מערכות מהונדסות אלה: תאי דלק מיקרוביאליים (MFCs)5. למרבה הצער, סוגים אלה של MFCs לרוב לא אפשרו ניטור או אפילו שליטה על הפוטנציאל של אלקטרודה בודדת ולכן התאפשרו רק תובנות מוגבלות בתהליכי האלקטרודה - רק מתח התא דווח. כעת מכירים יותר ויותר בכך שהניטור והבקרה הפרטניים של הפוטנציאלים של אלקטרודות בודדות ב-MFC מייצגים יתרון ברור, לא רק למחקר בסיסי אלא גם להנדסה. יתר על כן, עם גיוון היישומים של טכנולוגיות אלקטרוכימיות מיקרוביאליות הכוללות כעת, למשל, תיקון, התפלה, סינתזות ואפילו מחשוב ביולוגי, במה שמכונה מערכות ביו-אלקטרוכימיות מיקרוביאליות (BES)2,6,7 בקרה חיצונית על פוטנציאל אלקטרודות בודדות היא לרוב משמעותית. שליטה זו מושגת בדרך כלל על ידי שימוש במקורות כוח חיצוניים או פוטנציוסטטים. בכך השימוש בפוטנציוסטטים מאפשר - בניגוד לסוגים אחרים של הגדרות - התאמה מדויקת של פוטנציאל האלקטרודה הבודדת. יש לכך חשיבות גבוהה מכיוון שהאלקטרודה מייצגת את מקבל האלקטרונים המיקרוביאלי הסופי (לאנודות) או תורם האלקטרונים (לקתודה) של העברת האלקטרונים החוץ-תאית. איור 1 מתאר את המצב הנוכחי של הידע על ה-EET המיקרוביאלי באנודות - ראה לפרטים למשל 2,4,6,8,9 ה-EET בקתודה עדיין לא מנוצל ברובו10.

לפיכך, השליטה בפוטנציאל האלקטרודה מאפשרת לא רק שימוש בתנאי תרבות מיקרוביאלית הניתנים לשחזור אלא גם את התאמתו במונחים של תרמודינמיקה EET11. במאמר זה מודגמת כיצד ניתן לחלץ את הפרמטרים האופייניים של ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים מניסויי כור אצווה באמצעות כרונואמפרומטריה (CA) ווולטמטריה מחזורית (CV). זה כולל את פרמטרי הביצועים, צפיפות זרם מקסימלית (jmax) ונצילות קולומבית (CE) כמו גם מאפייני EET. כאן יהיה במוקד זיהוי הפוטנציאלים הפורמליים (Ef) של אתרי העברת אלקטרונים אפשריים וממשיים. מיצוי הפרמטרים הללו מוצג בדוגמה של ביופילמים מתרבות מעורבת שמקורם בשפכים הנשלטים על ידי מפרט Geobacter. 12 ביופילמים אלה שמקורם בשפכים מתקבלים על ידי הליך ברירה אלקטרוכימי פשוט כפי שהודגם על ידי קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם13-16.

טכניקות אלקטרוכימיות דינמיות לחקר העברת אלקטרונים חוץ-תאית מיקרוביאלית

לאפיון תרמודינמי של ה-EET של תרביות מיקרוביאליות אלקטרואקטיביות יש צורך בטכניקות אלקטרוכימיות דינמיות. באופן כללי טכניקות אלו כוללות פוטנציאל מבוקר, כלומר וולטמטרי, ומבוקר זרם, כלומר גלוונודינמיקה, טכניקות17. לפיכך, הטכניקות המבוקרות הפוטנציאליות נפוצות יותר וכוללות למשל, וולטמטריית גל מרובע ווולטמטריית סוויפ ליניארית18. עם זאת, הפופולרי ביותר הוא וולטמטריה מחזורית (CV)19,20. CV ידוע ונפוץ בתחומים שונים של אלקטרוכימיה, החל מחקר סוללות דרך מדעי החומרים ועד לביו-אלקטרוכימיה של אנזימים21. ניתן לתארך את היישום שלו על תאים מיקרוביאליים חיים רק יותר מעשוראחד 22 וגדל משמעותית במהלך השנים האחרונות23,24. במיוחד השילוב של CV ושיטות ספקטרוסקופיות סיפק תובנות חסרות תקדים לגבי מנגנוני ה-EET ואופיו המולקולרי, למשל 25,26 במקביל הורחבה והועמקה המסגרת התיאורטית למיצוי המאפיינים התרמודינמיים והתיאורטיים של ה-EET המיקרוביאלי27-30. לעומת זאת, טיפול שגוי ניסיוני או ניתוח נתונים לא מספק מעכבים לעתים קרובות את היישום המתאים של CV בתחום הביו-אלקטרוכימיה המיקרוביאלית. לכן, בנוסף לסדנאות (למשל ב-EU-ISMET 2012) והדרכות19, מאמר וידאו זה יספק מדריך בסיסי לביצוע ניסויים וולטמטריים מחזוריים על חיידקים אלקטרואקטיביים. בכך הוא מתמקד בשלבי הניסוי הבסיסיים ובניתוח הנתונים הבסיסיים ואינו מיועד לספק את הפרוטוקולים העדכניים ביותר של ניתוח קינטי. הנקודות הסופיות החשובות ביותר לדיון הבא מסוכמות בתיבה 1 (מעובדת מהרניש ופרגיה19 ושונה).

פרוטוקול

מכיוון שהליך הבחירה בכור הביו-אלקטרוכימי הוא ספציפי מאוד בשל בחירת המצע והתנאים האנוקסיים, עבודה בתנאים סטריליים אינה הכרחית עבור הדוגמה המודגמת.

1. הכנת מצע גידול

  1. הכן כמות מתאימה של מצע הגידול באמצעות מאגר פוספט על פי קים ואחרים.13 (ראה טבלה 1). כאן, נתרן אצטט (10 מ"מ) משמש כמצע. אמצעי הגידול המשמש במאמר זה הוא רק דוגמה אחת, ובהתאם למטרת הניסוי יכול להשתנות במרכיביו.
  2. הוסף 1 מ"ל מי שפכים ראשוניים לכל 20 מ"ל מצע גידול כחיסון. דגימת השפכים נלקחת ממתקן טיהור שפכים עירוני לאחר הסינון המכני (ראה למשל איור 2) וניתן לאחסן אותה עד שלושה חודשים עד לשימוש במיכל סגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס < > (הערה: בהתאם למטרת הניסוי, ספירת התאים הראשונית המדויקת יכולה להיות חשובה ולאחר מכן יש לקבוע אותה. בדוגמה המודגמת, ספירת התאים הראשונית אינה חשובה, מכיוון שהביופילם מגיע לתנאים של מצב יציב.)
  3. שטפו את המדיום כולל החיסון בחנקן למשך 30 דקות לפחות כדי לאוורר אותו, על ידי החדרת מחט למדיום והפעלת זרם החנקן. הזרם צריך להיות חזק מספיק כדי שתוכלו לצפות בערבוב מלא של המדיום.
    (הערה: בהתאם לנפח המדיום יש אפילו לשקול להאריך את זמן הפחתת האוויר. במהלך הגדרת הפחתת האוורור כור האצווה המוזנת (שלבים 2.1-2.2))

2. הגדרת כור אצווה פד

  1. קח כלי כור מתאים- כאן נעשה שימוש בבקבוק תחתון עגול בעל 4 צווארים עם 4 צווארים.
    (הערה: באופן כללי לכלי השיט צריכים להיות לפחות ארבעה כניסות. אלה נחוצים לשלוש האלקטרודות ולהחלפת דגימה/מדיה. ניתן להזניח את נפחי הגז המיוצרים כאשר הכור נפתח באופן קבוע עקב דגימה או שינוי בינוני, לחלופין יש להתקין מונה בועות. על מנת למנוע צמיחה פוטוטרופית לא רצויה, יש להגן על הכורים מפני חשיפה ישירה לאור.)
  2. להגדרת שלוש האלקטרודות (ראה איור 3 וסעיף 3 לפרטים) הנח את אלקטרודת הייחוס (RE) (כאן Ag/AgCl, sat. KCl, 0.197 V לעומת SHE), האלקטרודה העובדת (WE) והאלקטרודה הנגדית (CE) בבקבוק דרך כניסות בודדות באמצעות פקקי סיליקון - אטום אטום לאוויר.
    (הערה: כפי שמשתמשים במוטות גרפיט WE ו- CE. חוט האלקטרודות נמשך דרך תקע הסיליקון ומקובע חיצונית. אלקטרודת הייחוס מוכנסת דרך תקע הסיליקון דרך חור קדוח. כדי למנוע קצר חשמלי, וודאו כי אין מגע פיזי של האלקטרודות, גם בזמן ערבוב או מחזור מדיה. הניחו את האלקטרודות שהן מכוסות לחלוטין בתמיסה בינונית. לאיטום, עטפו את פקק הסיליקון של כל כניסה עם Parafilm.)
  3. יוצקים את מצע הגידול כולל החיסון (כאן 250 מ"ל) דרך פתח הדגימה לתוך הכור תוך שטיפה בחנקן.
  4. סגור את הכניסה האחרונה עם פקק סיליקון ואטום אותו אטום לאוויר. הערה: עקבות חמצן לא יפגעו בביופילמים של המינים המעורבים. הם מסוגלים לעמוד ואף לצרוך רמות נמוכות של חמצן, מה שבתורו עשוי להפחית את ה-CE.

3. גידול ביופילם כרונואמפרומטרי

  1. חבר את האלקטרודות לכבלים המתאימים של הפוטנציוסטט. הנח את הכלי בתא מבוקר טמפרטורה, כאן משתמשים ב-35 מעלות צלזיוס31, על מנת להבטיח תנאי סביבה קבועים.
  2. פתח את התוכנה כדי לשלוט בפוטנציוסטט ובחר את הטכניקה: כרונואמפרומטריה. הגדר את הפרמטרים לדוגמה כדלקמן: פוטנציאל קבוע EWE של 0.2 V (לעומת Ag/AgCl) למשך t של 500 שעות (≈ 20 יום). הזרם נרשם בשלבי זמן dti כל דקה.
    הערה: בחירת הפוטנציאל המיושם תלויה במערכת/מיקרואורגניזם הנחקר. בדרך כלל תהליכי אנודה נחקרים בפוטנציאל חיובי ותהליכי קתודה בפוטנציאל שלילי. ניתן גם להסיק פוטנציאל מתאים מהפוטנציאלים הסטנדרטיים של תורם/מקבל האלקטרונים והפוטנציאל הפורמלי של אתר העברת האלקטרונים המיקרוביאלי הצפוי, כאן כנקודת התחלה, אנא עיין בספרות העדכנית.
  3. התחל את הכרונואמפרומטריה. גרף של הזרם הנמדד לאורך זמן משורטט על ידי התוכנה, הזרם המקסימלי הנצפה (imax) הוא פרמטר מקוון חשוב, כפי שנדון בסעיפים 4 ו-5.

4. תחזוקת ביופילם

  1. בהתאם לתנאי הסביבה, למשל הטמפרטורה, זרם חמצוני מתחיל לזרום ומגיע למישור (ראה איור 4). לאחר שהגעתם שוב לזרם אפס, השהה את המדידה הכרונואמפרומטרית וחדש את התמיסה הבינונית. לצמיחה מהירה יותר של ביופילם, החלף את המדיום מיד לאחר הגעה למישור הזרם המרבי. פתח את יציאת הדגימה ובזהירות, מבלי להרוס את הביופילם הדק, פרוק את המדיום. תוך כדי מילוי המדיום, יש לשטוף שוב בחנקן. סגור את יציאת הדגימה ואטום אטום לאוויר.
  2. חזור על ההליך של שלב 4.1. עד שזרם החמצון המרבי מגיע למצב יציב (ראה איור 4).
    (הערה: מאמינים כי imax קבוע מצביע על היווצרות ביופילם יציבה במצב יציב.)
  3. קח דגימות של 1 מ"ל של תמיסות המדיום הטריות והמוחלפות לניתוח מצע, למשל על ידי HPLC. ריכוז הסובסטרט הראשוני (אצטט) (c0) כמו גם ריכוז תמיסת הסובסטרט הנותרת (c1) נדרשים לאחר מכן לחישובי יעילות (ראה סעיף ניתוח נתונים).
    הערה: כדי להשיג תוצאות ללא שינוי, למשל עקב צריכת מצע נוספת, נתח את דגימות המצע באופן מיידי. אם זה לא אפשרי, אחסן את הדגימות במקפיא בטמפרטורה של -18 מעלות צלזיוס לפחות למשך לא יותר מחודש.)

5. יישום של וולטמטריה מחזורית לחקר EET

  1. בצע וולטמטריה מחזורית במקסימום ובמינימום של זרימת הזרם כפי שמצוין (איור 4). בהתאם לשאלת העניין, קורות החיים מבוצעים בדרך כלל כאשר המערכת הגיעה למצב יציב כדי לקבל תוצאות דומות. (הערה: יצירת הזרם נקראת תנאי תחלופה והיא קשורה לחמצון המיקרוביאלי של המצע ולהעברת אלקטרונים לאחר מכן: ביו-אלקטרוקטליזה מיקרוביאלית; ואילו קורות החיים שאינם תחלופה מבוצעים בזרימת זרם (כמעט) אפס ב-CA.)
  2. בחר בתוכנת בקרת הפוטנציוסטט את הטכניקה: וולטמטריה מחזורית, והגדר את הפרמטרים המתאימים, כאן למשל: פוטנציאל התחלתי של EWE עד Ei של -0.5 V לעומת RE עם קצב סריקה v=dE/dt של 1 mV/sec לפוטנציאל קודקוד E1 של 0.3 V לעומת RE ובחזרה לפוטנציאל ההתחלתי E2 = Ei של -0.5 V.
    הערה: בעת שימוש בוולטמטריה מחזורית, המתח המופעל ב-WE משתנה באופן ליניארי עם הזמן על ידי הפוטנציוסטט (ראה איור 5) - תיבה 2 מספקת כללים עקרוניים לבחירת פרמטרי הניסוי ופתרון בעיות).
  3. התחילו את הוולטמטריה המחזורית ורשמו כמה מחזורים שצריך כדי לבצע קורות חיים ניתנים לשחזור. בדרך כלל, נדרשים לפחות 3 מחזורים. התרשים המתקבל נקרא וולטמוגרפיה מחזורית (ראו גם איור 7). הערה: בהתאם לתנאי המדידה, ניתן לקבל מידע שונה כפי שמודגם בסעיף הבא.

6. התוויית נתונים

כאן דנים רק בשרטוט הנתונים. מאמר מפורט יותר מופיע בחלק הבא.

  1. השתמש בתוכנת ניתוח נתונים מתאימה, כאן כל הנתונים מיוצאים כטקסט ומיובאים כקובץ ASCII.
  2. חשב והשתמש בצפיפות זרם מועדפת (j) ולא בזרמים מוחלטים (i).
    (הערה: עם זאת, מכיוון שקיימים פרוטוקולים שונים לחישוב j, הבהירו באיזה מהם נעשה שימוש. כאן צפיפות הזרם לכל גיאומטרי, כלומר מוקרן, נעשה שימוש בשטח הפנים של האלקטרודה.)
  3. כרונואמפרומטריה: שרטט את צפיפות הזרם הנמדדת כפונקציה של הזמן.
  4. וולטמטריה מחזורית: שרטט את צפיפות הזרם הנמדדת כפונקציה של הפוטנציאל של ה-WE Ewe.

תוצאות

1. כרונו-אמפרומטריה

ממדידות כרונו-אמפרומטריות ניתן לחשב שני מאפיינים תפעוליים: צפיפות הזרם המקסימלית (נראה שההודעה שלך ריקה או מכילה רק את האות "j". אנא ספק את הטקסט המדעי באנגלית שברצונך לתרגם לעברית, ואשמח לבצע את התרגום במקצועיות ובהתאם להנחיות שסיפקת.מקסימום), כלומר זרימת האלקטרונים המקסימלית לשנייה, והנצילות הקולומבית (אלקטרופורזה קפילרית), כלומרזרימת הזרם הכוללת ביחס לתסבסב שנצרך. איור 4 מציג עקומת גדילה טיפוסית של ביופילם בשיטת כרונו-אמפרומטריה לאורך מספר מחזורי גדילה באמצעות כור fed-batch. לאחר שלב השיהוי (lag-phase) הראשוני, מתחיל מקסימום ראשון של צפיפות זרם. לאחר מכן הזרם פוחת שוב עקב דלדול התסבכת (substrate). כאשר זרימת הזרם היא (כמעט) אפס, המצע מוחלף כפי שצוין. לאחר חידוש זה של התסבכת, צפיפות הזרם עולה שוב, וצפיפות הזרם המקסימלית הבאה גבוהה מזו הראשונה. לאחר מספר מחזורי גדילה ג'מקסימלי קבוע – מה שמעיד על היווצרות ביופילם במצב יציב (steady-state)14ככל שהמצב היציב (steady state) ג'מקסימום הערך תלוי במספר פרמטרים, למשל חומר האלקטרודה, טמפרטורת הכור והרכב הביופילם, נחשבים לעיתים קרובות כמאפיין של מערכת מסוימת של ביופילם מיקרוביאל אלקטרו-אקטיבי/אלקטרודה. (במקרה של כורי זרימה לא נראה שהקלט מכיל רק את האות "j". אנא ספק את הטקסט המדעי המלא באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.מקסימום, אך נעשה שימוש בצפיפות זרם קבועה במצב יציב). המאפיין התפעולי השני הוא הנצילות הקולומבית (CE) (משוואה 1). זהו מספר האלקטרונים שנרשם כזרם חשמלי זורם, שאלוןp לכל מחזור הזנה (fed-batch), ביחס למספר המקסימלי התאורטי של אלקטרונים שאלוןth, החושב על סמך צריכת התסביך במהלך מחזור זה.

נוסחת שיווי משקל סטטי CE=QP/Qth×100; חישוב נצילות בדיאגרמת תהליך.

(משוואה 1)

ניתן להפיק את סך המטען שהועבר על ידי אינטגרציה של עקומת ה-CA (ראה גם איור 6):

חישוב מטען חשמלי, משוואה, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), שיטת אינטגרציה.

(משוואה 2)

המטען החשמלי האפשרי מבחינה תיאורטית מחושב לפי חוק פאראדיי:

משוואת תרמודינמיקה Qth=ΔcVzF, ניתוח פוטנציאל כימי, לשימוש חינוכי.

(משוואה 3)

כאשר V הוא נפח מדיום הגידול, F הוא קבוע פאראדיי (F = 96,485.34 C/mol), z הוא מספר האלקטרונים השתחררו מהסובסטרט המחוסן (במקרה של אצטט, 8 אלקטרונים משתחררים במהלך חמצון ל-CO2) ו-Δc = c0-c1, המייצג את צריכת הסובסטרט (נקבע באמצעות שיטות ניתוח כימיות, למשל באמצעות HPLC).

2. וולטמטריה מחזורית:

וולטמוגרמות מחזוריות נרשמות עבור תנאי nonturnover ועבור תנאי turnover (כפי שמוצג ב-איור 4). בשני המקרים ניתן להפיק סוגים שונים של מידע. בהמשך נדון כיצד ניתן לזהות אתרי EET פוטנציאליים ואתרי EET פעילים.

2.1 תנאי אי-מחזור (Nonturnover) – זיהוי אתרי EET פוטנציאליים:

איור 7 מציג מקרי CV טיפוסיים עבור תנאים ללא תחלופה, כלומרבהיעדרו של סובסטרט. איור 7A מציג את ה-CV של ביופילם עבור קצבי סריקה גבוהים (כאן 50 mV/sec), שבהם מופיע רק זוג שיאים אחד, ולכן פוטנציאל פורמלי אחד הf ניתן לזהות. באופן כללי, ניתן לחשב את הפוטנציאל הפורמלי של זוג חמצון-חיזור מתוך פוטנציאל השיא של שיא החמצון הpA ושיא הרדוקציה של המינים הרלוונטיים הpC על ידי חישוב הממוצע האריתמטי (ראו גם איור 7C):

משוואת אלקטרוכימיה: Ej = (EpA + Epc)/2, ניתוח פוטנציאל חמצון-חיזור במחקרי וולטמטריה.

(משוואה 4)

בעת החלת קצב סריקה נמוך מספיק על אותו ביופילם (במקרה זה 1 mV/sec), ניתן לזהות עד ארבעה זוגות חמצון-חיזור (הפוטנציאלים הפורמליים המתאימים מצוינים ב-איור 7B). הסיבה לכך היא שזרם הרקע הקיבולי פוחת כאשר משתמשים בקצבי סריקה נמוכים יותר, ראו גם תיבה 1 ו-לדוגמה17,21 לפרטים. עם זאת, ה-CV ללא מחזור (nonturnover) מראה רק את כל התרכובות הפעילות חמצונית-חיזוקית על האלקטרודה, ולכן את ה-Ef של אתרי ה-EET הפוטנציאליים. רק ניתוח של ה-CV במצב מחזור (turnover) מספק את ה-Ef של אתרי העברת ה-EET הפעילים (ראו שלב 2.2.).

בעת ניתוח מעמיק יותר של ה-CVs שאינם במצב מחזור (nonturnover), ניתן לנתח פרמטרים מאפיינים אחרים, כגון הפרדת שיאים ΔEp (משוואה 5) או זרם שיא מקסימלי ipA וזרם שיא מינימלי ipC (ראו איור 7C).

משוואת שיווי משקל סטטי ΔEP=EpA-EpC; תרשים נוסחה למטרות לימודיות.

(משוואה 5)

פרמטרים אלו, במיוחד כאשר הם נרשמים עבור קצבי סריקה שונים, יכולים לשמש לאנליזה מכניסטית וקינטית של תהליכי העברת אלקטרונים באלקטרודות. עם זאת, אנליזה קינטית זו, המבוססת היטב עבור מערכות כימיות, אינה פשוטה עבור ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרו-אקטיביים, ראו e.g.19,30

  1. תנאי מחזור – זיהוי אתרי EET בפועל:

בעת ביצוע מדידת CV בנוכחות של סובסטרט מתקבל CV של מחזור (turnover CV) (ראו איור 8A). לאחר שרטוט הנתונים ניתן לראות את העקומה הטיפוסית בצורת S, המכונה ביואלקטרוקטליטית17-19. בניתוח נוסף של הנתונים, המקסימום של הנגזרת הראשונה, כלומר נקודת נקודת ההתכופפות (inflection point) של עקומת ה-CV, מספקת את הפוטנציאל הפורמלי Ef של אתרי ה-EET הפעילים (ראו איור 8B). במקרה של ביופילם צעיר, כלומר דק, הנשלט על ידי Geobacteraceae, כאן 168 שעות לאחר תחילת CA, ניתן להבחין בשתי נקודות התכופפות. לאחר מכן, הנגזרת מראה שני מקסימומים התואמים לפוטנציאל הפורמלי של אתרי EET פעילים ביואלקטרוקטליטית: -0.376 V ו- -0.295 V לעומת Ag/AgCl (sat. KCl, 0.197 V לעומת SHE). באיור 7B אתרים אלו מכונים Ef,2 ו-Ef,3, בהתאמה. ממצא זה מראה גם כי תהליכי החמצון-חיזור הקשורים לפוטנציאלים הפורמליים Ef,1 ו-Ef,4 (ב-CV ללא מחזור) אינם קשורים לביואלקטרוקטליזה. ככל שהביופילם גדל ונהיה עבה יותר, ה-CV מראה רק נקודת התכופפות אחת, כלומר מקסימום אחד בעקומת הנגזרת. פוטנציאל פורמלי זה Ef, שכרגע הוא -0.32 V לעומת Ag/AgCl (sat KCl), שווה (בערך) לממוצע האריתמטי של שני הפוטנציאלים הפורמליים שיוחסו ל-EET של הביופילם הדק (למשל כאן Ef,2 ו-Ef,3) – ראו איור 9. הדבר מראה שניתוח CV בסיסי מאוד זה אכן מספק תובנות לגבי תרמודינמיקת ה-EET בדרך מהירה ולא פולשנית, אך ראוי לציין כי הוא אינו מאפשר להסיק מסקנות מכניסטיות או קינטיות נוספות.

ראוי לציין כי הביופילמים שהתפתחו תחת התנאים הספציפיים בפרוטוקול זה נשלטים במידה רבה על ידי מיני Geobacter (לא מודגם כאן)12,15. שינוי פרמטרים נבחרים למשל סובסטרט, טמפרטורה, וכו' ישפיע גם הוא על ההרכב המיקרוביאלי ובכך על התכונות האלקטרוכימיות.

טבלה 1. מצע גידול לפי Kim et al.32

רכיב(מ"ג/ליטר) / (מ"ל/ליטר)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2אופטימיזציה של היפר-פרמטרים (HPO)44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
סודיום אצטט820.00
תמיסת מתכת12.50
תמיסת ויטמינים12.50
טבלה 2. רכיבי תמיסת המתכות והויטמינים33.
תמיסת יסודות קומה:תמיסת ויטמינים:
רכיבmg/L   רכיבmg/L   
חומצה ניטרילואצטית1,500.0ביוטין2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0חומצה פולית2.0
MnSO4•2H2O         500.0פירידוקסין הידרוכלוריד10.0
NaCl  1,000.0תיאמין הידרוכלוריד5.0
FeSO4•7H2O          100.0ריבופלבין5.0
CoSO4 or CoCl2     100.0חומצה ניקוטינית5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Calcium pantothonate5.0
ZnSO4   130.0ויטמין B120.1
CuSO4•H2O10.0p-Aminobenzoic acid5.0
AlK(SO4)2               10.0חומצה ליפואית5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
הערה: יש להמיס את החומצה הניטרילואצטית עם KOH עד להגעה ל-pH 6.5, ולאחר מכן להוסיף את המינרלים.


תרשים מונחים ביו-אלקטרוכימיים; כולל משוואות ונוסחאות באלקטרוכימיה.
מדריך להגדרת פרמטרים ופתרון בעיות בולטמטריה מחזורית, עם דגש על התאמות חלון פוטנציאל וקצב סריקה לניסויי CV אופטימליים.

דיאגרמה של מעבר אלקטרונים מיקרוביאלי; מסלולי MET, DET, MIET, DIET; ניתוח הובלת אלקטרונים.
איור 1. סכימה של מנגנונים אפשריים למעבר אלקטרונים חוץ-תאי מיקרוביאלי. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

תהליך דגימת מים; דוגם דלי אוסף דגימות מזרימת מטפלת בשפכים.
איור 2. דגימה במתקן לטיפול בשפכים לאחר אספן הסריג (מתקן לטיפול בשפכים, גרמניה). לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

דיאגרמה ותמונה של תא אלקטרוכימי עם פוטנציוסטט, מערך אלקטרודות; CE, RE, WE מסומנים.
איור 3. מערך של שלוש אלקטרודות. (A) סכימה, (B) ריאקטור ממשי; CE = אלקטרודת נגד, RE = אלקטרודת ייחוס, WE = אלקטרודת עבודה עם ביופילם מיקרובי אלקטרו-אקטיבי, SP = פתח דגימה. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרף אלקטרוכימי; ניתוח CV; זרם מול זמן; גישת מצב יציב; נתונים במיקרו-אמפרים ושעות.
איור 4. תרשים של צמיחת ביופילם המבוססת על תכשיר מים שפכים בשיטת fed-batch במדידה כרונו-אמפרומטרית. הזרם החמצוני מגיע למצב יציב לאחר שלושה מחזורים של החלפת מצע. מסומנים הם שלב ההשהיה (lag-phase) ונקודות הזמן של החלפת המצע וביצוע וולטמטריה מחזורית (CV) מסוג turnover ו-CV מסוג nonturnover לתנאי ביופילם במצב יציב (נתונים גולמיים מ-Liu14). לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ניתוח אלקטרוכימי, דיאגרמת E-t, וולטמטריה מחזורית, פוטנציאל לעומת זמן, כימיה אנליטית.
איור 5. מהלך פוטנציאל-זמן עקרוני במהלך מחזור אחד של וולטמטריה מחזורית. CV מתחילה בפוטנציאל התחלתי Ei. המתח המופעל משתנה לאחר מכן באופן ליניארי עם הזמן בקצב סריקה של v. בפוטנציאל שיא נבחר E1, המתח חוזר לפוטנציאל סיום E2, כאשר במקרה זה E2 = Ei. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרף ניתוח אלקטרוכימי עם צפיפות זרם j מול זמן t, הממחיש את שיא jmax.
איור 6. כרונו-אמפרוגרמה טיפוסית של מחזור צמיחה אחד של ביופילם המופק ממי שפכים; כאן מסומנים צפיפות הזרם המקסימלית jmax, המטען החשמלי שזרם (מעשי) Qp, דגימת ריכוז הסובסטרט הראשוני c0 וריכוז הסובסטרט לאחר מחזור צמיחה אחד c1 . לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרף ניתוח אלקטרוכימי; דיאגרמות וולטמטריית מחזור המציגות תוצאות של זרם מול מתח.
איור 7. וולטמטרוגרמות מחזור ללא תחלופה (Nonturnover) של ביופילם של G. sulfurreducens. קצב סריקה: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) גזירה של B, המדגימה את צפיפות זרם השיא (jpA) ואת פוטנציאל השיא המתאים (EpA) של האנודה במקסימום. באופן תואם, במינימום מוצגים צפיפות זרם השיא (jpC) ופוטנציאל השיא המתאים (EpC) של הקתודה. הפוטנציאל הפורמלי Ef והפרדת השיאים ΔEp נגזרים ממשוואה 4 וממשוואה 5, בהתאמה (לפרטים ראו טקסט להלן). לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

ניתוח אלקטרוכימי; גרף וולטמטריה; זרם מול פוטנציאל; זיהוי שיאים; ניתוח נתונים.
איור 8. (A) וולטמograma מחזורית של Turnover עבור ביופילם מטבולי של G. sulfurreducens. קצב הסריקה היה 5 mV/sec. (B) נגזרות ראשונות של העקומה הוולטמטרית23. מסומנים הפוטנציאלים הפורמליים של אתרי ה-EET בפועל: Ef,2 ו-Ef,3. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרף וולטמטריית מחזור; זרם מול פוטנציאל; ניתוח אלקטרוכימי; תוצאות נתונים.
איור 9. (A) וולטמטרוגרם מחזורי של מחזור פעילות (Turnover) ו-(B) נגזרות ראשונות של ביופילם G. sulfurreducens מטבולי עבה יותר. קצב הסריקה היה 5 mV/sec (השוו לאיור 8). לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

דיון

הפרוטוקול המוצג מראה דרך קלה ופשוטה לגידול ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים מחיסון שפכים באמצעות מערך של שלוש אלקטרודות בכור אצווה מוזן. כרונואמפרומטריה מאפשרת גידול ובחירה של ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים מחיסונים מגוונים, כמו גם אפיון בסיסי של הביופילמים במונחים של צפיפות זרם מקסימלית ויעילות קולומבית. וולטמטריה מחזורית, בהיותה טכניקה לא פולשנית, מאפשרת לבצע מחקרים בסיסיים על תרמודינמיקה EET של הביופילם המיקרוביאלי ובכך לזהות אתרי העברת EET אפשריים וממשיים. יחד, פרמטרים אלה מאפשרים 1) לאפיין ולהשוות ביופילמים מיקרוביאליים שונים לתנאים זהים וכן 2) לחקור את ההשפעה של תנאי פעולה שונים על ביופילמים מיקרוביאליים אלקטרואקטיביים זהים. עם זאת, ניסויים אלה יכולים להיות רק נקודת התחלה. מצד אחד, התחום הרב-גוני של ביו-אלקטרוכימיה מיקרוביאלית דורש ניצול נוסף ומעמיק של שיטות ופרוטוקולים אלקטרוכימיים. זה כולל, למשל, מודלים לחילוץ נתונים קינטיים ומכניסטיים וכן שיטות נוספות כמו ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימית34,35. מצד שני, שיטות אלקטרוכימיות אינן יכולות לספק מידע על האופי המולקולרי, ההרכב המיקרוביאלי, הארגון המיקרוביאלי המרחבי וכו'. כאן יש צורך בטכניקות נוספות שאינן פולשניות ומשולבות עם אלקטרוכימיה או פולשניות4. תיבה 2 מספקת דיון קצר על השלבים הקריטיים בעת ביצוע הניסויים וכן על פתרון בעיות ראשוני.

מנקודת המבט ההנדסית, יש לקחת בחשבון שאנודת הביופילם האלקטרואקטיבית היא רק מרכיב אחד של המערכות הביו-אלקטרוכימיות המיקרוביאליות הנוכחיות ויש לנתח מספר רב של גורמים אחרים עבור מערכות מלאות36. עם זאת, אנו מקווים שמאמר וידאו זה יעזור להבין ולהתאים את מרכיבי הליבה של BES, כלומר האלקטרודות המיקרוביאליות, בעתיד.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

F.H. מודה על תמיכתם של BMBF (פרס המחקר "הדור הבא של תהליכים ביוטכנולוגיים - ביוטכנולוגיה 2020+") ועמותת הלמהולץ (קבוצת חוקרים צעירים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שפכים ראשונייםמתקןנלקח לאחר סינון מכני
250 מ"ל צלוחיות תחתונות עגולות עם שלושה כניסות נוספותTh.Geyer Berlin GmbH, גרמניה9.011 845כניסות נוספות חוברו על ידי אלקטרודת הייחוס של מפוח הזכוכית הפנימי
שלנו Ag/AgCl (Sat. KCl, 0.195 V לעומת SHE) עם דיאפרגמה קרמיתSensortechnik Meinsberg, גרמניהSE 11
מוטות גרפיט (Ø=1 ס"מ, l=3 ו-5 ס"מ)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, גרמניהמשמש כחומר אלקטרודה
נירוסטה, מס' 1.4301, חוט Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, באד נאוהיים, גרמניה155-923-05
תקעי סיליקוןTh.Geyer Berlin GmbH, גרמניה9.230 512 ו-Parafilm
neoLab, היידלברג, גרמניה3-1011לאיטום לשמירה על תנאים אנאירוביים
פוטנציוסטט / גלוונוסטט דגם MPG2BioLogic Science Instruments, צרפת
EC-LabBioLogic Science Instruments, צרפתתוכנה לביצוע מדידות אלקטרוכימיה
מקור 8.6תוכנת ניתוח נתוניםOriginLab
לטיפול בשפכים

מקורות

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fed Batch

מאמרים קשורים