פעילותם של נוירונים בודדים מעכברים בגיל מבוגרים ניתן ללמוד על ידי מתנער נוירונים מאזורים מסוימים במוח ובאמצעות הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה ניאון. על ידי תגובות בדיקות לשינויים ברמת סוכר, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את רגישות הגלוקוז של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרים של פעילות עצבית לעתים קרובות מבוצעים באמצעות נוירונים ממכרסמים פחות מ -2 חודשים של גיל בשל הקשיים הטכניים הקשורים לרקמת חיבור גוברת וירידה בכדאיות עצבית המתרחשות עם גיל. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לניתוק של נוירונים ההיפותלמוס בריאים מעכברים בגיל מבוגר. היכולת ללמוד נוירונים מעכברים בוגרים בגיל מאפשרת שימוש במודלי מחלה המתבטא בגיל מאוחר יותר והוא עשוי להיות יותר מבחינה התפתחותית מדויק ללימודים מסוימים. דימות פלואורסצנטי של נוירונים ניתקו יכולה לשמש כדי לחקור את הפעילות של אוכלוסייה של נוירונים, בניגוד לשימוש באלקטרופיזיולוגיה ללמוד נוירון בודד. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר לומד אוכלוסייה עצבית הטרוגניות שבהן הסוג העצבי הרצוי הוא נדיר כגון לתאי עצב גלוקוז חישת ההיפותלמוס. אנו מנוצלים הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים ללמוד את התגובות שלהם לצ'הnges ברמת הגלוקוז החוץ תאי. הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד בויסות מאזן אנרגיה מרכזית. היכולת ללמוד חישת הגלוקוז במכרסמים מבוגרים היא שימושית במיוחד מאז דומיננטיות של מחלות הקשורות לאיזון מתפקד אנרגיה (למשל. השמנת יתר) עם עלייה בגיל.
מבוא
המוח מווסת הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות נוירואנדוקריניים ומערכת עצבים אוטונומית. ההיפותלמוס ventromedial (VMH), מורכב מגרעין ventromedial (VMN) וגרעין מקושת (ARC), הוא חשוב לרגולציה של הומאוסטזיס אנרגיה המרכזית. נוירונים חישת הגלוקוז מיוחדים, בתוך VMH, לקשר פעילות עצבית והומאוסטזיס הגלוקוז פריפרית 1. ישנם שני סוגים של גלוקוז חישת תאי עצב; גלוקוז נרגשים (GE) נוירונים להגדיל בעוד גלוקוז עכבות הנוירונים (GI) להקטין את פעילותם עם עלייה ברמת סוכר תאית. נוירונים גלוקוז VMH חישה בדרך כלל למדו באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה צבע סיד / קרום פוטנציאלי רגישה.
ט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בעלי חיים
- כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה לרפואה ורפואת השיניים של ניו ג'רזי.
- זכר בית הקבוצה עכברי C57BL / 6 בלוח זמנים חשוך שעות light/12 שעות 12 וגישה כרצונך מודעת מזון ומים מאפשרים. להקריב בגיל 4-5 חודשים. המתת חסד של העכברים בוצע באמצעות המטוס של הרדמה כירורגית וצורה משנית של המתת חסד (כלומר חודר חתך לתוך חלל החזה דרך הסרעפת). זה עולה בקנה אחד עם הנחיות AVMA על המתת חסד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הנתיחה המדויקת של VMH הרחק מאזורי ההיפותלמוס אחרים היא חשובה כדי להשיג תוצאות עקביות. הכללת אזורים אחרים יכולה לדלל את האוכלוסייה העצבית VMH, שינוי% מתאי עצב depolarized המחושב. יתר על כן, תאי עצב חישת הגלוקוז זוהו באזורי ההיפותלמוס אחרים, כגון ההיפותלמוס לרוחב, שעשויות להיות שונה מבחינה תפקודית ואופן מכניסטי מתא עצב גלוקוז חישת VMH. איור 1 מדגים את המקומות אנטומיים הנכונים לנתיחה תקינה. בעקבות הפרוטוקול לעיל, יכולה להיות מנותקת רקמת המוח המכילה את אזור VMH הנכון........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המפתח ליכולת ללמוד פעילות של נוירונים מעכברים בוגרים הוא היכולת לנתק את תאי העצב בריאים. דיסוציאציה של נוירונים ההיפותלמוס מעכברים בוגרים קשה יותר בכמה שלבים עיקריים בפרוטוקול בהשוואה לנוירונים מעכברים לנוער. יש לנו להתגבר על בעיה זו במספר הדרכים. מה שהופך את פרוסות 500 מוח מיקרומטר עבות ממזער את הנזק מכאני לתאי עצב בהשוואה ל 250-350 מיקרומטר הפרוסות הרגילות המשמשות לרקמת מוח מעכברים צעירים יותר. עם זאת, פרוסות עבות יותר דורשות תשומת לב רבה יותר לזלוף לב ועיכול פפאין של רקמת המוח........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לנו מה למסור.
תודות
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Neurobasal-A בינוני (מותאם אישית) | Invitrogen | 0050128DJ | מותאם אישית ללא גלוקוז |
| ללא גלוקוז-Hibernate-A בינוני (מותאם אישית) | BrainBits | בהתאמה אישית ללא גלוקוז | |
| פטרפטומיצין פניצילין (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | ספקים אחרים מקובלים |
| Stericup יחידות מסנן ואקום (0.22 μ m) | Millipore | ספקים אחרים מקובלים | |
| 25 מ"מ כיסויי זכוכית | Warner | #1 25 מ"מ עגול | |
| 18 מ"מ כיסויי זכוכית | Warner | #1 18 מ"מ עגול | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 מינוס אינסולין (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| סכין גילוח | VWR | 55411 | |
| תא ויברטום ותא קירור | חיתוך | Vibratome | |
| להבי ויברטום | Polysciences | 22370 | או להבי קצה כפול מספקים אחרים מקובל |
| Papain, מתלה | Worthington | LS003124 | |
| BSA, מתאים לתרבית תאים | Sigma | אחר ספק מקובל | |
| DNAse, לתרבית תאים | Invitrogen | צילינדרים שיבוט מקובלים של ספק | |
| , 6 מ"מ x 8 מ"מ | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| צבע פוטנציאלי ממברנה (כחול) | התקנים מולקולריים | R8042 | |
| מחמם בשורה | Warner | SF-28 | |
| משאבות מזרק | WPI | sp100i | ספק אחר מקובל |
| תא | סגור וורנר | צינורות פוליאתילן RC-43C | |
| וורנר | PE-90 | ||
| מטמורף | התקנים | תוכנת ניתוח תמונה חלופית מקובלת | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | BX61 WI | בשימוש עם 10X אובייקטיבי |
| פוטומטריה | מצלמה מגניב הצמד HQ | ||
| צר Cy3 סט מסננים | Chroma | 41007a | |
| מערכת תאורה | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
מקורות
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs gluc....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
