Method Article

ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגר גדול לטיפול מבוסס תאים הוא חוסר היכולת למקד מערכתי כמות גדולה של תאי קיימא עם יעילות גבוהה לרקמות של העניין הבא עירוי תוך ורידי או intraarterial. כתוצאה מכך, הגדלת ביות תא כרגע למד כאסטרטגיה כדי לשפר את הטיפול בתאים. תא מתגלגל על האנדותל של כלי הדם הוא צעד חשוב בתהליך של ביות של תאים ויכול להיות נחקר במבחנה באמצעות זרימת צלחת קאמרית מקבילה (PPFC). עם זאת, זה assay תפוקה משעמם מאוד, נמוך, עם תזרים תנאים מבוקרים היטב. במקום זאת, השתמשנו במערכת microfluidic צלחת רב גם המאפשרת חקר התכונות מתגלגלים סלולארי בתפוקה גבוהה יותר תחת מבוקרת בדיוק, זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית 1,2. במאמר זה, אנו מראים כיצד המאפיינים המתגלגלים של HL-60 (לוקמיה פרומיילוציטית האנושית) תאים על משטחי E-מצופה selectin P-וכמו גם על משטחים מצופים monolayer תא יכולים להיות readily שנבדק. כדי לדמות טוב יותר במצבים דלקתיים, משטח ערוץ microfluidic היה מצופה בתאי האנדותל (ECS), אשר לאחר מכן הופעלו עם הגורם-α גידול הנמק (TNF-α), להגדיל באופן משמעותי את אינטראקציות עם HL-60 תאים בתנאים דינמיים. התפוקה המשופרת ופלטפורמה משולבת רב פרמטר ניתוח תוכנה, המאפשרת ניתוח מהיר של פרמטרים כגון מתגלגל מהירויות ומתגלגלים בדרך, הן יתרונות חשובים להערכת מאפייני תא מתגלגל חוץ גופייה. המאפשר ניתוח מהיר ומדויק של גישות הנדסיות שנועדו להשפיע מתגלגל תא וביות, פלטפורמה זו עשויה לסייע בטיפול מבוסס תאים אקסוגניים מראש.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום הקליני המוצלח של טיפול מבוסס תאים הוא המסירה יעילה או מיקוד של תאים חדורים מערכתית לאתרים רצויים 3,4. כתוצאה מכך, יש חיפוש מתמיד אחר גישות כדי לשפר את הביות של תאים, ותאים במיוחד מתגלגל, כאסטרטגיה לשיפור טיפול בתא. תא מתגלגל על כלי דם הוא צעד מפתח במפל ביות תא, באופן קלאסי המוגדר לויקוציטים שמגויסים לאתרי מחלה 5. צעד זה נשלטת על ידי אינטראקציות ספציפיות בין selectins אנדותל, כלומר P-ו-E-selectin (P-ו-E-SEL), וligands המתפרץ שלהם על פני השטח של כדוריות דם לבנות 5,6. הבנה טובה יותר ויעילות משופרת של ביות תא, ובאופן ספציפי את הצעד מתגלגל, הם בעלי חשיבות רבה בחיפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

  1. לוקמיה פרומיילוציטית אדם תאים (HL-60)
    1. תרבות HL-60 תאים ב75 סנטימטר 2 צלוחיות עם 15 מיליליטר של המדיום (IMDM) של Iscove השתנה Dulbecco, בתוספת 20% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), 1% (v / v) L-גלוטמין ו 1 % (V / v) פניצילין, סטרפטומיצין.
    2. שינוי בתקשורת כל 3 ימים על ידי aspirating חצי של ההשעיה נפח התא והחלפתו בתקשורת IMDM מלאה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HL-60 תאים גלגל על ​​משטחי P-ו-E-selectin, אבל לא על פיברונקטין

HL-60 תאים נחשבים "רולים" תקן זהב כפי שהם מבטאים מגוון של ligands מתביית, כולל ligands מתגלגל P-גליקופרוטאין sel יגנד-1 (PSGL-1) וSialyl לואיס X (SLeX) 5,14 (איור 1 א ). חלבון משטח PSGL-1 פועל כפיגום לSLeX טטרה saccharide, תיווך אינטראקציה ספציפית עם P-ו-E-sel, אשר מעלה מוסדרת על האנדותל במהלך דלקת 5,6,15. כדי לבדו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום מוצלח של טיפול מבוסס תאי אקסוגני הוא חוסר היכולת לספק תאים ביעילות לאתרים של פגיעה ודלקת הגבוה engraftment יעילות 3. מתגלגל תא מייצג שלב קריטי בתהליך של ביות של תאים, להקל על ההאטה של תאים בדפנות כלי דם, סופו של דבר מוביל להידבקות המשרד וגלגולם דרך האנדותל לרקמה 5. הבנה טובה יותר של התהליך מתגלגל לסוגי תאי מועמד עשויה להוביל לפיתוח של טכניקות כדי לשפר את הביות של תאים ולתרום באופן משמעותי לשיפור טיפול המבוסס על תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים מצהירים שום ניגוד העניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי CHO-P היו מתנת סוג של ד"ר ברברה Furie (ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק HL095722 לJMK עבודה זו נתמכה גם בחלק סרטן קרן אתגר פרס Movember-ערמונית לJMK ידי

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיותLonzaCC-2527
תאי שחלה של אוגר סיני המבטאים P-selectin (CHO-P)מתנה אדיבה מאת ד"ר ברברה פיורי11,12
HL-60 תאיםATCCCCL-240
<ריאגנטים חזקים>תרבית תאים
אנדותל בסיס בינונילונזהCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
תוספי תזונה בינוניים בסיסיים אנדותלייםLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - המדיום השונה של Iscove Dulbecco 1xGibco12440
F-12 (1x) תערובת תזונתית (חזיר)Gibco11765-054
פניצילין סטרפטומיצין (P/S)גיבקו15140
L-גלוטמין (L/G) 200 מ"מGibco25030
סרום בקר עוברי (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Petri DishBD FalconBD-353003
צלחת תרבית תאים 100 מ"מ, פוליסטירן
שטופל בתרבית רקמותצינורות צנטריפוגה (15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן)MedSupply PartnersTC1500
T75 צלוחיותBD פלקון353136
תמיסת ג'לטין (2%)SigmaG1393
dPBS (ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד)SigmaD8537
תמיסת טריפסין-EDTA (10x)SigmaT4174
<חזק>נוגדנים
אנטי-hE-Selectin/CD62ER& D SystemsBBA21
FITC עכבר מצומד IgG1R& D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR& D SystemsBBA34
FITC עכבר מצומד IgG1R& D SystemsBBA34
FITC עכבר IgG­ 1 κ בקרת איזוטיפBD Bioscience555748
Anti-SLeX / CD15s Ab, שיבוט: 5F18סנטה קרוזSC70545
FITC מצומדסנטה קרוזSC70545
עכבר רגיל IgM-FITC בקרת איזוטיפסנטה קרוזSC2859
PE עכבר אנטי אנושי CD162, שיבוט: KPL-1BD Pharmingen556055
עכבר PE IgG1 k בקרת איזוטיפBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 בקרת איזוטיפסנטה קרוזSC3877
<חזק>ריאגנטים אחרים
רקומביננטי אנושי TNF-alphaPeproTech300-01A
עקבות תאים CFSE ערכת התפשטות תאים - לזרימה ציטומטריהInvitrogenC34554
חלבון רקומביננטי P-selectin-FCאנושי R& D Systems137-PS-050
Human E-selectin-FC חלבון רקומביננטיR& D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage הייתה התוכנה ששימשה להפעלת הניסויים ולניתוח הנתונים
BioFlux 48-well platesFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometerBD BioscienceCFlow Plus הייתה התוכנה ששימשה להפעלת הניסויים ולניתוח הנתונים
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD מצלמהפוטומטרית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles