נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), חבר אב הטיפוס של סוג Avulavirus של המשפחה 1 Paramyxoviridae, הוא שאינם מפולח תחושה שלילית,, חד גדילים, עטף וירוס RNA (איור 1) עם יישומים פוטנציאליים כוקטור לחיסון ו טיפול במחלות אנושיות. חקירה לעומק של יישומים אלה הפכה להיות אפשרית רק לאחר הקמתה של טכניקות גנטיקה הפוכה כדי להציל וירוסי רקומביננטי מפלסמידים קידוד הגנום המלא שלהם כcDNA 2-5. cDNA הנגיפי יכול להיות שונה בנוחות במבחנה באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים לשנות את גנוטיפ של הווירוס ו / או לכלול יחידות תעתיק חדשות. הצלה של וירוסים מהונדסים גנטי כזה מספקת כלי רב ערך כדי להבין את הגורמים המשפיעים על שלבים רבים של זיהום, כמו גם מאפשר פיתוח והשיפור של וקטורים לביטוי והאספקה של אנטיגניםלחיסון וטיפול. כאן אנו מתארים פרוטוקול להצלת NDVs רקומביננטי.
מבוא
נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), paramyxovirus עופות המשתייכים לסוג Avulavirus 1, הוא סוכן zoonotic כלכלי רלוונטי ובכך נחקר באופן נרחב ומעקבים, אשר באופן חמור יכול להשפיע על גידול עופות בכל רחבי העולם. למרות שלא הפתוגן אנושי, NDV גם נחקר ביסודיות מעבר לשדה הווטרינר הן כparamyxovirus מודל ובשל המאפיינים שלה מעניינים מאוד, הטבעיים oncolytic 6. מחקר על NDV תועלת רב מהפיתוח של טכניקות גנטיקה הפוכה לוירוסים חד גדילים, שאינם מפולחים תחושה השלילית RNA, שתוארו לראשונה על ידי וירוס כלבת Conzelmann וcoleagues 2. מגוון של NDVs מהונדס גנטי, שנשא גנים או שינויים של הגנום הסוג הבר זרים נחקרו בהרחבה מאז. עבוד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תאי יונקים (איור 4A, יום 1)
פיצול הפ-2 או A549 תאי היום לפני transfection ב6 גם צלחות. צפיפות של התאים צריכה להגיע למפגש 80-90% ביום שלמחרת. בדרך כלל, 100 מנה מ"מ מחוברות ניתן לפצל 8 בארות (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל טוב). שליציל את כל וירוס, יש לכלול 2-4 בארות שונות, כמו גם 2 בארות נוספות עבור פקדי pCAGGS-GFP וpCITE-GFP 18, שמטרתה לפקח על transfection ויעילות זיהום MVA-T7, בהתאמה.
2. זיהום של תאי יונקים עם וירוס Vaccinia אנקרה רקומביננטי השתנה הבעת ק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הצלה של NDV היא הליך מבוסס היטב, מבוצע באופן שיגרתי במעבדות שיש להם גישה לcDNA של הנגיף השלם. עם זאת, הטבע סטוכסטיים המהותי של השיטה הופך אותו לקשה להשגה 100% יעילות הצלה. ניטור השלבים המוקדמים של התהליך, במיוחד את יעילות transfection והזיהום עם MVA-T7, מסייע בזיהוי בעיות אפשריות. איור 5A תערוכות transfection סטנדרטי ויעילות transfection / זיהום שאינן מספיק להצלת NDV מוצלחת. אחרי הסיבובים של הגברה בשיתוף תרבויות עופות יונקות וביצי embryonated, נוכחות של וירוס הציל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מספר גורמים שיש להתחשב על מנת להשיג תוצאות טובות בזמן הצלת NDV. ראשית, מבנה cDNA באורך מלא כדי לשמש צריך להיות מתוכנן כדי לאפשר את השילוב הפונקציונלי של transgenes / השינויים החדשים לתוך הגנום NDV. משמעות דבר היא, כאמור לעיל, שרצפי הסוף (i) מתאים גנטית (GE), intergenic (IG) ותחילת גן (GS) הם שיש להוסיף אם נדרשו, (ii) אין רצפי GE או GS המשוערת לזרים גן, וכן (iii) הגנום רקומביננטי המלא כדלקמן "השלטון של שש".
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אדולפו גרסיה ססטרה היא ממציא פטנטים על וירוסי מחלת רקומביננטי ניוקאסל אשר בבעלות בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני.
תודות
מחברים מבקשים להודות לחברים בעבר ובהווה במעבדות של בני הזוג. פיטר Palese ואדולפו גרסיה ססטרה לפיתוח NDV הפוך טכניקות גנטיקה ולסיוע טכני. מחקר בנגיף מחלת ניוקאסל במעבדה AG-S ממומן חלקית על ידי NIAD להעניק R01AI088770 ועל ידי המחלקה לביטחון מולדת מרכז מדע וטכנולוגיה של אקסלנס למתעורר ומחלות zoonotic בעלי החיים (CEEZAD, מספר הפרס 2010-ST-061-AG001). מחקר במעבדה של LM-S ממומן על ידי מענקי NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, מרכזי NIAID למצוינות לחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700008C), ואוניברסיטת רוצ'סטר המרכז לBiodefense חיסון דוגמנות (HHSN272201000055C) .
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | CORNING Cellgro | 10-013-CV | כל ספק |
| OptiMEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 (LPF2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| 35% אלבומין בקר (BA) | Sigma | 232-936-2 | כל ספק |
| Trypsin-EDTA | CORNING Cellgro | 25-052-CI | כל ספק |
| פניצילין/סטרפטומיצין (PS) 100x | CORNING Cellgro | 30-002-CI | כל ספק |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | כל ספק |
| קווי תאים |
מקורות
- Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
- Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
