ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

במהלך העשורים האחרונים, וקטורים שמקורם באדנו-וירוסים (Ads) הוכיחו את יעילותם לטיפול גנטי וחיסון, כמו גם בווירותרפיה אונקוליטית ¹. Ads הם וירוסים איקוסהדרליים לא עטופים ממשפחת Adenoviridae, שבודדו מיונקים, ציפורים, זוחלים, דו-חיים ודגים. מאז גילוין ב-1953, מודעות נחקרו באופן אינטנסיבי כמודלים לחקר אינטראקציות בין וירוסים לתאים, ולאחרונה, כמערכות העברת גנים מבוססות וקטור ². ואכן, וקטורים מבוססי מודעות מציעים יתרונות רבים, כגון טווח המארחים הרחב והביולוגיה המאופיינת היטב שלהם, יחד עם הקלות שבה ניתן לתמרן ולהגביר אותם גנטית לייצור בקנה מידה גדול.

על מנת להתגבר על קשיים קליניים הקשורים לחסינות קיימת באוכלוסיות אנושיות כלפי וקטורים שמקורם ב-Ads ³ אנושיים, התחלנו ואחרים להפיק וקטורים מ-Ads ⁴ לא אנושיים. בנוסף, נראה כי וקטורים אדנו-ויראליים לא אנושיים מותאמים יותר לחיסון המוני ברפואה וטרינרית מאשר אדנו-וירוס מסוג 5 (Ad5) בשימוש קלאסי, מכיוון שהם צריכים להיות תואמים יותר לדרישות הבטיחות והאבטחה במהלך הערכת הסיכונים על ידי הרשויות הרגולטוריות הלאומיות. בסוף שנות ה-90 תיארנו את ה-CAV2 הרקומביננטי הראשון כחלופה לא אנושית לווקטורים שמקורם ב-Ad5 ⁵. מאז, מחקרים רבים אישרו את הפוטנציאל של וקטורים של CAV2 להעברת גנים טיפולית או אנטיגנית (לסקירות ^6,7). כמו מודעות אחרות, וקטורים שמקורם ב-CAV2 הם יציבים וניתן לייצר אותם בטיטרים גבוהים, מה שמקל על השימוש בהם in vivo. הם גם בטוחים, מכיוון שהם אינם אינטגרטיביים, אם כי הם מאפשרים ביטוי טרנסגנים לאורך זמן in vivo (>שנה אחת) ⁸. באופן מדהים, וטוב יותר מסרוטיפים אנושיים של ADS, וקטורי CAV2 הוכחו כנוירוטרופיים מאוד, עם הובלה לאחור יעילה מאוד באקסונים ^9,10. תכונה מהותית זו הביאה את הרעיון של שימוש בווקטורי CAV2 רקומביננטיים כדי להמיר נוירונים של אזורים ספציפיים במוח שבקושי נגישים לווקטורים לנטי-ויראליים, ששימשו עד כה בדרך כלל להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית ¹¹.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקלאסי לבנייה, ייצור וטיהור וקטורי CAV2 לא משוכפלים שמקורם בזן מנהטן. גנומים רקומביננטיים של CAV2 נבנים על ידי שיבוט הגן הרצוי המעניין (GOI) בקלטת במורד הזרם של המקדם המוקדם של הציטומגלווירוס (CMV), המספק ביטוי בכל מקום. לווקטורים של CAV2 יש יכולת שיבוט של ~4.2 kbp, המאפשרת ביטוי cDNA גדול. בשלב שני, קלטת ביטוי זו מוכנסת על ידי רקומבינציה הומולוגית במקום אזור E1 של גנום CAV2, מה שמוביל לנגיף לא משוכפל (dlE1), כפי שתואר בתחילה על ידי Chartier et al. ¹² לבסוף, חלקיקים נגיפיים מיוצרים עם טרנספקציה של הפלסמיד הגנומי לקו תאי כליה כלביים המבטא CAV2-E1 (DK-E1) ומוגברים באופן סדרתי לפני ריכוז וטיהור מלאי הנגיף. השיטה המתוארת כאן משתמשת באולטרה-צנטריפוגה דו-שלבית בשיפועי צזיום כלוריד (CsCl), המאפשרת העשרה של חלקיקים זיהומיים עם טיטר סופי גבוה (בדרך כלל מעל 10¹⁰ חלקיקים זיהומיים למ"ל). לאחר מכן, התרחיף הנגיפי מותפל על ידי כרומטוגרפיה דרך עמודות חד פעמיות של Sephadex G-25 כך שבסופו של דבר הוא טהור מספיק לשימוש ישיר in vivo.

1. בניית פלסמיד גנום CAV2 שאינו משכפל

הערה: כל הפלסמידים המתוארים בפרוטוקול זה תוארו בעבר⁷ וזמינים לפי בקשה.

1. שכפל את ה-GOI לתוך הפלסמיד pShuttle, באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים, כדי ליצור pShuttle-GOI (איור 1A).
2. עכל 2 מיקרוגרם של pShuttle-GOI על ידי AscI/PacI. העיכול משחרר את שבר המעבורת-GOI (~2.9 kbp + רצף GOI ORF) מעמוד השדרה של הפלסמיד (2.8 kbp).
3. טהר את שבר ה-Shuttle-GOI לאחר אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, באמצעות ג'ל NucleoSpin וערכת ניקוי PCR.
4. במקביל, עכל 1 מיקרוגרם של פלסמיד גנומי pCAV2 על ידי SwaI. הפלסמיד pCAV2 מכיל אתר SwaI ייחודי הממוקם באזור E1 (איור 1B). השבתת אנזים הגבלה זה בחום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. טרנספורמציה של חיידקי E. coli BJ5183 מוכשרים עם 500 ננוגרם של שבר Shuttle-GOI מטוהר ו-100 ננוגרם של פלסמיד pCAV2 ליניארי לרקומבינציה הומולוגית (Figure 1B). מורחים על לוחות LB-Amp. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות לפחות.
6. בצע ניתוח PCR ישירות על מושבות חיידקים באמצעות תערובת מאסטר של EmeraldAmp עם פריימרים קדימה (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCGTCTTCAA-3') והפוך (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), בתנאי הרכיבה הבאים: 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס (למחזור אחד), 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 58 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת/קילו-בp (למשך 39 מחזורים), ולבסוף 5 דקות ב-72 מעלות צלזיוס. תוצר של רצף 1 kbp + GOI ORF מוגבר משיבוטים חיוביים של pCAV-GOI, בעוד שלא ניתן לזהות מוצר PCR עם שיבוטים שליליים.
7. יש לחסן לפחות שתי מושבות חיוביות במהלך הלילה כל אחת ב-5 מ"ל LB-amp בינוני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר (220 סל"ד).
8. חלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד נוקלאוספין. הפוך חיידקי E. coli DH5α מוכשרים עם ציון של כל הכנת DNA. מורחים תרחיף חיידקים על לוחות LB-Amp ודוגרים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
9. יש לחסן שתי מושבות של כל שיבוט חיובי למשך הלילה ב-3 מ"ל LB-amp בינוני ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר (220 סל"ד). חלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד Nucleospin.
10. עכל את ה-DNA שנוצר ואת הפלסמיד ההורי pCAV2 (כבקרה) עם NdeI. דפוס ההגבלה של pCAV2 הורי הוא 14.8 kbp, 9 kbp, 7.9 kbp ו- 1.6 kbp. קלטת הביטוי של GOI מוכנסת בתוך שבר ה-7.9 kbp ומכילה לפחות אתר NdeI אחד, כלומר אחד בקלטת ובאתרים הפוטנציאליים הקיימים ב-GOI.
11. בחר קונסטרוקציות חיוביות והמשך לשלב 2 עם לפחות 2 שיבוטים עצמאיים.

2. טרנספקציה של פלסמיד גנום CAV2 רקומביננטי לתאי DK-E1

הערה: וקטורים לא משכפלים שמקורם ב-CAV2 הם אורגניזמים מהונדסים גנטית המסווגים כרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), בעוד שהשימוש בהם במודלים של בעלי חיים מסווג כ-BSL-1. אנא השתמש באמצעי בלימה וטיפול נאותים בפסולת, כולל ציוד מגן אישי, ועבוד מתחת למנדפי זרימה למינאריים BSL-2.

1. יום לפני הטרנספקציה, זרעו תאי DK-E1 על צלחת של 6 בארות. לגדל תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, המכיל 7% סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS), 1 מ"מ נתרן פירובט ו-100 U/ml פניצילין/100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. התאים צריכים להיות מתכנסים 70-80% לצורך טרנספקציה.
2. עכל 2 מיקרוגרם של פלסמיד pCAV-GOI עם AscI, כדי לשחרר את הרצף הלא ויראלי של הפלסמיד. בדוק את דפוס ההגבלה המתקבל על ידי 0.8% אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. העיכול אמור להניב שבר של ~31 kbp המכיל את הגנום הרקומביננטי ושבר של 2 kbp המתאים לעמוד השדרה של הפלסמיד.
3. מערבבים DNA מעוכל עם 200 מיקרוליטר של Jet Prime Buffer על ידי מערבולת למשך 10 שניות. מוסיפים 4 מיקרוליטר של Jet Prime ומערבבים על ידי מערבולת למשך 10 שניות. סובב קצרות כדי להסיר טיפות ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף את תערובת הטרנספקציה טיפתית לתאים. מנערים בעדינות את הצלחות כדי לפזר את התערובת באופן שווה ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס.

3. התפשטות של CAV2 רקומביננטי

1. שבוע לאחר הטרנספקציה, אספו תאים ומדיום תרבית בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל. לשבש תאים על ידי שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (-80 מעלות צלזיוס/37 מעלות צלזיוס) ולנקות את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,800 x גרם.
2. אוספים סופרנטנט ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס להתפשטות הנגיף לאחר מכן.
3. הדביקו שכבה חד-שכבתית של 80-90% של תאי DK-E1 הגדלים בבאר אחת של צלחת בת 6 בארות עם 0.5 מ"ל של הסופרנטנט המכיל את הנגיף. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, תחת תסיסה קלה. הסר את החיסון והחלף אותו ב-1.5 מ"ל של DMEM שלם המכיל 5% FCS מושבת חום.
4. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 ימים. יש לעקוב אחר התאים מדי יום להופעת אפקט ציטופתי (CPE, איורים 2A-B). אם לא נראה CPE ברור, קצרו תאים לאחר 4 ימי תרבית וחזרו על שלבים 3.1-3.4.
5. כאשר CPE ברור משפיע על רוב התאים, בדרך כלל לאחר 2-4 סבבי הגברה ויראליים, אוספים תאים עם מדיום תרבית ומקפיאים-מפשירים פי 3 כמתואר לעיל. הדביקו 80-90% תאי DK-E1 משולבים הגדלים בשלושה כלי תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ, תוך שימוש בכל פעם ב-0.5 מ"ל של סופרנטנט המכיל וירוס.
6. לאחר 3-4 ימים (כאשר CPE הושלם), קצרו תאים מכלים אלה בגודל 10 ס"מ, שוב משבשים אותם בשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה, מנקים את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,800 x גרם, אוספים סופרנטנט ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס להגברת CAV2 בקנה מידה גדול.

4. טיהור CAV2 בקנה מידה גדול

1. להדביק 80-90% חד-שכבות של תאי DK-E1 הגדלים בארבעים כלי תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ. עבור כל מנה, השתמש ב-0.1 מ"ל של סופרנטנט המכיל וירוסים מדולל ב-1 מ"ל של DMEM מלא ללא FCS. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 עד 4 שעות תחת תסיסה קלה. יש להוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 5% FCS.
2. דגירה למשך 3 ימים. קצרו תאים נגועים מארבעים הכלים של 10 ס"מ בצינורות פוליפרופילן של 50 מ"ל. תאי גלולה ב-1,200 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשעו אותם מחדש ב-15 מ"ל של מדיום DMEM.
3. לשבש תאים בשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (-80 מעלות צלזיוס/37 מעלות צלזיוס). הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה ב-1,800 x גרם למשך 10 דקות ואחסן סופרנטנט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני טיהור החלקיקים הנגיפיים.
4. הכן שיפוע CsCl לא רציף בשפופרת Ultra-Clear של 14 מ"ל. ראשית, שפכו 2 מ"ל של תמיסת CsCl (1.40 גרם/מ"ל במי מלח עם פוספט) בתחתית הצינור. לאחר מכן, הוסיפו לאט 2 מ"ל של תמיסת CsCl (1.25 גרם/מ"ל במי מלח עם פוספט) על גבי התמיסה הראשונה.
5. טען בזהירות את הסופרנטנט הנגיפי על גבי שיפוע CsCl. מלאו את הצינור בשמן מינרלי עד 2-3 מ"מ מלמעלה. צנטריפוגה למשך שעה וחצי בטמפרטורה של 130,000 x גרם ו-18 מעלות צלזיוס ברוטור SW40 מתנדנד.
6. לאחר הצנטריפוגה, שני פסים לבנים נראים בבירור בממשק בין 2 שכבות התמיסה CsCl (איור 2C). בעזרת מחט 21 גרם ומזרק, אסוף בצד לנקב את הרצועה התחתונה המכילה חלקיקי CAV2 בוגרים. נסה ככל האפשר להימנע מאיסוף הרצועה העליונה, המתאימה לחלקיקים נגיפיים ריקים.
7. הכן שיפוע CsCl רציף בשפופרת שקופה של 14 מ"ל על ידי ערבוב החלקיקים הנגיפיים שנאספו עם תמיסת CsCl (1.34 גרם/מ"ל במי מלח חוצצים פוספט). מלאו את הצינור בשמן מינרלי עד 2-3 מ"מ מלמעלה. צנטריפוגה למשך 18 שעות ב-130,000 x גרם ו-18 מעלות צלזיוס ברוטור SW40 מתנדנד.
8. לאחר הצנטריפוגה, יש לאסוף את הרצועה הלבנה המכילה CAV2 לנקב זה לצד זה בעזרת מזרק כמתואר לעיל. שוב, נסה להימנע מאיסוף הרצועה העליונה שנותרה. זה אמור להיות קל יותר בשיפוע רציף זה, המפריד בין שתי הרצועות טוב יותר. הנפח הכולל של התרחיף שנאסף לא יעלה על 2 מ"ל.
9. אזן עמודת Sephadex G-25 PD-10 עם 30 מ"ל PBS.
10. טען את התרחיף הנגיפי והשליך את הזרימה.
11. עם שברים של 500 מיקרוליטר של PBS. אסוף שברים 5-7, המכילים בדרך כלל את חלקיקי CAV2 המומלחים. ניתן לזהות בקלות את השברים המכילים את הנגיף מכיוון שהם זוהרים. הוסף 150 מיקרוליטר גליצרול ל-1.5 מ"ל של תרחיף CAV2 ואחסן במיניקוטים ב-80 מעלות צלזיוס.

5. טיטרציה של CAV2 על ידי דילול נקודת קצה

1. הפשירו כמות גדולה של וירוס מטוהר על קרח ובצעו דילולים סדרתיים פי 10 (החל ^{מ-10-2-10-12}) ב-DMEM ללא סרום.
2. הוסף 50 מיקרוליטר מכל דילול ויראלי ב -5 בארות של צלחת של 96 בארות. הוסף 1.5 x 10⁴ תאי DK-E1 בכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 5 ימים.
3. ביום החמישי לאחר ההדבקה, עקבו אחר הופעת CPE על ידי תצפית מיקרוסקופית (איורים 2A-B). טיטרים זיהומיים נקבעים כמינונים זיהומיים חציוניים של תרבית רקמה (TCID₅₀), תוך שימוש בשיטה הסטטיסטית של ריד ומונץ'¹³.

ייצור וקטורי CAV2 רקומביננטיים מסתמך על טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות אך חשובות. לפני ייצור וקטורים ויראליים, אכן יש צורך לבנות גנום CAV2 רקומביננטי הנושא קלטת ביטוי עבור הטרנסגן. בנייה זו כוללת שני שלבים: ראשית, הגן המעניין (GOI) משובט בפלסמיד מעבורת כקלטת ביטוי (כלומר עם אות מקדם ופוליאדנילציה). אלמנט פונקציונלי זה מוקף בשני רצפים גנומיים שמקורם ב-CAV2, המייצגים את אזורי הרקומבינציה במעלה הזרם ובמורד הזרם (איור 1A). בשלב שני, קלטת הביטוי מוחדרת מפלסמיד המעבורת לגנום CAV2, באמצעות רקומבינציה הומולוגית (איור 1B). הליניאריזציה של שני רכיבי הדנ"א תבטיח הצלחה טובה יותר של שלב זה (ראו אתרים לעיכול AscI ו-PacI ב-pShuttle ו-SwaI ב-pCAV2 באיור 1). הכנסת קלטת הביטוי של GOI תוביל למחיקת E1 בגנום הרקומביננטי.

לאחר השגת הפלסמיד הגנומי הרקומביננטי, חלקיקים נגיפיים מיוצרים באמצעות תאי DK-E1 המשלימים CAV2-E1. אפקט ציטופתי ברור, הנובע מהכמות הגדולה של חלקיקים נגיפיים המיוצרים בתאים נגועים, ניתן להמחשה בקלות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2A), או על ידי ביטוי טרנסגנים (דוגמה לווקטור CAV2 המבטא GFP, איור 2B). לאחר מספר סבבי הגברה ויראלית באמצעות תאי DK-E1 טריים, חלקיקים נגיפיים מטוהרים על ידי אולטרה-צנטריפוגה על שיפועי צזיום כלוריד. חלקיקים נגיפיים מרוכזים מופיעים כשתי רצועות זוהרות בתוך שיפוע הצזיום (איור 2C). הרצועה העליונה (הקלה יותר) מכילה חלקיקים ריקים ולא זיהומיים ויש להימנע מהם.

ניתן להשתמש בווקטור ה-CAV2 הרקומביננטי שנוצר כדי להמיר כמעט את כל סוגי התאים, במגוון רחב של מינים, במבחנה או in vivo. כאן אנו מראים דוגמה אחת ליישום: התמרה של מערכת העצבים המרכזית של העכבר באמצעות הזרקה סטריאוטקטית. מכיוון שפרוטוקול זה מניב מלאי ויראלי טהור וטיטר גבוה, הזרקה של 1 מיקרוליטר של וקטור CAV2 המבטא GFP מדולל PBS (5 x 105 TCID50) בפיתול המשונן, (DG, איור 3, למעלה) מובילה להתמרה עצבית של 40-50%. יתר על כן, בשל היכולת של CAV2 להיות מועבר רטרוגרדית באקסונים, הזרקה של 2 מיקרוליטר של וקטור CAV2 המבטא GFP מדולל PBS (2 x 106 TCID50) בסטריאטום העכבר מאפשרת התמרה של כמעט 80% מהנוירונים הניגרוסטריאטליים ב-Substancia Nigra pars compacta (SNpc, איור 3, למטה).

איור 1. ייצוג סכמטי של יצירת גנום CAV2 לא משוכפל באמצעות רקומבינציה הומולוגית. (A) ייצוג סכמטי של הפלסמיד pShuttle הנושא רצפי יעד רקומבינציה (RS) במעלה הזרם ובמורד הזרם המשותפים גם לווקטור הגנום CAV2 (באפור). התוכנית מציינת גם את המיקום של אתרי הגבלת AscI ו-PacI, מקדם ה-CMV, אות ה-polyA, כמו גם של אתר השיבוט המרובה (MCS) כדי להכניס את הגן המעניין (GOI). (B) ייצוג סכמטי של הרקומבינציה ההומולוגית בין הרצף הגנומי CAV2 לרצף הרקומבינציה AscI/PacI של הפלסמיד pShuttle-GOI. אתר ההגבלה של SwaI (ליניאריזציה של הגנום) ותכונות של קצה 5' של גנום CAV2 כלומר החזרה הטרמינלית הפנימית (ITR), אות האנקפסידציה (φ), גנים המקודדים את חלבוני E1A, E1B ו-IX המוקדמים מיוצגים גם הם. הרקומבינציה ההומולוגית מובילה להחלפת E1A וחלק מהגנים E1B בקלטת הביטוי של GOI. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. תוצאות מייצגות של שלבי ייצור CAV2. (א-ב) תאי DK-E1 נצפו באמצעות שדה בהיר (A) או פלואורסצנטי (B), במקרה של וקטור CAV2 המבטא GFP, מיקרוסקופיה (100X). במהלך שלבי ההגברה הראשונים או לטיטרציה של הנגיף, נצפים מוקדים בודדים של השפעה ציטופתית. (C) רצועות המכילות CAV2 נראות בבירור בסוף הצנטריפוגה הלא רציפה של שיפוע CsCl, כאשר הרצועה העליונה מתאימה לחלקיקים ריקים והפס התחתון ל-CAV2 רקומביננטי בוגר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. תוצאות מייצגות של העברת גנים במערכת העצבים המרכזית באמצעות CAV2. GFP המבטא CAV2 הוזרק על ידי סטריאוטקסיה באזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית. התמונה העליונה מציגה תוצאות מייצגות של התמרה של נוירונים בהיפוקמפוס של עכבר, לאחר הזרקה סטריאוטקטית של 1 x 106 TCID50 בפיתול המשוננים (GD) ו-5 x 105 TCID50 באזורי Cornus Ammonis 1 (CA1). עבור התמונות התחתונות, 2 x 106 TCID50 הוזרקו באופן סטריאוטקסי בסטריאטום של עכברים וצביעת GFP נבדקה בסטריאטום (STR, למטה משמאל) או ב-Substantia Nigra pars compacta (SNpc, למטה מימין), כדי להדגים את היכולת של וקטורי CAV2 להיות מועברים רטרוגרדית מאזור CNS אחד למשנהו. ביטוי GFP נבדק שבועיים לאחר החיסון הווקטורי. חשוב לציין, כמעט ולא זוהתה תגובה חיסונית בשלב זה, כפי שנבדק על ידי צביעת IBA-1 עבור מיקרוגליה מופעלת (לא מוצג). הפסים הלבנים מתאימים ל-100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

לסופרים אין מה לחשוף.