Method Article

ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגר גדול לטיפול מבוסס תאים הוא חוסר היכולת למקד מערכתי כמות גדולה של תאי קיימא עם יעילות גבוהה לרקמות של העניין הבא עירוי תוך ורידי או intraarterial. כתוצאה מכך, הגדלת ביות תא כרגע למד כאסטרטגיה כדי לשפר את הטיפול בתאים. תא מתגלגל על האנדותל של כלי הדם הוא צעד חשוב בתהליך של ביות של תאים ויכול להיות נחקר במבחנה באמצעות זרימת צלחת קאמרית מקבילה (PPFC). עם זאת, זה assay תפוקה משעמם מאוד, נמוך, עם תזרים תנאים מבוקרים היטב. במקום זאת, השתמשנו במערכת microfluidic צלחת רב גם המאפשרת חקר התכונות מתגלגלים סלולארי בתפוקה גבוהה יותר תחת מבוקרת בדיוק, זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית 1,2. במאמר זה, אנו מראים כיצד המאפיינים המתגלגלים של HL-60 (לוקמיה פרומיילוציטית האנושית) תאים על משטחי E-מצופה selectin P-וכמו גם על משטחים מצופים monolayer תא יכולים להיות readily שנבדק. כדי לדמות טוב יותר במצבים דלקתיים, משטח ערוץ microfluidic היה מצופה בתאי האנדותל (ECS), אשר לאחר מכן הופעלו עם הגורם-α גידול הנמק (TNF-α), להגדיל באופן משמעותי את אינטראקציות עם HL-60 תאים בתנאים דינמיים. התפוקה המשופרת ופלטפורמה משולבת רב פרמטר ניתוח תוכנה, המאפשרת ניתוח מהיר של פרמטרים כגון מתגלגל מהירויות ומתגלגלים בדרך, הן יתרונות חשובים להערכת מאפייני תא מתגלגל חוץ גופייה. המאפשר ניתוח מהיר ומדויק של גישות הנדסיות שנועדו להשפיע מתגלגל תא וביות, פלטפורמה זו עשויה לסייע בטיפול מבוסס תאים אקסוגניים מראש.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום הקליני המוצלח של טיפול מבוסס תאים הוא המסירה יעילה או מיקוד של תאים חדורים מערכתית לאתרים רצויים 3,4. כתוצאה מכך, יש חיפוש מתמיד אחר גישות כדי לשפר את הביות של תאים, ותאים במיוחד מתגלגל, כאסטרטגיה לשיפור טיפול בתא. תא מתגלגל על כלי דם הוא צעד מפתח במפל ביות תא, באופן קלאסי המוגדר לויקוציטים שמגויסים לאתרי מחלה 5. צעד זה נשלטת על ידי אינטראקציות ספציפיות בין selectins אנדותל, כלומר P-ו-E-selectin (P-ו-E-SEL), וligands המתפרץ שלהם על פני השטח של כדוריות דם לבנות 5,6. הבנה טובה יותר ויעילות משופרת של ביות תא, ובאופן ספציפי את הצעד מתגלגל, הם בעלי חשיבות רבה בחיפוש אחר פלטפורמות חדשות כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים. למועד זה הושג על ידי שימוש בתאים במקביל זרימת צלחת (PPFCs), הכוללת שני פלאט השטוחes עם אטם ביניהם, עם נמל יבוא ו יצוא ממוקם על הצלחת העליונה, שדרכו השעיה תא perfused באמצעות מזרק לשאוב 7,8, 9. פני השטח של הצלחת התחתונה יכולים להיות מצופה עם monolayer התא / מצעים רלוונטיים והאינטראקציה בין תאי perfused והשטח תחת זרימת גזירה היא לאחר מכן בחן 7. עם זאת, PPFC היא תפוקה נמוכה, מגיב בעליות, ושיטה מייגעת למדי, עם היווצרות בועה, נזילה ותזרים מבוקר היטב הצגת חסרונות עיקריים.

טכניקה חלופית לPPFC המסורתי היא מערכת microfluidic צלחת רבת היטב, המאפשר ביצועים גבוהים יותר תפוקה של מבחני סלולריים (גבוהים יותר עד פי 10 מ PPFCs) תחת זרימת גזירה מדויקת, מבוקר מחשב, עם הצריכה נמוכה מגיב 1,10. ניסויים מתגלגלים תא מבוצעים בתוך ערוצי microfluidic, שיכול להיות מצופה עם monolayers תא או מצעים מהונדסים וצלם USIng מיקרוסקופ, עם מאפיינים מתגלגלים בקלות נותח באמצעות תוכנה מתאימה. במחקר זה, אנו מדגימים את היכולות של מערכת צלחת רב גם זה microfluidic על ידי בוחן את המאפיינים המתגלגלים של לוקמיה פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים על משטחים שונים. HL-60 מתגלגל על ​​מצעים כמו P-ו-E-sel, כמו גם על משטחי תא לבטא קולטנים מתגלגלים שונים, נותחו. בנוסף, נוגדנים (Ab) חסימה שימשו להפגין מעורבות ישירה של selectins הספציפי בתיווך תנועת הגלגול של HL-60 על משטחים אלו. ניסויים מתגלגלים בוצעו עם תפוקה מוגברת, תחת זרימת גזירה יציבה, עם הצריכה מגיב / תא מינימאלי, המאפשרים ניתוח יעיל של פרמטרים מתגלגלים מפתח כגון מהירות מתגלגלת, מספר התאים מתגלגלים, ומאפייני דרך מתגלגלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

  1. לוקמיה פרומיילוציטית אדם תאים (HL-60)
    1. תרבות HL-60 תאים ב75 סנטימטר 2 צלוחיות עם 15 מיליליטר של המדיום (IMDM) של Iscove השתנה Dulbecco, בתוספת 20% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), 1% (v / v) L-גלוטמין ו 1 % (V / v) פניצילין, סטרפטומיצין.
    2. שינוי בתקשורת כל 3 ימים על ידי aspirating חצי של ההשעיה נפח התא והחלפתו בתקשורת IMDM מלאה.
    3. לdiacetate carboxyfluorescein, מכתים succinimidyl אסתר (CFSE), HL-60 השעיה צנטריפוגה תאים (400 XG, 5 דקות), resuspend בפתרון CFSE 1 מיקרומטר (שהוכן PBS prewarmed) ו דגירה במשך 15 דקות ב37 ° C. לאחר מכן תאי צנטריפוגה, לשאוב supernatant ותאי resuspend במדיום prewarmed טרי למשך 30 דקות. שטוף תאים בPBS ולאחר מכן להשתמש בניסויים מתגלגלים (ראה איור 1 ב לתמונה מייצגת של HL-60 תאים צבעוניים CFSE על מצופה sel P פני השטח).

ss = "jove_content"> הערה: מכתים CFSE הוא אופציונלי, והוא מוצג כאן כדי להמחיש את התופעה מתגלגלת בערוץ microfluidic. ניתוח של פרמטרים מתגלגלים מוצגים בכתב היד הזה בוצע על תאים בלא כתם באמצעות הדמיה brightfield סטנדרטית.

  1. תאי אנדותל כלי הדם ריאה (LMVECs)
    1. 100 מ"מ צלחות פטרי עם מעיל 0.1% פתרון ג'לטין (v v / PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות.
    2. LMVECs תרבות ב100 מ"מ צלחות פטרי ג'לטין מצופה במדיום גידול אנדותל השלם (בינוני 2 (EBM-2) אנדותל בסיסי), בתוספת ערכת תוסף צמיחה מסוימת, ראה ראגנטים). שינוי בתקשורת בכל יום אחר ותאים תת תרבות עם הגיע מפגש 80-90%.
    3. עבור תת תרבות, לשטוף תאים עם PBS ולאחר מכן לנתק את התאים עם 4 מיליליטר של 1x טריפסין-EDTA במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולנטרל בנפח שווה של EBM-2 מדיה מלאה. מעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר וcentrifugדואר (400 XG, 5 דקות). בעקבות צנטריפוגה, resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של תקשורת אנדותל השלמה ולספור תאים עם hemocytometer. האם התאים לא מעל המעבר, שכן זה משפיע על המורפולוגיה שלהם ותפקוד שימוש רק תאים תחת חלוף 7 לכל הניסויים.
  1. שחלות-P-selectin הסיני תאים (CHO-P)
    1. תאי CHO-P, שהם תאי CHO יציבות transfected להביע את P-sel האנושי, נמסרו על ידי משתפי פעולה (בית ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) 11,12.
    2. תרבות תאי CHO-P בס"מ T175 2 צלוחיות ב25 מיליליטר של ה-F-12 תקשורת.
    3. לpassaging, לשטוף תאים עם 10 מיליליטר של PBS ל4-5 שניות ולאחר מכן trypsinize ב10 מיליליטר של 1x טריפסין-EDTA במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ואחרי נטרול באמצעי תקשורת מלאה.
    4. צנטריפוגה ההשעיה תא (400 XG, 5 דקות), לשאוב בזהירות את supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של תקשורת מלאה ולספור את התאים עםhemocytometer.

2. מבצע של מערכת microfluidic הצלחת רב גם המשולבת

  1. ודא שכל הציוד מחובר כראוי ולהדליק מודולים השונים: מחשב, בקר, מיקרוסקופ ההפוך, ומצלמת CCD.
  2. פתח את תוכנת ההדמיה; לוודא מודול הצלחת רב גם ומודול ההדמיה מוצגים כראוי על המסך.
  3. חבר את הצינורות למלכודת האדים (מחוברת לבקר) וגם לחבר אותם לממשק הלחץ.
  4. מניחים את הצלחת רב גם בתנור / מתאם צלחת. להוסיף חומרים כימיים לבארות (שיפורט להלן) ולצרף את ממשק על גבי הצלחת. מניחים צלחת להדמיה בשלב אוטומטי.
  5. הממשק מתחבר לחלק העליון של הצלחת וחל בלחץ פנאומטי מן הבקר לחלק העליון של הבארות, הנהיגה הנוזל דרך ערוצי microfluidic בקצב הזרימה המוגדר, לשלוט בקלות באמצעות הצלחת רב גםמסך מודול תחת מצב ידני.
  6. ריאגנטים בערוץ הזרימה על פני שטח תצפית, הממוקם בין הבארות. ממדי ערוץ microfluidic הם 350 מיקרומטר x רחב 70 מיקרומטר גבוה. אורכו של הערוץ ליניארי הוא 1 מ"מ והתחתון של הערוצים כולל זכוכית coverslip 180 מיקרומטר, אשר תואם עם brightfield, שלב, הקרינה ומיקרוסקופיה confocal.
  7. לרכוש קטעי וידאו באמצעות מצלמת CCD (רכישת הנחל, 11 מסגרות / sec) ולנתח באמצעות תוכנה תואמת.

3. ציפוי של ערוצי microfluidic עם מצע חלבון או חד שכבתי נייד

  1. ציפוי ערוץ microfluidic עם פיברונקטין או P-/E-selectin
    1. הכן 1 מיליליטר של 20 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין פתרון ב-PBS. אלתר נפח המבוסס על מספר הערוצים להיות מצופים (להשתמש 25-50 μl של פיברונקטין לכל ערוץ).
    2. הוספת 25-50 μl של פתרון פיברונקטין לכל כניסה כן. להפעיל כוח גזירה של 2 dyn / 2 סנטימטרבמשך 5 דקות כדי תנקבנה את הערוץ. לתשומת לבך חרוז של נוזל המופיע גם בשקע. דגירה של 30-45 דקות ב RT
    3. לשאוב את הפתרון מבארות (לא לשאוב ישירות ממעגל ביניים המזין את הערוץ) 1,13. להוסיף 200-500 μl של PBS לשקע היטב ולשטוף ערוץ עם PBS על ידי יישום זרימת גזירה של 2 dyn / 2 סנטימטר על 5 דקות. הערוץ כעת מצופה כראוי עם פיברונקטין ומוכן לשימוש.
    4. למעייל עם P-או E-sel, להכין פתרון 5 מיקרוגרם / מיליליטר של חלבון רקומביננטי אדם הרצוי ב-PBS, ומעיל הערוצים כפי שתואר לעיל, עם דגירה השעה 1 ב37 ° C כדי לאפשר ציפוי פני השטח.
  2. יצירה של CHO-P או LMVEC monolayer בתוך הערוץ microfluidic
    1. בעדינות trypsinize תאים ממנות התרבות במשך 3 דקות, להרוות באמצעות נפח פי 2 מתקשורת ו צנטריפוגות מלאה (5 דקות ב400 XG). תאי resuspend עם 10 מיליליטר של תקשורת ו צנטריפוגות מלאה (5 דקות ב400 XG) again.
    2. ספירת התאים כדי לקבוע ריכוז תא בהשעיה. כדי להבטיח את היווצרות monolayer LMVEC מחוברות בתוך הערוץ, להביא את ריכוז תא ל15-20 מיליון תאים / מיליליטר. לmonolayer תא מחוברות CHO-P, השתמש 50-60 מיליון תאים / מיליליטר. מספר תא ראשוני לקבוע משמש לניסוי בהתאם - השתמש 25-50 μl של תא השעיה לכל ערוץ.
    3. הוספת 25-50 μl של השעיה תא בריכוז המתאים לכניסה טובה. מניחים את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ ולהציג את התאים לתוך הערוץ (2 dyn / 2 סנטימטר) ועד לתאים הם נצפו על המסך ממלא את כל הערוצים, ולאחר מכן לעצור את הזרימה.
    4. מלא את שני לשקע ויניקה עם 200 μl של או LMVEC מלא או מדיה CHO. בואו התאים להתיישב ולדבוק עבור 3 שעות בחממה (37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%).
    5. לאחר הדגירה 3 שעות, לשטוף את הערוץ עם תקשורת מלאה (2 dyn / 2 סנטימטר, 10-15 דקות) כדי להסיר פנויתאים. תאים אמורים להופיע מחוברות לחלוטין והערוץ עכשיו הוא מוכן לשימוש. בהתאם לצפיפות זריעת תאים ראשונית, ייתכן שיידרשו 2-3 שעות נוספות ליישוב זמן כדי להבטיח כיסוי של המשטח שלם עם התאים.

4. הפעלת Pro דלקתית LMVEC וחסימה של נוגדן P-/E-selectin

  1. הכן פתרון TNF-α (10 ng / ml) בתקשורת הבסיסית LMVEC.
  2. כדי לגרום להפעלה דלקתית של LMVEC בערוצים, להוסיף מפתרון TNF-α 100 μl למפרצון היטב ולהציג את הפתרון לערוץ על ידי יישום זרימת גזירה של 2 dyn / 2 סנטימטר על 5 דקות. עבור ערוצי שליטה (ECs nonactivated), להוסיף מתקשורת הבסיסית LMVEC 100 μl למפרצון היטב ולהכניס לערוץ (2 dyn / 2 סנטימטר על 5 דקות). הערוץ מוכן לassay מתגלגל עכשיו.
  3. כדי לחסום P-sel ו-E-sel על LMVECs ותאי CHO-P, להציג נטרול P-sel (AK4 שיבוט, 5 מיקרוגרם / מיליליטר בbaתקשורת סאל) או E-sel (P2H3 שיבוט, 5 מיקרוגרם / מיליליטר בתקשורת הבסיסית) נוגדנים לתוך הערוץ ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C. בשלב בא, לשטוף את הערוצים עם תקשורת הבסיסית (2 dyn / 2 סנטימטר על 5 דקות). ערוצים מוכנים לassay מתגלגל עכשיו.

5. HL-60 רולינג Assay בערוצי microfluidic מצופה חד שכבתי תשתית / הסלולרי

  1. לבחון בזהירות את הערוצים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר שערוצים הם מצופים כראוי (במקרה של ציפוי עם תאים, monolayer תא מחוברות באופן מלא יש לשים לב).
  2. כדי להכין HL-60 השעיה תא לניסויים מתגלגלים, HL-60 צנטריפוגה ההשעיה תא (5 דקות ב400 XG) ולשטוף פעם עם תקשורת הבסיסית. ספירת התאים ו resuspend ב IMDM (התקשורת הבסיסית, המכילים Ca 2 + ו Mg 2 +) כדי ליצור השעיה תא HL-60 עם 5 מיליון תאים / מיליליטר. השתמש 25-50 μl של השעיה תא לכל ערוץ כדי לבצע את assay מתגלגל.
  3. הוספת 25-50 μl של suspe התאnsion לשקע היטב, צלחת מקום בתוך בעל הטמפרטורה מבוקרת צלחת (37 מעלות צלזיוס) ומניחים על הבמה מיקרוסקופ. בשלב בא, להציג את התאים לתוך התעלה על ידי הפעלת כוח גזירה של 2 dyn / 2 סנטימטר (יש לשים לב תאים בתוך 10-15 שניות זורמים משקע למפרצון).
  4. כדי לבחון את התגובה מתגלגלת כפונקציה של מאמץ גזירה, להפחית את הגזירה ל0.25 dyn / 2 סנטימטר ולרכוש 20-30 קטעי וידאו שניות (באמצעות פונקציה "רכישת זרם") בכל גזירה רצויה (להגביר את הגזירה בהדרגה מ0.25 עד 5 dyn / 2 סנטימטר. אפשר גם להשתמש במספריים גבוהים יותר).
  5. לרכוש קטעי וידאו באמצעות מצלמת CCD (רכישת הנחל, 11 מסגרות / sec) ולנתח מהירויות גלגול שבילים ומתגלגלים באמצעות תוכנה תואמת.

6. Cytometry זרימה לזיהוי ביטוי של מולקולות פני שטח

  1. בעקבות trypsinization, להכין השעיה תא (באמצעות 1-2 x 10 5 תאים / לדוגמא) מסוג תאים רצוי (HL-60, CHO-(P או LMVECs) ב-PBS - / -), בתוספת 2% FBS. שטוף תאים פעמיים ולהביא את נפח דגימה 50 μl (תוך שימוש באותו המאגר).
  2. דגירה כל דגימה עם Ab הרצוי fluorophore מצומדות (ראה טבלה המצורפת לקבלת מידע מפורט) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (מכסה בנייר אלומיניום).
  3. לשטוף את התאים פעמיים (אותו חיץ) ולהביא את הנפח סופי של השעיה תא מוכתמת 200 μl. ניתוח דגימות באמצעות cytometer זרימה לזהות ביטוי של מולקולות פני השטח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HL-60 תאים גלגל על ​​משטחי P-ו-E-selectin, אבל לא על פיברונקטין

HL-60 תאים נחשבים "רולים" תקן זהב כפי שהם מבטאים מגוון של ligands מתביית, כולל ligands מתגלגל P-גליקופרוטאין sel יגנד-1 (PSGL-1) וSialyl לואיס X (SLeX) 5,14 (איור 1 א ). חלבון משטח PSGL-1 פועל כפיגום לSLeX טטרה saccharide, תיווך אינטראקציה ספציפית עם P-ו-E-sel, אשר מעלה מוסדרת על האנדותל במהלך דלקת 5,6,15. כדי לבדו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום מוצלח של טיפול מבוסס תאי אקסוגני הוא חוסר היכולת לספק תאים ביעילות לאתרים של פגיעה ודלקת הגבוה engraftment יעילות 3. מתגלגל תא מייצג שלב קריטי בתהליך של ביות של תאים, להקל על ההאטה של תאים בדפנות כלי דם, סופו של דבר מוביל להידבקות המשרד וגלגולם דרך האנדותל לרקמה 5. הבנה טובה יותר של התהליך מתגלגל לסוגי תאי מועמד עשויה להוביל לפיתוח של טכניקות כדי לשפר את הביות של תאים ולתרום באופן משמעותי לשיפור טיפול המבוסס על תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים מצהירים שום ניגוד העניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי CHO-P היו מתנת סוג של ד"ר ברברה Furie (ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק HL095722 לJMK עבודה זו נתמכה גם בחלק סרטן קרן אתגר פרס Movember-ערמונית לJMK ידי

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיותLonzaCC-2527
תאי שחלה של אוגר סיני המבטאים P-selectin (CHO-P)מתנה אדיבה מאת ד"ר ברברה פיורי11,12
HL-60 תאיםATCCCCL-240
<ריאגנטים חזקים>תרבית תאים
אנדותל בסיס בינונילונזהCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
תוספי תזונה בינוניים בסיסיים אנדותלייםLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - המדיום השונה של Iscove Dulbecco 1xGibco12440
F-12 (1x) תערובת תזונתית (חזיר)Gibco11765-054
פניצילין סטרפטומיצין (P/S)גיבקו15140
L-גלוטמין (L/G) 200 מ"מGibco25030
סרום בקר עוברי (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Petri DishBD FalconBD-353003
צלחת תרבית תאים 100 מ"מ, פוליסטירן
שטופל בתרבית רקמותצינורות צנטריפוגה (15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן)MedSupply PartnersTC1500
T75 צלוחיותBD פלקון353136
תמיסת ג'לטין (2%)SigmaG1393
dPBS (ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד)SigmaD8537
תמיסת טריפסין-EDTA (10x)SigmaT4174
<חזק>נוגדנים
אנטי-hE-Selectin/CD62ER& D SystemsBBA21
FITC עכבר מצומד IgG1R& D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR& D SystemsBBA34
FITC עכבר מצומד IgG1R& D SystemsBBA34
FITC עכבר IgG­ 1 κ בקרת איזוטיפBD Bioscience555748
Anti-SLeX / CD15s Ab, שיבוט: 5F18סנטה קרוזSC70545
FITC מצומדסנטה קרוזSC70545
עכבר רגיל IgM-FITC בקרת איזוטיפסנטה קרוזSC2859
PE עכבר אנטי אנושי CD162, שיבוט: KPL-1BD Pharmingen556055
עכבר PE IgG1 k בקרת איזוטיפBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 בקרת איזוטיפסנטה קרוזSC3877
<חזק>ריאגנטים אחרים
רקומביננטי אנושי TNF-alphaPeproTech300-01A
עקבות תאים CFSE ערכת התפשטות תאים - לזרימה ציטומטריהInvitrogenC34554
חלבון רקומביננטי P-selectin-FCאנושי R& D Systems137-PS-050
Human E-selectin-FC חלבון רקומביננטיR& D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage הייתה התוכנה ששימשה להפעלת הניסויים ולניתוח הנתונים
BioFlux 48-well platesFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometerBD BioscienceCFlow Plus הייתה התוכנה ששימשה להפעלת הניסויים ולניתוח הנתונים
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD מצלמהפוטומטרית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  3. Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
  4. Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
  5. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  6. Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
  7. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
  8. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9(2001).
  9. Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
  10. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644(2009).
  11. Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
  12. Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
  13. Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
  14. Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
  15. Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
  16. Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
  17. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
  18. Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
  19. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
  20. Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
  21. Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
  22. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009(2009).
  23. Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
  24. Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  25. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
  26. Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
  27. Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
  28. Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  29. Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
  30. Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
  31. Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
  32. Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
  33. Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
  34. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
  35. Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
  36. Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles