מאמר שיטה

ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

DOI:

10.3791/50833

⸱

3 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וקטורים שמקורם באדנו-וירוס (Ad) היו בשימוש נרחב להעברת גנים לטווח קצר או ארוך, הן לטיפול גנטי והן ליישומי חיסונים. בגלל החסינות התכופה הקיימת מראש נגד אדנו-וירוס אנושי מסוג 5 בשימוש קלאסי, אדנו-וירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוצע כווקטור חלופי להעברת גנים אנושיים. הביולוגיה המאופיינת היטב של CAV2, יחד עם קלות המניפולציה הגנטית שלו, מציעים יתרונות גדולים, במיוחד להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית, או לגרימת מגוון רחב של תגובות חיסוניות מגנות, מהומורל ועד חסינות תאית. כיום, CAV2 מייצג את אחד האדנו-וירוסים הלא אנושיים המושכים ביותר לשימוש כווקטור חיסון. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבנייה, ייצור וטיטרציה של וקטורי CAV2 רקומביננטיים. לאחר שיבוט קלטת הביטוי של הגן המעניין לפלסמיד מעבורת, הפלסמיד הגנומי הרקומביננטי מתקבל על ידי רקומבינציה הומולוגית בזן החיידקים E. coli BJ5183. לאחר מכן, הפלסמיד הגנומי שנוצר מועבר לתאי כליה כלביים המבטאים את הגנים המשלימים CAV2-E1 (DK-E1). הגברה ויראלית מאפשרת ייצור של מלאי ויראלי גדול, אשר מטוהר על ידי אולטרה-צנטריפוגה באמצעות שיפועי צזיום כלוריד ומותפל על ידי דיאליזה. לתרחיף הנגיפי המתקבל יש באופן שגרתי טיטר של מעל 1010 חלקיקים זיהומיים למ"ל וניתן לתת אותו ישירות in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשורים האחרונים, וקטורים שמקורם באדנו-וירוסים (Ads) הוכיחו את יעילותם לטיפול גנטי וחיסון, כמו גם בווירותרפיה אונקוליטית 1. Ads הם וירוסים איקוסהדרליים לא עטופים ממשפחת Adenoviridae, שבודדו מיונקים, ציפורים, זוחלים, דו-חיים ודגים. מאז גילוין ב-1953, מודעות נחקרו באופן אינטנסיבי כמודלים לחקר אינטראקציות בין וירוסים לתאים, ולאחרונה, כמערכות העברת גנים מבוססות וקטור 2. ואכן, וקטורים מבוססי מודעות מציעים יתרונות רבים, כגון טווח המארחים הרחב והביולוגיה המאופיינת היטב שלהם, יחד עם הקלות שבה ניתן לתמרן ולהגביר אותם גנטית לייצור בקנה מידה גדול.

על מנת להתגבר על קשיים קליניים הקשורים לחסינות קיימת באוכלוסיות אנושיות כלפי וקטורים שמקורם ב-Ads 3 אנושיים, התחלנו ואחרים להפיק וקטורים מ-Ads 4 לא אנושיים. בנוסף, נראה כי וקטורים אדנו-ויראליים לא אנושיים מותאמים יותר לחיסון המוני ברפואה וטרינרית מאשר אדנו-וירוס מסוג 5 (Ad5) בשימוש קלאסי, מכיוון שהם צריכים להיות תואמים יותר לדרישות הבטיחות והאבטחה במהלך הערכת הסיכונים על ידי הרשויות הרגולטוריות הלאומיות. בסוף שנות ה-90 תיארנו את ה-CAV2 הרקומביננטי הראשון כחלופה לא אנושית לווקטורים שמקורם ב-Ad5 5. מאז, מחקרים רבים אישרו את הפוטנציאל של וקטורים של CAV2 להעברת גנים טיפולית או אנטיגנית (לסקירות 6,7). כמו מודעות אחרות, וקטורים שמקורם ב-CAV2 הם יציבים וניתן לייצר אותם בטיטרים גבוהים, מה שמקל על השימוש בהם in vivo. הם גם בטוחים, מכיוון שהם אינם אינטגרטיביים, אם כי הם מאפשרים ביטוי טרנסגנים לאורך זמן in vivo (>שנה אחת) 8. באופן מדהים, וטוב יותר מסרוטיפים אנושיים של ADS, וקטורי CAV2 הוכחו כנוירוטרופיים מאוד, עם הובלה לאחור יעילה מאוד באקסונים 9,10. תכונה מהותית זו הביאה את הרעיון של שימוש בווקטורי CAV2 רקומביננטיים כדי להמיר נוירונים של אזורים ספציפיים במוח שבקושי נגישים לווקטורים לנטי-ויראליים, ששימשו עד כה בדרך כלל להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית 11.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקלאסי לבנייה, ייצור וטיהור וקטורי CAV2 לא משוכפלים שמקורם בזן מנהטן. גנומים רקומביננטיים של CAV2 נבנים על ידי שיבוט הגן הרצוי המעניין (GOI) בקלטת במורד הזרם של המקדם המוקדם של הציטומגלווירוס (CMV), המספק ביטוי בכל מקום. לווקטורים של CAV2 יש יכולת שיבוט של ~4.2 kbp, המאפשרת ביטוי cDNA גדול. בשלב שני, קלטת ביטוי זו מוכנסת על ידי רקומבינציה הומולוגית במקום אזור E1 של גנום CAV2, מה שמוביל לנגיף לא משוכפל (dlE1), כפי שתואר בתחילה על ידי Chartier et al. 12 לבסוף, חלקיקים נגיפיים מיוצרים עם טרנספקציה של הפלסמיד הגנומי לקו תאי כליה כלביים המבטא CAV2-E1 (DK-E1) ומוגברים באופן סדרתי לפני ריכוז וטיהור מלאי הנגיף. השיטה המתוארת כאן משתמשת באולטרה-צנטריפוגה דו-שלבית בשיפועי צזיום כלוריד (CsCl), המאפשרת העשרה של חלקיקים זיהומיים עם טיטר סופי גבוה (בדרך כלל מעל 1010 חלקיקים זיהומיים למ"ל). לאחר מכן, התרחיף הנגיפי מותפל על ידי כרומטוגרפיה דרך עמודות חד פעמיות של Sephadex G-25 כך שבסופו של דבר הוא טהור מספיק לשימוש ישיר in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית פלסמיד גנום CAV2 שאינו משכפל

הערה: כל הפלסמידים המתוארים בפרוטוקול זה תוארו בעבר7 וזמינים לפי בקשה.

  1. שכפל את ה-GOI לתוך הפלסמיד pShuttle, באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים, כדי ליצור pShuttle-GOI (איור 1A).
  2. עכל 2 מיקרוגרם של pShuttle-GOI על ידי AscI/PacI. העיכול משחרר את שבר המעבורת-GOI (~2.9 kbp + רצף GOI ORF) מעמוד השדרה של הפלסמיד (2.8 kbp).
  3. טהר את שבר ה-Shuttle-GOI לאחר אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, באמצעות ג'ל NucleoSpin וערכת ניקוי PCR.
  4. במקביל, עכל 1 מיקרוגרם של פלסמיד גנומי pCAV2 על ידי SwaI. הפלסמיד pCAV2 מכיל אתר SwaI ייחודי הממוקם באזור E1 (איור 1B). השבתת אנזים הגבלה זה בחום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. טרנספורמציה של חיידקי E. coli BJ5183 מוכשרים עם 500 ננוגרם של שבר Shuttle-GOI מטוהר ו-100 ננוגרם של פלסמיד pCAV2 ליניארי לרקומבינציה הומולוגית (Figure 1B). מורחים על לוחות LB-Amp. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות לפחות.
  6. בצע ניתוח PCR ישירות על מושבות חיידקים באמצעות תערובת מאסטר של EmeraldAmp עם פריימרים קדימה (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCGTCTTCAA-3') והפוך (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), בתנאי הרכיבה הבאים: 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס (למחזור אחד), 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 58 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת/קילו-בp (למשך 39 מחזורים), ולבסוף 5 דקות ב-72 מעלות צלזיוס. תוצר של רצף 1 kbp + GOI ORF מוגבר משיבוטים חיוביים של pCAV-GOI, בעוד שלא ניתן לזהות מוצר PCR עם שיבוטים שליליים.
  7. יש לחסן לפחות שתי מושבות חיוביות במהלך הלילה כל אחת ב-5 מ"ל LB-amp בינוני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר (220 סל"ד).
  8. חלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד נוקלאוספין. הפוך חיידקי E. coli DH5α מוכשרים עם ציון של כל הכנת DNA. מורחים תרחיף חיידקים על לוחות LB-Amp ודוגרים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
  9. יש לחסן שתי מושבות של כל שיבוט חיובי למשך הלילה ב-3 מ"ל LB-amp בינוני ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר (220 סל"ד). חלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד Nucleospin.
  10. עכל את ה-DNA שנוצר ואת הפלסמיד ההורי pCAV2 (כבקרה) עם NdeI. דפוס ההגבלה של pCAV2 הורי הוא 14.8 kbp, 9 kbp, 7.9 kbp ו- 1.6 kbp. קלטת הביטוי של GOI מוכנסת בתוך שבר ה-7.9 kbp ומכילה לפחות אתר NdeI אחד, כלומר אחד בקלטת ובאתרים הפוטנציאליים הקיימים ב-GOI.
  11. בחר קונסטרוקציות חיוביות והמשך לשלב 2 עם לפחות 2 שיבוטים עצמאיים.

2. טרנספקציה של פלסמיד גנום CAV2 רקומביננטי לתאי DK-E1

הערה: וקטורים לא משכפלים שמקורם ב-CAV2 הם אורגניזמים מהונדסים גנטית המסווגים כרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), בעוד שהשימוש בהם במודלים של בעלי חיים מסווג כ-BSL-1. אנא השתמש באמצעי בלימה וטיפול נאותים בפסולת, כולל ציוד מגן אישי, ועבוד מתחת למנדפי זרימה למינאריים BSL-2.

  1. יום לפני הטרנספקציה, זרעו תאי DK-E1 על צלחת של 6 בארות. לגדל תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, המכיל 7% סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS), 1 מ"מ נתרן פירובט ו-100 U/ml פניצילין/100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. התאים צריכים להיות מתכנסים 70-80% לצורך טרנספקציה.
  2. עכל 2 מיקרוגרם של פלסמיד pCAV-GOI עם AscI, כדי לשחרר את הרצף הלא ויראלי של הפלסמיד. בדוק את דפוס ההגבלה המתקבל על ידי 0.8% אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. העיכול אמור להניב שבר של ~31 kbp המכיל את הגנום הרקומביננטי ושבר של 2 kbp המתאים לעמוד השדרה של הפלסמיד.
  3. מערבבים DNA מעוכל עם 200 מיקרוליטר של Jet Prime Buffer על ידי מערבולת למשך 10 שניות. מוסיפים 4 מיקרוליטר של Jet Prime ומערבבים על ידי מערבולת למשך 10 שניות. סובב קצרות כדי להסיר טיפות ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הוסף את תערובת הטרנספקציה טיפתית לתאים. מנערים בעדינות את הצלחות כדי לפזר את התערובת באופן שווה ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס.

3. התפשטות של CAV2 רקומביננטי

  1. שבוע לאחר הטרנספקציה, אספו תאים ומדיום תרבית בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל. לשבש תאים על ידי שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (-80 מעלות צלזיוס/37 מעלות צלזיוס) ולנקות את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,800 x גרם.
  2. אוספים סופרנטנט ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס להתפשטות הנגיף לאחר מכן.
  3. הדביקו שכבה חד-שכבתית של 80-90% של תאי DK-E1 הגדלים בבאר אחת של צלחת בת 6 בארות עם 0.5 מ"ל של הסופרנטנט המכיל את הנגיף. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, תחת תסיסה קלה. הסר את החיסון והחלף אותו ב-1.5 מ"ל של DMEM שלם המכיל 5% FCS מושבת חום.
  4. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 ימים. יש לעקוב אחר התאים מדי יום להופעת אפקט ציטופתי (CPE, איורים 2A-B). אם לא נראה CPE ברור, קצרו תאים לאחר 4 ימי תרבית וחזרו על שלבים 3.1-3.4.
  5. כאשר CPE ברור משפיע על רוב התאים, בדרך כלל לאחר 2-4 סבבי הגברה ויראליים, אוספים תאים עם מדיום תרבית ומקפיאים-מפשירים פי 3 כמתואר לעיל. הדביקו 80-90% תאי DK-E1 משולבים הגדלים בשלושה כלי תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ, תוך שימוש בכל פעם ב-0.5 מ"ל של סופרנטנט המכיל וירוס.
  6. לאחר 3-4 ימים (כאשר CPE הושלם), קצרו תאים מכלים אלה בגודל 10 ס"מ, שוב משבשים אותם בשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה, מנקים את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,800 x גרם, אוספים סופרנטנט ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס להגברת CAV2 בקנה מידה גדול.

4. טיהור CAV2 בקנה מידה גדול

  1. להדביק 80-90% חד-שכבות של תאי DK-E1 הגדלים בארבעים כלי תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ. עבור כל מנה, השתמש ב-0.1 מ"ל של סופרנטנט המכיל וירוסים מדולל ב-1 מ"ל של DMEM מלא ללא FCS. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 עד 4 שעות תחת תסיסה קלה. יש להוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא בתוספת 5% FCS.
  2. דגירה למשך 3 ימים. קצרו תאים נגועים מארבעים הכלים של 10 ס"מ בצינורות פוליפרופילן של 50 מ"ל. תאי גלולה ב-1,200 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשעו אותם מחדש ב-15 מ"ל של מדיום DMEM.
  3. לשבש תאים בשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (-80 מעלות צלזיוס/37 מעלות צלזיוס). הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה ב-1,800 x גרם למשך 10 דקות ואחסן סופרנטנט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני טיהור החלקיקים הנגיפיים.
  4. הכן שיפוע CsCl לא רציף בשפופרת Ultra-Clear של 14 מ"ל. ראשית, שפכו 2 מ"ל של תמיסת CsCl (1.40 גרם/מ"ל במי מלח עם פוספט) בתחתית הצינור. לאחר מכן, הוסיפו לאט 2 מ"ל של תמיסת CsCl (1.25 גרם/מ"ל במי מלח עם פוספט) על גבי התמיסה הראשונה.
  5. טען בזהירות את הסופרנטנט הנגיפי על גבי שיפוע CsCl. מלאו את הצינור בשמן מינרלי עד 2-3 מ"מ מלמעלה. צנטריפוגה למשך שעה וחצי בטמפרטורה של 130,000 x גרם ו-18 מעלות צלזיוס ברוטור SW40 מתנדנד.
  6. לאחר הצנטריפוגה, שני פסים לבנים נראים בבירור בממשק בין 2 שכבות התמיסה CsCl (איור 2C). בעזרת מחט 21 גרם ומזרק, אסוף בצד לנקב את הרצועה התחתונה המכילה חלקיקי CAV2 בוגרים. נסה ככל האפשר להימנע מאיסוף הרצועה העליונה, המתאימה לחלקיקים נגיפיים ריקים.
  7. הכן שיפוע CsCl רציף בשפופרת שקופה של 14 מ"ל על ידי ערבוב החלקיקים הנגיפיים שנאספו עם תמיסת CsCl (1.34 גרם/מ"ל במי מלח חוצצים פוספט). מלאו את הצינור בשמן מינרלי עד 2-3 מ"מ מלמעלה. צנטריפוגה למשך 18 שעות ב-130,000 x גרם ו-18 מעלות צלזיוס ברוטור SW40 מתנדנד.
  8. לאחר הצנטריפוגה, יש לאסוף את הרצועה הלבנה המכילה CAV2 לנקב זה לצד זה בעזרת מזרק כמתואר לעיל. שוב, נסה להימנע מאיסוף הרצועה העליונה שנותרה. זה אמור להיות קל יותר בשיפוע רציף זה, המפריד בין שתי הרצועות טוב יותר. הנפח הכולל של התרחיף שנאסף לא יעלה על 2 מ"ל.
  9. אזן עמודת Sephadex G-25 PD-10 עם 30 מ"ל PBS.
  10. טען את התרחיף הנגיפי והשליך את הזרימה.
  11. עם שברים של 500 מיקרוליטר של PBS. אסוף שברים 5-7, המכילים בדרך כלל את חלקיקי CAV2 המומלחים. ניתן לזהות בקלות את השברים המכילים את הנגיף מכיוון שהם זוהרים. הוסף 150 מיקרוליטר גליצרול ל-1.5 מ"ל של תרחיף CAV2 ואחסן במיניקוטים ב-80 מעלות צלזיוס.

5. טיטרציה של CAV2 על ידי דילול נקודת קצה

  1. הפשירו כמות גדולה של וירוס מטוהר על קרח ובצעו דילולים סדרתיים פי 10 (החל מ-10-2-10-12) ב-DMEM ללא סרום.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר מכל דילול ויראלי ב -5 בארות של צלחת של 96 בארות. הוסף 1.5 x 104 תאי DK-E1 בכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5 ימים.
  3. ביום החמישי לאחר ההדבקה, עקבו אחר הופעת CPE על ידי תצפית מיקרוסקופית (איורים 2A-B). טיטרים זיהומיים נקבעים כמינונים זיהומיים חציוניים של תרבית רקמה (TCID50), תוך שימוש בשיטה הסטטיסטית של ריד ומונץ'13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור של וקטורי CAV2 רקומביננטיים מתבסס על טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות אך חשובות. לפני ייצור הוקטורים הויראליים, יש צורך לבנות גנום CAV2 רקומביננטי הנושא קסטת ביטוי עבור הגן המועבר. בנייה זו כוללת שני שלבים: ראשית, הגן המבוקש (GOI) משתבץ בתוך פלסמיד מעביר (shuttle plasmid) כקסטת ביטוי (כלומר, עם מקדם ואות פוליאדנילציה). רכיב תפקודי זה מוקף על ידי שני רצפים גנומיים המופקים מ-CAV2, המייצגים את אזורי הרקומבינציה במעלה ובמורד הזרם (איור 1A). בשלב שני, קסטת הביטוי מוחדרת מהפלסמיד המעביר אל גנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה הפשוטה המתוארת כאן, המותאמת מטכנולוגיית Ad5 המתועדת היטב, מאפשרת ייצור יעיל של וקטורי CAV2 לא משוכפלים עם יכולת שיבוט טיפוסית של ~4.2 kbp. לגבי שיקולי זמן, גנום CAV2 רקומביננטי נוצר בדרך כלל תוך שבועיים, בעוד שייקח 5 שבועות נוספים להגביר, לטהר ולטיטר תרחיפים ויראליים.

למרות שייצור האצווה הראשונה של וקטורים שמקורם ב-CAV2 עשוי להיראות גוזל זמן, יש להזכיר כי ייצור CAV2 דורש רק העברה ראשונית של באר אחת של צלחת 6 בארות, מה שממזער את העלויות לייצור פלסמיד, ריאגנטים טרנספקציה וכו'. יתר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה כספית על ידי מענקים מ-INSERM, CNRS, הקרן למחקר רפואי והסוכנות הלאומית למחקר (ANR-10-Blanc-1322) ל-D.G-D; תוכנית המסגרת השביעית של הנציבות האירופית ל-B.K.; M.S. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מ-FRM (תוכנית "Equipe FRM 2009"); C.B. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מ-UE, תחת הסכם מענק מספר 245266 (Orbivac).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנזימי הגבלהניו אינגלנד Biolabs
של Jet Prime Polyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. coli חיידקי BJ5183 Agilent200154
PD-10 עמודת התפלהGE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp פולימראזTakaraRR320A
NucleospinMacherey-Nagel740558.250
NucleoSpin Gel וניקוי PCRMacherey-Nagel740609.50
שפופרות 14 מ"ל, Ultra ClearBeckman344060
ערכת טרנספקציה שונים ערכת פלסמיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
  2. Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
  3. Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
  4. Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
  5. Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
  6. Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
  7. Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
  8. Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
  9. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
  10. Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
  11. Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
  12. Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
  13. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  14. Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
  15. Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
  16. Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
  17. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
  18. Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
  19. Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים