יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

סיכום

במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.

תקציר

לבעלי חיים רבים, רעב מקדם שינויים במערכת ההרחה באופן שמקל את החיפוש אחר מקורות מזון מתאימים. במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה. בתיבת אור חזק המוארת באור אדום שהוא בלתי נראה לזבובי פירות, מצלמה קשורה לתוכנת רכישת נתונים המותאמת אישית עוקבת אחר מצבם של שישה זבובים בו זמנית. כל זבוב הוא מוגבל ללכת בזירות בודדות המכילות ריח אוכל במרכז. זירות הבדיקות לנוח על רצפה נקבובית שפונקציות כדי למנוע הצטברות ריח. חביון לאתר את מקור הריח, מדד המשקף את רגישות חוש הריח תחת מצבים פיסיולוגיים שונים, נקבע על ידי ניתוח תוכנה. כאן, אנו דנים את המכניקה הקריטית של הפעלת הפרדיגמה ההתנהגות הזה ונכסה נושאים ספציפיים לגבי loadi זבובng, זיהום ריח, טמפרטורת assay, איכות נתונים, וניתוח סטטיסטי.

מבוא

הברית הרעב לקדם שני סוגים של התנהגויות תיאבון: חיפוש מזון וצריכת מזון ^1. assay התנהגותיים פשוט זו שימושי לחקר התנהגויות הקשורות לחיפוש מזון chemotactic ^2,3. באופן ספציפי, הוא עוקב אחר עמדה לטוס, מהירות הליכה והשהיה לאיתור יעד ריח אוכל. מיסות של ממצא מזון משמשת כמדד למדידת שינויים ברגישות של מערכת זיהוי הריח של הזבוב במורד הזרם של שינויים במצב התיאבון הפנימי שלה. גרסה ידנית של assay זה הייתה בשימוש בעבר כדי להראות איתות הקולטן GABA-B חשובה ללוקליזציה ריח התנהגות במבוגרים עף ^3. הגרסה האוטומטית הנוכחית של assay סייעה במחקר של כמה קצר איתות נוירופפטידים-F (sNPF) מעצבת מחדש את מפת חוש הריח בדרוזופילה והשפעות appetitive התנהגויות ^2.

בדיקה נעשה בחדר מבוקר כהה, טמפרטורה ולחות. דיגיטלימצלמות וידאו נקבעות מעל צלחות בדיקות אקריליק ברורות לעקוב אחר הזבובים מוארים בתאורת LED 660 ננומטר. מידע מהמצלמה מעובד בזמן אמת על ידי מחשב שהוצב בסמוך לאזור הבדיקה. אנו משתמשים בתוכנת רכישת נתונים כדי להקליט ולשמור את הקואורדינטות של עמדות לטוס בתקופת הבדיקה.

בפרדיגמה זו, הנושא הוא שוחרר לזירה המכילה ריח אוכל במרכז; אובייקט הריח יוצר שיפוע ריח אוכל בזירה שגורמת מזון התנהגות חיפוש בזבוב. פרוטוקול חיפוש ריח דומה כבר מיושם כלפי המחקר של chemosensation בזחלי דרוזופילה אחת ^7. בעוד מבחני התנהגות אחרים כגון ארבעת שדה olfactometer ^4,5 או t-מבוך ⁶ להעריך התנהגויות סלידה או משיכה ריח, פרדיגמה זו היא מתאימה ביותר כדי להעריך התנהגויות רגישות וchemotaxis חוש הריח.

כמה יתרונות מרכזיים ילוו את אסא זהy. ראשית, הוא מאפשר רכישה מהירה של ערכות נתונים גדולות, כי איסוף הנתונים וניתוחם בעיקר אוטומטיים. שנית, assay זה מבודד ומודד את התנהגותם של זבובים יחיד, ובכך לחסל רמזי חוש הריח חברתיים שעשויים להשפיע על ההתנהגויות שלהם. שלישית, את הפשטות של הפרוטוקול ועיצוב ניסיוני פשוט לעשות את assay יעיל וקל ללמד אחרים.

בנוסף, assay זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר מעגלים עצביים שבבסיס מזון התנהגות חיפוש על ידי שילוב עם ערכת הכלים הגנטיים הנרחב זמינים לmelanogaster דרוזופילה ^8. ביטוי ממוקד של transgenes שניתן להשיג תאי עצב שתיקה או לרגש עם כלים כגון מערכת GAL4-כטב"מ כמו גם ^TS1 כטב"מ-shibire, כטב"מ-טטנוס הרעלן, וכטב"מ-TrpA1 (ב ') transgenes ^9-12.

פרוטוקול

1. טוס איסוף ורעב

1. אחורי הזבובים הניסיוניים בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים (למשל 21 ° C, 50-60% לחות יחסית) ב12-HR מחזור אור / חושך.
2. אסוף נקבת הזבובים ביום eclosion ולמקם אותם, יחד עם 4-5 זכרים, לתוך צלוחיות חדשות מזון (30 למקסימום בקבוקון). גיל עף 2-5 ימים.
3. הכן את התאים להרעבה לטוס.
   1. לדחוף את רקמה בודדת (4.8 x 8.4 אינץ') עד לתחתית של בקבוקון פלסטיק ריק. לחלוטין לספוג את הרקמה עם מים מזוקקים. השתמש אובייקט לדחוף כלפי מטה על הרקמות ובעדינות לסחוט את המים עודפים.
   2. הפוך את הבקבוקון כדי לבטל את תוספת המים. צריך להיות מספיק מים כדי לשמור על כמות מים בזבובים וקאמרי הרעב לח, אבל לא מספיק כדי להטביע את הזבובים.
4. העבר את הזבובים מבקבוקון המזון לתוך תא רעב ולסתום את הבקבוקון על 18-24 שעה לפני הניסוי מתחיל. אחסןבקבוקונים בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים עד לילה שהניסוי יתחיל ביום שלמחרת.

2. הכנת ריח המזון

1. הכן את פתרון agarose 1% על ידי הוספת 0.1 גרם של טמפרטורת התכה נמוכה agarose ל10 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית. מחממים את פתרון agarose במיקרוגל רק עד שהוא מתחיל לרתוח, אבל גם לפני שהוא רותח מעל.
   1. לעצור את המיקרוגל ולערבל את הבקבוק פעם אחת. חזור על פעולה זו עוד פעמיים עד agarose נמס לגמרי. שמור את פתרון agarose במצב נוזלי על ידי שמירה על חם בקבוק על פלטה חמה להגדיר ב50 ° C.
2. הוספת 990 μl של פתרון agarose 1% ו10 μl של חומץ תפוחים לצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf לבצע פתרון חומץ תפוחים 1%. ורטקס הפתרון עד מעורב ומקום בחממה אמבטיה יבשה מוגדרת 50 ° C.

3. חדר בדיקה והתקנת לשכת התנהגות

1. הגדר את חדר בדיקות לתנאים הרצויים (למשל הטמפרטורה ולחות).
2. הפעל את פנל LED (660 ננומטר).
3. יש לשטוף את מסננות וצלחות בדיקות עם מים חמים ולחמם אותם בתנור ייבוש עד שכל הרטיבות התאדתה. לקרר את מסננות וצלחות עד לטמפרטורת חדר בדיקות לפני ניסויים מתחילים.
4. מקם צלחת רדודה על גבי צלחת המפזר ולמלא אותו במים כדי להגדיל את הלחות המקומית וכדי להסוות את המים באגל agarose.
5. מקם את הנפות מעל קערת המים.

4. טוס טוען לצלחות הבדיקה

ניתן למצוא תרשימים עם מפרט לצלחות בדיקות בסעיף משלימה הקבצים. צלחת הבדיקות עשויה אקריליק ברור וכוללת 6 זירות בדיקות. מחוון פשוט מכיל תאים מחזיקים המאפשרים טעינת זבוב, בלימה זמנית, ושחרורו הזמני של 6 זבובים לתוך התאים שלהם בתחילת הניסוי. קרוס שערות חרוטות במרכזה של כל זירה בצלחת לציין היכן צריך להיות pipetted הניחוח.

1. הכנס את המחוונים לתוך צלחת בדיקות אקרילי.
2. החלק בעדינות את aspirator לתוך בקבוקון העבר את תקע הכותנה ולאפשר כ -6 זבובים ללכת לaspirator.it הוא קריטי כדי להיות עדין ככל האפשר בטיפול בהם. אפשר לנצל את phototactic התנהגות לטוס כדי לגרום לזבובים לזחול כלפי aspirator ידי ההצבעה פתיחת הבקבוקון לכיוון מקור אור עמום. במידת צורך, ניתן גם להחיל שאיבה עדינה כדי לשאוב כ 6 זבובים ממין נקבה.
3. הכנס את קצה aspirator לתוך החור הראשון של צלחת הבדיקה. לאפשר זבוב אחד לעבור לתא המעצר ובעדינות לקדם את המחוון קדימה כדי לטעון זבוב לתוך החור הבא. המשך עד שזבובים לכבוש את כל 6 תאי המעצר של הצלחת.
4. פיפטה 5 μl של 1% פתרון agarose חומץ תפוחים ישירות על גבי מרכז CRoss-שערות על הפנים הפנימיים של צלחת הבדיקה.

5. מיצוב פלייט הבדיקה

1. כדי למרכז את צלחת הבדיקה, פתח את הקובץ בשם "מיקום Tool.vi." "VI LabVIEW למיקום כלי. ניתן למצוא vi בסעיף משלימה הקבצים. הפעל את הקובץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה השמאלית העליונה של המסך.
2. מניחים את צלחת הבדיקה על גבי המסננת כזו שפתיחת זירת פרצופים רצפת המסננת ויעד הריח הוא על התקרה של הצלחת. יישר את הכוונת חרוטה לתוך אחורי של צלחת הבדיקה עם שערות צלב על מסך הצג.
3. כאשר יישור הושלם, להפיל ביצוע על ידי לחיצה על הנקודה האדומה הממוקמת בסמוך לפינה השמאלית העליונה של המסך.

6. להקליט את המיקום טוס במהלך הניסוי

1. כדי לעקוב ולהקליט את הקואורדינטות של הזבוב במהלך כל ניסוי חיפוש מזון, פתח את קובץ תוכנת רכישה "פלורידהy מעקב - שש Zones.vi "LabVIEW VIS ל" טוס מעקב -. ניתן למצוא שש Zones.vi" בסעיף משלימה הקבצים הפעל את הקובץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה השמאלית העליונה של המסך. .
2. להקצות לקובץ שם ולחץ על "אישור".
3. לקדם את המחוונים בתאי הבדיקה כדי לשחרר את הזבובים לזירות בדיקות. היזהר שלא להעביר את התאים לבדיקה כמו זה יוביל ליישור לא תקין עם קואורדינטות תוכנה לניתוח.
4. לחץ על "התחל" (הקלטה מתחילה) ולהבטיח שמקור האור היחיד בחדר הבדיקה הוא פנל LED 660 ננומטר.
5. כאשר הניסוי נגמר, להסיר את המסננת וקאמרית התנהגות. הרם את צלחת הבדיקה מהמסננת ולהסיר את הזבובים על ידי השריית את הצלחת בקרח. לנקות בעדינות את הצלחת עם מים חמים ולהסיר כל פסולת agarose. מקם את צלחות בדיקות בתנור ייבוש להסרת לחות.
6. לאוורר את אזור הבדיקה על ידי הפעלת smalאוהד l למשך כ 2 דקות. הפעל את המאוורר ומלטעון את הקבוצה הבאה של זבובים לתוך צלחת הבדיקות הבאה.

7. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה מותאמת אישית

ניתן למצוא "ניתוח נתונים למעקב Fly-שישה אזורים" בסעיף משלימה הקבצים. במהלך רכישת נתונים, עמדת הזבוב בודדת רשומות תוכנת רכישת המתאם עבור כל נקודה בקובץ טקסט בזמן. מצלמה דיגיטלית יחידה הממוקמת מעל צלחות הבדיקות רוכשת תמונות בקצב מסגרת של 0.5 הרץ. ניתוח התוכנה "ניתוח נתונים למעקב Fly-שישה אזורים" מחלץ מידע מקובץ טקסט ל) לחשב את המהירות הממוצעת, ב) לקבוע את נקודת הזמן שבו זבוב ממוקם בהצלחה את מקור הריח, ג) לבנות חלונות גרפיים המאפשרים למשתמש להציג: לטוס מיקום, מרחק של הזבוב ממקור הריח לאורך זמן ומהירות זבוב ממוצע לאורך זמן. הוא גם מעצב את הנתונים ליצוא קל לspreתכנית adsheet. במקרו זה, חביון חיפוש מזון מוגדר כנקודת הזמן שבה טסה לבלות לפחות 5 שניות ברדיוס של 5 מ"מ ממרכז הזירה.

1. פתח את קובץ תוכנה לניתוח "ניתוח נתונים עבור טוס מעקב - שישה אזורים". תחת הלשונית "Windows", לחץ על "צור טבלה חדשה." חזור על פעולה זו עד לשישה שולחנות כבר נוצרו.
2. תחת לשונית "פקודות מאקרו", לחץ על "Foodfinding". פנל ראשי אמור להופיע עם האפשרויות הבאות: פתח את קובץ נתונים גולמיים לפריסה; להרחיב גלם קובץ נתונים לקובץ נתונים; מיקום Fly; מרחק; מהירות; פריסה; FormatDataFile.
3. כדי להציג את הנתונים גולמיים ללא צירוף ערכים לקובץ טקסט, לחץ על "פתח קובץ נתונים הגולמיים לפריסה." אתר ובחר את קובץ נתוני הניסוי בחלון הדפדפן שמופיע. לחץ על "פתח".
4. לחץ על "ארץ טוס" כדי להציג את המיקום של כל זבוב בכל אחד משש הזירות (שש חלקות XY המתארות כל זבוב 'עמדה של לאורך הזמן אמורה להופיע על המסך).
5. לחץ על "מרחק" כדי להציג המרחק של כל זבוב ממקור הריח (שש חלקות המתארות את מרחקו של הזבוב ממקור הריח לאורך הזמן אמורות להופיע על המסך). הקו האופקי בy = 5 מ"מ מציין את הסף שבו לטוס נחשב להיות ממוקמים במקור המזון.
6. לחץ על "מהירות" כדי להציג את המהירות הממוצעת של כל זבוב במהלך המשפט (שש חלקות המתארות את מהירותו של הזבוב לאורך הזמן אמורות להופיע על המסך).
7. לחץ על "פריסה" לתצוגת פריסה בכל מיקום זבוב, מרחק, מהירות והגרפים בנוסף למהירות הממוצעת (במהלך 50 שניות הראשונות) וזמן האחזור של מציאת מקור ריח לכל זבוב (איור 1). כדי להציג את הפריסה כמו שצריך, ייתכן שיהיה צורך להתאים את השוליים. לשם כך, לחץ תחילה על חלון הפריסה. תחת הלשונית "קובץ", לחץ על "הגדרת עמוד לפריסה." לאפס את השוליים כדי0.2 סנטימטרים ולחצו על "אישור". מייד עזב את כל עלילת מיקום הוא שולחן קטן עם הכותרות "מהירות" ו "חביון". הערכים נכנסו תחת כל כותרת לציין את המהירות הממוצעת במ"מ / השני והשהית חיפוש מזון בשניות. ערכים ריקים תחת חביון מצביעים על הזבוב לא הצליח לאתר את מקור הריח. חביון חיפוש מזון מוגדר כנקודת הזמן שבה הזבובים בילו לפחות 5 שניות ברדיוס של 5 מ"מ ממרכז החדר.
8. כדי להדפיס פריסה, לחץ על אזור הפריסה (פריסת עדכונים לקובץ הנוכחי). לחץ על "קובץ" ולאחר מכן לחץ על "פריסת הדפסה".
9. כדי להציג את הקובץ הבא, פשוט לחץ על "פתח קובץ נתונים הגולמיים לפריסה." לחץ על קובץ נתונים הגולמי הבא שברצונך להציג ולחץ על "אישור". לחץ על חלון הפריסה לעדכן את החלון עם קובץ נתונים החדש.
10. ההגדרות ניתן לשמור בקובץ ניסוי לשימוש מאוחר יותר.

8. יצוא נתונים מתוכנת ניתוח נתונים לתכנית גיליון אלקטרוני

1. כדי לייצא את מהירות ונתונים השהיה עבור כל קובץ, לחץ על "Open גלם קובץ נתונים לקובץ נתונים." בחר קובץ נתוני ניסוי ולחץ על "פתח". חלון דפדפן חדש יופיע.
2. בחלון החדש של הדפדפן, לחץ לחיצה ימנית על "חדש" ולאחר מכן לחץ על "מסמך טקסט". שם מסמך הטקסט החדש. בחר את קובץ טקסט בשם החדש ולחץ על "פתח". חנויות מידע זה מקובץ נתונים הגולמי לקובץ הטקסט.
3. כדי לייצא את הנתונים מקובץ אחר, לחץ על "פתח קובץ נתונים הגולמיים לקובץ נתונים." לחץ על קובץ אחר ולחץ על "פתח". בחר את קובץ טקסט מצעד 8.2). המשך בתהליך זה לקבצי הנתונים שנותרו שברצונך לייצא.
4. ברגע שכל קבצי הנתונים הרצויים נוספו לקובץ הטקסט, לחץ על "קובץ נתונים עיצוב." בחר את מסמך הטקסט המשמש לאחסון נתונים מהשלבים הקודמים, ולחץ על "Open" (Windo חדשw באופן אוטומטי ייפתח).
5. צור מסמך טקסט חדש בחלון, להקצות לקובץ שם, ולחץ על "שמור". זה יוצר קובץ טקסט המכיל את שם קובץ, מהירות ממוצעת, והשהיה עבור כל לטוס ויכול להיות מיובא לתוך תכנית גיליון אלקטרוני.
6. חלקות מצטברות בנויות מנתונים על המספר הכולל של זבובים שהגיעו למטרת ריח מזון כפונקציה של זמן (איור 3).
7. ערכות נתונים ניסיוניות מנותחות למובהקות סטטיסטיות באמצעות מבחן z לפרופורציות.

תוצאות

תוכנה לניתוח נתונים והפריסה, דוגמא שניתן לראות בתרשים 1, המשמשים להערכת ביצועים של כל זבוב במהלך משפט 10 דקות שלו על פי סדרה של קריטריוני ניתוח. הקריטריונים הבאים משמשים כדי לקבוע אם הנתונים מכל זבוב ישמשו לניתוח נתונים ונועדו לחסל אותם הזבובים שאינם מסוגלים לבצע את משימת חיפוש מזון עקב פציעה, מחלה, מתח, או חוסר המוטיבציה.

זבובים שאינם פעילים במשך יותר מ -300 שניות נחשבים 'לא פעיל', והם דחו מערכת...

דיון

בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך צעד אחר צעד עבור assay חיפוש מזון ההתנהגות. בנוסף לריחות מזון קשור, היא עשויה גם להיות מותאמת ללימוד היכולת של הזבוב כדי לאתר אובייקטי ריח אחרים. לדוגמא, זה יכול להיות מיושם כלפי המחקר של בן זוג לוקליזציה התנהגות בזבובי זכרי ³ ישנם כמה שיקולים נוספים לפרוטוקול זה שיזכירו כאן לגבי הליך זה.:

ראשית, טמפרטורת הגידול קובעת כמה זמן צריכים להיות בגילי זבובים ניסיוניים לפני הבדיקה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ספקטרום		חומץ תפוחים	זמין מסחרית
אגרוז, סוג VII	Sigma-Aldrich	A0701	טמפרטורת ג'ל נמוכה אגרוז
צלחת		אקרילית צלחת מותאמת אישית	מכילה 6 זירות. כל זירה בקוטר 60 מ"מ ובגובה 6 מ"מ. ראה דיאגרמות לוחות בדיקה למדידות ספציפיות.
פלטפורמת LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	עבור תוכניות: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi הערה: "time.vi שחלף", "זמן לתוך file.vi", ו-"שני אובייקטים detect.vi" כלולים תת-שגרות שחייבות להיות זמינות על מנת שתוכנית איסוף הנתונים הראשית "FlyTracking--Six zones.vi" תפעל.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		פלטפורמה למאקרו: ניתוח נתונים למעקב אחר זבובים - שישה אזורים
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	מצלמה דיגיטלית הערה: דרייבר למצלמה זמין בעדשת
Baslerweb.com 8 מ"מ	National Instruments	780024-01	עדשה למצלמה דיגיטלית של Basler
צלחת מפזר זכוכית קרקעית	אופטיקה אדמונד	מותאם אישית	מפזר אור, 25 ס"מ x 30 ס"מ
ארה"ב Std. מס' 100	Fischer Scientific	04-881X	מסננת עם פתיחה נומינלית של 150 μ m
<חזק>אפשרות תאורה 1
LED תאורה אחורית 660 ננומטר (20 ס"מ x 20 ס"מ)	ספקטרה ווסט	BL47192	אפשרות תאורה פשוטה יותר אך יקרה יותר.
ספק כוח עבור תאורת LED אחורית	ספקטרה West
<חזקה>אפשרות תאורה 2
660 ננומטר נוריות	Superbrightleds	RL5R1330	אורך גל 660 ננומטר (כ-7 x 7 מערך LED עבור פאנל בגודל 14.7 אינץ' x 9.75 אינץ')
ספק כוח DC ליניארי	GW Instek	GPS-1830D	ספק כוח עבור לוח LED
לחם ללא הלחמה	Digikey	922354-ND	לוח אב-טיפוס עבור נורות LED