הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

16.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50805

⸱

20 בנובמבר 2013

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

תקציר

Biosensor אופטי ללא תווית המבוסס על Si הנקבובי nanostructured מיועד ללכידה וזיהוי מהירים של חיידקי Escherichia coli K12, כמיקרואורגניזם מודל. Biosensor מסתמך על כריכה ישירה של תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו, בעוד שאף טיפול מקדים (למשל על ידי תמוגה תא) של המדגם למד נדרשת. סרט דק Si mesoporous משמש כאלמנט מתמר האופטי של biosensor. תחת תאורת אור לבנה, השכבה נקבובית מציגה דפוסי שוליים פברי פרו-נפתרו היטב בספקטרום רפלקטיביות שלה. החלת Fast Fourier Transform (FFT) לתוצאות נתוני רפלקטיביות בשיא אחד. שינויים בעוצמת שיא FFT נמצאים תחת פיקוח. לפיכך, חיידקי היעד ללכוד על גבי משטח biosensor, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, גורם לשינויים מדידים באינטנסיביות של פסגות FFT, המאפשרים תצפית "בזמן אמת" של קובץ מצורף חיידקים. NT "> סרט Si mesoporous, מיוצר על ידי תהליך anodization אלקטרוכימיים, הוא מצומדת עם נוגדנים חד שבטיים, ספציפיים לחיידקי היעד. חוסר התנועה, immunoactivity והספציפיות של הנוגדנים אושר על ידי ניסויי תיוג ניאון. רגע biosensor חשוף ל חיידקי יעד, התאים שנתפסו ישירות על גבי משטח Si הנקבובי-הותאם נוגדן. אירועי לכידה ספציפיים אלה לגרום לשינויים בעוצמה בספקטרום ההפרעות אופטיות סרט דק של biosensor. אנו מדגימים כי biosensors אלה יכולים לזהות ריכוזי חיידקים נמוכים יחסית (זיהוי מגבלה של 10 4 תאים / מיליליטר) בפחות משעה.

מבוא

מוקדם ומדויק זיהוי של חיידקים פתוגניים הוא חשוב ביותר עבור מזון ובטיחות מים, ניטור סביבתי, ואבחון נקודה של טיפול 1. כמו טכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות הן זמן רב, מייגע, ואין להם את היכולת לזהות מיקרואורגניזמים ב" בזמן אמת ", או מחוץ לסביבת המעבדה, biosensors מתפתח כדי לעמוד באתגרים אלה 2-5.

בשנים האחרונות, סי נקבובית (PSI) התפתחה כפלטפורמה מבטיחה לעיצוב של חיישנים וbiosensors 6-20. בעשור האחרון מחקרים רבים בנוגע לחיישנים אופטיים המבוסס על PSI וbiosensors פורסמו 21,22. שכבת PSI nanostructured היא מפוברק בדרך כלל על ידי תחריט anodic אלקטרוכימיים מSi רקיק יחיד גביש. ננו PSI כתוצאה תערוכה רבים מאפייני יתרון, כגון פנים גדול ונפח חופשי, להתעמק בגדלים שניתן לשלוט וopti מתכונןמאפייני קאל 10,16. התכונות אופטיות של שכבת PSI, כגון photoluminescence 8,11 ואינטרפרומטריה מבוססת החזרה אור הלבן 7,19, מושפעות במידה רבה על ידי תנאים סביבתיים. לכידתו של analytes מולקולות / יעד אורחים בתוך תוצאות השכבה נקבוביות בשינוי במקדם השבירה הממוצעת של הסרט, כפי שנצפה אפנון בספקטרום photoluminescence או כשינוי באורך גל בספקטרום רפלקטיביות 10.

למרות החדשנות העצומה בתחום טכנולוגית biosensor האופטי PSI, יש רק כמה דיווחים על פלטפורמות מבוססות PSI לגילוי חיידקים 6,8,20,23-29. בנוסף, רוב מחקרי הוכחה של קונספט אלה הוכיחו זיהוי "עקיף" חיידקים. לכן, בדרך כלל תמוגה המוקדמת של התאים נדרשת כדי לחלץ את שברי החלבון / DNA הממוקד, אופייניים לחיידקים למדו 29. הגישה שלנו היא ללכוד ישירות חיידקי היעדתאים על גבי biosensor PSI. לפיכך, נוגדנים חד שבטיים, שהם ספציפיים כדי למקד חיידקים, הם משותקים על פני השטח הנקבובי. כריכה של תאי חיידקים, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, על פני השטח של biosensor לגרום לשינויים באמפליטודה (עוצמה) של ספקטרום רפלקטיביות 24-26.

בעבודה זו, אנו מדווחים על הבנייה של biosensor מבוסס PSI אופטי ולהדגים היישום שלה כפלטפורמת biosensing ללא תווית לזיהוי של Escherichia coli (E. coli) חיידקי K12 (המשמשים כמודל מיקרואורגניזם). פיקוח אות אופטי הוא האור מוחזר מnanostructure psi עקב ההפרעה פברי פרו-סרט דק (איור 1 א). שינויים במשרעת / עוצמת האור מתואמים לקיבוע מסוים של תאי חיידקי היעד על גבי משטח biosensor, המאפשרים איתור וכימות של החיידקים מהירים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת החמצון הנקבובי SiO 2

  1. הוופלים לחרוט סי (צד אחד מלוטש ב< 100> פנים ומסוממים בכבדות, מסוג p, 0.0008 Ω · ס"מ) בתמיסה 03:01 (V / V) של HF מימיים ואתנול מוחלט ל30 שניות בזרם קבוע צפיפות של 385 mA / 2 סנטימטר. שים לב שHF הוא נוזל מאכל מאוד, וזה צריך להיות מטופל בזהירות רבה.
  2. יש לשטוף את פני השטח של סרט סי (PSI) הנקבובי וכתוצאה מכך עם אתנול מוחלט מספר פעמים; לייבש את הסרטים תחת גז חנקן יבש.
  3. חמצן דגימות PSI הטרי החרוטות בתנור צינור ב800 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באוויר הסביבה (למקם את המדגם בתנור בטמפרטורת חדר, לחמם את התנור ל800 מעלות צלזיוס, להשאיר בתנור במשך שעה 1, כבה את תנור ולהסיר את הדגימות מהתנור רק בטמפרטורת חדר).

2. Biofunctionalization של 2 פיגומים PSiO

  1. דגירה PSI חמצון (PSIO 2 מדגם) במשך שעה 1 בmercaptopropyl (פתרון trimethoxysilane-3) 95% (MPTS) (108 מ"מ בטולואן).
  2. יש לשטוף את מדגם PSiO 2 שטופלו silane עם טולואן, מתנול, אצטון ו; יבש מתחת לגז חנקן יבש.
  3. דגירה מדגם PSiO 2-הותאם silane ל30 דקות ב 1 מיליליטר של 100 פתרון ביוטין PEO-iodoacetyl מ"מ.
  4. יש לשטוף את מדגם PSiO 2 שטופלו ביוטין עם 0.1 פוספט M שנאגרו פתרון (PBS) מספר פעמים.
  5. דגירה מדגם PSiO 2-הותאם ביוטין ל30 דקות ב 1 מיליליטר של מיקרוגרם / מיליליטר streptavidin פתרון 100 (SA).
  6. יש לשטוף את המדגם שטופל ב-SA PSiO 2 עם 0.1 פתרון M PBS מספר פעמים.
  7. דגירה PSiO 2 מדגם הותאם-SA וכתוצאה מכך ל30 דקות ב 1 מיליליטר של 100 מיקרוגרם / ה biotinylated מיליליטר פתרון נוגדן חד שבטי coli (אימונוגלובולין G, IgG) או עם 100 מיקרוגרם / IgG biotinylated ארנב מיליליטר (כמודל לנוגדנים חד שבטיים).

3. תיוג פלורסנט ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. דגירה המשטחים שונה-IgG עם 15 מיקרוגרם / מיליליטר והעמסת (FITC) מתויג ארנב IgG נגד ל40 דקות ועם 15 מיקרוגרם / מיליליטר והעמסת (FITC) מתויג IgG עכבר אנטי כביקורת.
  2. יש לשטוף את הדגימות שונה עם 0.1 פתרון M PBS מספר פעמים.
  3. לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. תרבות חיידקים

  1. לטפח E. חיידקי coli K12 בצינור 10 מיליליטר עם 5 מיליליטר של לוריא Bertani בינוני (LB) (הרכב בינוני ב1 ליטר של מים deionized: 5 גרם של NaCl, 5 גרם של תמצית שמרים, ו10 גרם של tryptone). דגירה החיידקים רועדים לילה בשעה 37 ° C.
  2. לנטר את ריכוז חיידקים על ידי קריאת הצפיפות האופטית (OD) באורך גל של 600 ננומטר. לאחר צמיחת הלילה במדיום LB, קרא את OD 600 באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. מספר התאים הוא קשהctly פרופורציונאלי לOD 600 מדידות (OD 1 600 = 10 8 תאים / מיליליטר).

5. חיידקי חישה

  1. הנח את PSiO הותאם-IgG 2 ומסודרים PSiO 2 (כמו השליטה) דגימות בתא זרימת פרספקס בהזמנה אישית. תקן את תא הזרימה כדי להבטיח שרפלקטיביות המדגם נמדדה באותה הנקודה במשך כל המדידות.
  2. דגירה הדגימות עם א ' ההשעיה coli K12 (10 4 תאים / מיליליטר) ל30 דקות בטמפרטורת חדר. ואז להסיר את ההשעיה חיידקים על ידי שטיפת התא עם 0.85% w / תמיסת מלח v ל30 דקות.
  3. לעקוב אחר השינויים בנתונים רפלקטיביות לאורך כל הניסוי. כל המדידות אופטיות צריכה להתבצע במימי שמסביב. ספקטרום צריך להיות שנאסף באמצעות ספקטרומטר CCD ונותח על ידי יישום Fast Fourier Transform (FFT), כפי שתואר 25,26 בעבר.
  4. לאשר את קיומו של החיידקים עלמשטח biosensor, על ידי תצפית של הדגימות תחת מיקרוסקופ אור זקופה מייד לאחר ניסוי biosensing.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סרטי PSI חמצון (PSiO 2) מוכנים כפי שתוארו בסעיף טקסט הפרוטוקול. 1B איור מראה מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה של סרט PSI וכתוצאה מכך לאחר חמצון תרמי. PSiO 2 השכבה מאופיינת בנקבוביות גליליות מוגדרות היטב בקוטר בטווח של 30-80 ננומטר.

מולקולות הנוגדן חד שבטי (IgG) הם מורכבים על PSiO 2 משטחים באמצעות טכנולוגית silanization מבוססת היטב בשילוב עם מערכת ביוטין-SA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Immunosensor אופטי ללא תווית, המבוסס על nanostructure PSiO 2 (סרט דק פברי פרו-) הוא מפוברק, ותחולתה הפוטנציאלית כbiosensor לגילוי חיידקים הוא אישרה.

שינויים ופתרון בעיות

אחד החששות הגדולים בעת תכנון immunosensor הוא הרגישות של נוגדנים לעבור שינויי קונפורמציה לא רצויים במהלך בתצהיר ודפוסים על גבי המצע המוצק, דבר שעלול להוביל לירידה ברגישו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס 1118-1108 ומענק מס 1146-1112) ומינה קרול זיכרון קרן המחקר. ES מכיר בהכרת תודה על התמיכה הכספית של ראסל ברי למכון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סי פרוסותSiltronix Corp.מסומם מאוד B, סוג p, התנגדות 0.0008 Ω-cm, < 100> HF
מימי מכוון (48%)Merck101513
אתנול מוחלטMerck818760
PBS תמיסת חיץ (pH 7.4)שהוכנה על ידי המסת 50 מ"מ Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, ו-68 מ"מ NaCl במי Milli-Q (18.2 MΩ)
מי מלח 0.85% משקל/נפחמוכן על ידי המסת 0.85 גרם NaCl ב-100 מ"ל מים Milli-Q (18.2 MΩ)
95% (3-מרקפטופרופיל)טרימתוקסילן (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals
ביוטיןSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
פלואורסצאין (DTAF)-סטרפטווידיןג'קסון ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
ארנב ביוטיניל IgGג'קסון מעבדות מחקר חיסוני בע"מ011-060-003
תיוג פלואורסצנטי נגד ארנב IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
תיוג פלואורסצנטי נגד עכברים IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
נוגדן ביוטיניל E. coliJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)סופק בנדיבות על ידי פרופ' סימה ירון, הטכניון
175617-PEO-iodoacetyl

מקורות

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744(2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126(2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3(2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439(2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385(2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797(2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019(2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361(2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108(1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393(2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636(2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250(2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375(2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327(2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084(2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859(2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775(2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755(2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230(2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502(2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656(2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49(2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305(1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669(2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951(2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817(2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. , Springer. 567(2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. , Springer. 105(2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803(2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003(2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339(2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , Springer. 83(2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חיישן ביולוגי מסיליקון מזוporousחיישן ביולוגי אופטיזיהוי E Coliחיישן ביולוגי ללא סימוןסרט סיליקון נקבוביקיבוע נוגדניםהתמרת פוריيه מהירהספקטרום החזר אורלכידת חיידקיםסימון פלואורסצנטי
זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.