סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

סיכום

כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.

תקציר

בשנים האחרונות, שני פוטונים הדמיה הפכה לכלי רב ערך במדעי המוח, שכן היא מאפשרת למדידה כרונית של הפעילות של תאים מזוהים גנטי במהלך ההתנהגות ^1-6. כאן אנו מתארים שיטות לבצע הדמיה שני פוטונים בקליפת מוח עכבר בעוד החיה מנווטת סביבת מציאות מדומה. אנו מתמקדים בהיבטים של הליכי הניסוי, כי הם מפתח להדמיה של בעלי חיים מתנהגים בסביבה וירטואלית מוארת. הבעיות המרכזיות המתעוררות בהתקנה ניסיונית זה שאנחנו כאן כתובת הם: מזעור ממצא תנועה קשורות במוח, צמצום דליפת אור ממערכת ההקרנה של מציאות מדומה, ומזעור נזק לרקמות לייזר מושרה. כמו כן אנו מספקים תוכנת מדגם כדי לשלוט בסביבת המציאות מדומה ולעשות מעקב תלמיד. עם הנהלים והמשאבים האלה זה צריך להיות אפשרי כדי להמיר מיקרוסקופ שני פוטונים קונבנציונליים לשימוש בהתנהגות עכברים.

מבוא

שני פוטונים הדמיה של מדדי סידן (מקודד גנטי כמו ⁷ GCaMP5 או R-Geco ^8, או צבעים סינטטיים כמו OGB או Fluo4) התפתחה כשיטת רבת עוצמה של מדידת פעילות עצבית בהתנהגות עכברי ^1-6. זה מאפשר מדידה בו זמנית של פעילותם של מאות תאים ברזולוציה פוטנציאל פעולה כמעט יחידה, עד כ 800 מיקרומטר מתחת לפני השטח המוח ^9,10. יתר על כן, שימוש באינדיקטורים סידן מקודד גנטי (GECIs) פעילות עצבית ניתן למדוד באופן כרוני ^5,11,12, ובסוגים מוגדרים מבחינה גנטית תא ^13. יחד, שיטות אלה מספקים מידה מסוימת של רזולוציה של זמן ומרחב שנפתח שפע של אפשרויות חדשות בחקר החישוב העצבי in vivo.

התערבות כירורגית היא הכרחית כדי לחשוף ולתייג את מוח העכבר להדמיה. תאים בדרך כלל הם transfected באמצעות vir adeno הקשורים רקומביננטי לנו מערכת (AAV) למסירת Geci וחלון גולגולתי הוא מושתל על הזריקה כדי לקבל גישה אופטית למוח. בר ראש מחובר אז לגולגולת לקיבוע ראש מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים. התכנון והיישום של צעדים אלה הוא קריטיים כמו רוב הבעיות עם הדמיה ערה נובעים מחוסר היציבות בהכנה. באופן אידיאלי ההליך המתואר כאן צריך לאפשר הדמיה כרונית של עד מספר חודשים לאחר הניתוח.

כדי לאפשר התנהגות מודרכת חזותי במהלך ההדמיה שני פוטונים, העכבר הקבוע בראש יושב על הליכון כדורי אוויר נתמך, שבו ניתן להשתמש כדי לנווט בסביבת מציאות מדומה. תנועה של העכבר על ההליכון היא מצמידים את התנועה בסביבה הווירטואלית המוצגת על מסך טבעתי המקיף את ^14,15 העכבר. ניתן להקליט משתנים התנהגותיים כגון תנועה, גירוי ויזואלי, ועמדת תלמיד ^6.

t "> אנו מתארים את ההליכים כרוכים בהדמיה שני פוטונים כרוניות בעכברים לחקור את סביבת מציאות מדומה נקודות מפתח התייחסו הן:. הפחתה של חפצי תנועה, הפחתה של דליפת אור, מקסום מספר התאים נרשמו בו זמנית, ומזעור נזק תמונה. כמו כן אנו מספקים פרטים על הגדרת הליכון נתמך האוויר, מעקב אחר תלמיד, ואת סביבת המציאות מדומה. הנהלים שתוארו כאן יכולים לשמש להדמית אוכלוסיות תאים שכותרתו fluorescently בעכברים קבועים בראש במגוון רחב פוטנציאל של פרדיגמות התנהגותי .

פרוטוקול

נהלי כל החיה אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות של מחלקת הווטרינרית של קנטון באזל.

1. התקנת חומרה ותוכנה

1. התקנת הסריקה מיקרוסקופ שני פוטונים:
   1. השתמש בליזר אינפרא אדום פעם כמקור תאורה (רוחב פולס <120 fsec).
   2. השתמש בראש סריקה המורכב מסורק תהודה 8 או 12 קילוהרץ וגלונומטר הערה סטנדרטית:. זה מאפשר מסגרת חליפין של 40 או 60 הרץ ב750 x 400 פיקסלים. קצב פריימים גבוה הוא קריטי לצמצום תנועה במוח עיוות תמונה מושרה. יתר על כן, תוצאות מהירות תהודה סריקה בתשואת אות גבוהה יותר ומפחית photobleaching ¹⁶ וphototoxicity.
   3. השתמש Z-צעד במהירות גבוהה Piezo חשמלי לתמונות ברצף משולבי זמן לרכוש בעומקים מרובים הערה:. זה הוא אופציונלי ומשמש כדי להגדיל את תשואת נתונים על חשבון קצב פריימים.
   4. השתמש בבוקרblanker echanical להקטין את חשיפת לייזר לרקמה. להתאים את רוחב blanker בהתאם למשרעת של סורק התהודה הערה:. בשל אופי סינוסי של נתיב הסריקה בסורק תהודה, קרן הלייזר נעה comparably איטי בנקודות תפנית הסריקה. כדי למנוע נזק לרקמות בנקודות תפנית אלה בם חשיפת לייזר היא הגדולה ביותר, blanker מכאני מוחדר למישור המוקד בין הסריקה ועדשות צינור שעוצרת את קרן הלייזר.
   5. עבור רכישת נתונים להשתמש digitizer מהירות גבוהה (800 MHz) בשילוב עם מערך שדה-programmable gate (FPGA) הערה:. מסננים גבוהים לעבור FPGA ומכלי אות PMT לפיקסלים. השילוב של גבוה לעבור סינון על FPGA ונמוך לעבור סינון היעיל על תוצאת מגבר PMT במסנן להקה עוברת במרכז בערך סביב שיעור החזרה של הלייזר (80 MHz). קוד ה-FPGA מדגם מסופק כתוספת.
2. התקנת הליכון נתמכת באוויר המבוססת על העיצוב של Dombeck ועמיתים ²
   1. חבר את מחזיק הכדור לקו אספקת אוויר באמצעות צינור אספקת אוויר של לפחות 10 מ"מ קוטר פנימי. מקסם את החתך של מפרצון אספקת אוויר בעל כדור ומניח את הסכום מספיק של צינורות בין האספקה ​​הראשית האוויר ומחזיק כדור הערה:. חתך מוגבר ואורך מוגבר של צינורות אספקת האוויר מפחית את דור רעש.
   2. הנח קצף פוליסטירן כדור (20 ס"מ קוטר) במחזיק כדור ומודפס-3D-אישית מעוצבת.
   3. אם הפרדיגמה התנהגותיות דורשת רק קדימה (ואחורה) תנועה, להגביל את תנועתו של הכדור על הציר האופקי (המגרש) על ידי החדרת סיכה (למשל מחט מזרק G 19) בצד של כדור הערה:. בדרך כלל בעלי חיים להסתגל ההתקנה הרבה יותר מהר בפרדיגמה סיבוב מופחת זה.
   4. תנועת מסלול של הכדור באמצעות עכברי מחשב אופטיים אחד או שנייםכדי לזהות תנועה סביב שתיים או כל שלושת צירים, בהתאמה הערה:. עכברי המחשב אידיאלי צריכים לפעול עם דיודה אינפרא אדום להפרעה לפחות עם ההדמיה.
3. התקנת סביבת מציאות מדומה
   1. הכן את סביבת המציאות מדומה הערה:. סביבת מדגם מבוססת על Panda3D, מנוע משחק זמין באופן חופשי, ניתן כתוספת. האובייקטים של הסביבה הווירטואלית נוצרים באמצעות Wings3D, בונה מודלים 3D קוד פתוח. התכנית לדוגמא קוראת מידע עמדה על כרטיס רכישת נתונים ומתרגמת את זה לתנועה בסביבה הווירטואלית. הקוד גם מבצע את השינוי קוי הכרחי לסביבה שמוקרנת על מסך טבעתי. הבנייה מפורטת של המסך הטבעתי שתוארה במקומות אחרים ^14,17.
   2. השתמש מקרני LED או מסכי מחשב עם תאורה אחורית LED להצגת הסביבה הווירטואלית. לשלב cir gatingCUIT להבהוב מהיר של הנוריות במהלך הדמיה הערה:. בעיה טמונה בהדמיה שני פוטונים במהלך הגירוי חזותי היא דליפת אור שיוצאת ממערכת הגירוי ויזואלי, אשר יכול להיות מופחתת על ידי מיגון האובייקטיבי. עם זאת, דליפת אור ממערכת הגירוי החזותית יכולה לבטל באופן מלא על ידי סנכרון תפוקת האור של המקרן לנקודות התפנית של סורק התהודה (כאשר הנתונים אינם נרכשים), כפי שנעשה עם זירות LED המשמשות לגירוי ויזואלי במהלך הדמיה ב דרוזופילה ^18. כתוצאה מכך לסירוגין יעיל במהירות גבוהה של גירוי חזותי ורכישת נתונים (ראה איור 2). תדר ההבהוב (24 קילוהרץ) הוא סדר גודל מעל סף היתוך הבהוב, שמעליו מרצד נתפס כבר לא על ידי בעלי החיים. תרשים המעגל האלקטרוני של שינוי זה למקרן LED מסחרי מוצג באיור 3.
4. כלבוןמעקב il
   1. להשתמש במצלמה מבוססת CMOS וידאו (30 fps) למעקב אחר מצב תלמיד. ודא שהמצלמה אינה מכילה מסנן חוסם אינפרא אדום הערה:. התלמיד נראה בחדות גבוהה במהלך הקלטות בשל אור תועה מליזר עירור שני הפוטונים יציאה דרך העין. עמדת תלמיד וקוטר מופק בזמן אמת באמצעות תוכנה מתוכנתת מותאמת אישית המבוסס על העיצוב של Sakatani ועיסא ^19.

2. הזרקה של סידן גנטי מחוון והחלון שתל

ההזרקה של אינדיקטור סידן ²⁰ וההשתלה של החלון גולגולתי ²¹ מבוצעת כפי שתואר לעיל עם התוספות הבאות:

1. להזריק את הווירוס לתוך האזור של עניין באמצעות פיפטה הזרקת זכוכית backfilled עם פתרון וירוס ומחוברת למערכת הזרקה בלחץ. התאם את הלחץ בהתאם לפיפטה הפנימיתקוטר, בדרך כלל כ. 70-140 mbar, להזריק כ 100 NL של פתרון וירוס במהלך 1-2 דקות. יש להשתמש בפולסים הזרקה בנפח נמוך מועברים בתדירות נמוכה (0.05 פולסים שניות ב 2 הרץ) על מנת למנוע הצפה של הנגיף לאורך פיפטה במהלך הזרקת הערה:. על מנת לפקח בנפח ההזרקה, פיפטה יכולה להיות מסומנת בקטנה , אורכים מחולק באופן שווה (למשל 0.5 מ"מ) תחת מיקרוסקופ סטריאו. תזוזה של המניסקוס בין הסימונים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את הנפח המוזרק.
2. הודעה שבועות הזרקה כמה זה צריכה לגרום לבולוס של תאים שכותרתו צפופה בקוטר של כ 500 מיקרומטר. יעילות של ביטוי Geci באזור של עניין תלויה בבחירה של Geci ושילוב אמרגן, כמו גם את כייל וסרוטיפ של AAV רקומביננטי המשמש זיהומיות הערה:. כדוגמא מייצגת, הזרקה של AAV2/1-EF1α-GCaMP5 עם ציצי ויראליאה של 8 x 10 ¹² GC / מיליליטר לקליפת ראייה העיקרית של תוצאות עכבר בביטוי משביע רצון בכשני שבועות לאחר הזרקה (איור 1).
3. בר הראש לא צריך לחסום את שדה הראייה של העכבר, אבל צריך להיות נוקשה מספיק כדי לאפשר הדמיה יציבה במהלך התנהגות. זה בדרך כלל דורש שתי נקודות של התקשרות בכל צד של הבר בראש (ראה איור 1). כדי לצרף את הבר ועד ראש הגולגולת בחוזקה, ודא למקסם ולייבש את השטח של גולגולת חשופה שבו בר הראש יצורף. בנוסף, באמצעות אזמל או מזרק, לשרוט את הגולגולת כדי ליצור חריצים שטחיים ובכך להגדיל את שטח הפנים להדבקה. מכסה את העצם עם דבק רקמות cyanoacrylate לפני הצמדת הסרגל בראש במלט שיניים.

3. הליך ניסיוני

1. שבועות עד שלושה שבועות לאחר הזרקת וירוס, בדקו את חלון שתל הגולגולת לבהירות וביטוי תחת עליתתאורת פלואורסצנטי. גבולות ברורים לעין וברורה והחדים של כלי דם שטחיים הם אינדיקציה טובה שחלון השתל מתאים להדמיה (ראה איור 1).
2. למדוד ולהתאים את כוח הלייזר לשווי נמוך 50 mW במדגם.
3. הפעל את זרימת האוויר להליכון הכדורי.
4. לקיבוע ראש מתחת למיקרוסקופ, להרדים בקצרה את החיה עם isoflurane כדי להפחית את הלחץ. מניחים את החיה לתוך מיכל הרדמה isoflurane ולחכות עד עוצר בעלי החיים מרגשים (כ 10 שניות). הסר את החיה ומייד את הראש לתקן את זה מתחת למיקרוסקופ.
5. מקם את המערכת בתצוגה ויזואלית הקרובה ככל האפשר לבעלי החיים עדיין, כדי לאפשר גישה לבעלי החיים. הקשר פחות חזותי בבעלי החיים יש עם הנסיין, פחות לחוץ בבעלי החיים יהיו בשלב הראשוני של הניסוי.
6. ודא שחלון שתל הגולגולת הוא ללא אבק והלכלוך. נקי עם מיםבמידת צורך.
7. החל ג'ל אולטרסאונד ברור כמדיום טבילה בין החלון גולגולתי ואובייקטיבי מים טבילה. זה פותר בעיות של השפלה תמונה איטית בשל התאדות מים או דליפה ומקל על הצורך לעלות קונוס על הבר ועד הראש מחזיק מים הערה:. צנטריפוגה ג'ל לפני שימוש כדי להסיר את כל בועות האוויר, ולדאוג שלא ליצור כל אוויר בועות במהלך היישום של ג'ל. בועות אוויר קשה יכולות לפגוע באיכות תמונה.
8. לעטוף חתיכת הסרט שחור סביב הבר האובייקטיבי וראש למיגון אור.
9. הזז את זירת הסביבה הווירטואלית לעמדתה הסופית ולהתאים את מצלמת וידאו למעקב תלמיד.
10. הגדר את blanker הלייזר כדי להתאים את המשרעת הסריקה משמשת במהלך הניסוי.
11. להתחיל להקליט נתונים.

תוצאות

איכות התמונה בהדמיה סידן שני פוטונים של אוכלוסיות תאים שכותרתו עם Geci תלוי במידה רבה באיכות של חלון השתל גולגולתי. שבועיים לאחר הזרקת וירוס החלון גולגולתי יש לבדוק לבהירות. לא צריך להיות שום רקמות פרור או (איור 1 א) הגלוי לצמיחה מחודשת עצם. יתר על כן, הדפוס של כלי דם שטחיים צריך להישאר ללא שינוי והגבולות של כלי הדם צריכים להיות מוגדרים בצורה חדה. במקביל, יכול להיות גם בדק ביטוי Geci. Boli של תאים שכותרת צריך להיות לעין תחת מיקרוסקופ epifluorescence (איור ...

דיון

המפתח להצלחה של הדמיה שני פוטונים התנהגותיות הוא היציבות של התכשיר בשתי דרכים:

1. במהלך ימים שלאחר השתלת חלון, תגובות דלקתיות של הרקמה יכולות להוביל לשיפור של היווצרות של רקמת פרור וסחוס שיפריע או אפילו למנוע הדמיה.
2. במהלך ניסוי המוח צריך להיות יציב מספיק כדי למנוע ממצא תנועה ממשחית את אות הקרינה פעילות הקשורה עצבית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פתקי כיסוי (קוטר = 3-5 מ"מ)	שתל חלון	מנזל
InSight DeepSee	מיקרוסקופ	לייזר ספקטרה-פיזיקה
12 קילו-הרץ סורק תהודה	קיימברידג' טכנולוגיה	G1-003-30026	מיקרוסקופ
Galvometer	קיימברידג' טכנולוגיה	G6215H	מיקרוסקופ
דיגיטייזר	National Instruments	NI 5772	מיקרוסקופ
FPGA	National Instruments	PXIe 7965R	מיקרוסקופ
	National Instruments	PCIe 6363	מיקרוסקופ
מסנן פליטה 525/50	Semrock	FF03-525/50-25	מיקרוסקופ
Piezo-electric z-drive	Physikinstrumente	P-726.1CD	מיקרוסקופ
לפיזו-אלקטרי כונן	Physikinstrumente	E665 LVPZT	מיקרוסקופ
אובייקטיבי 16X, 0.8NA	מיקרוסקופ	ניקון	CFI75
מגבר זרם מיקרוסקופ	Femto	DHPCA-100	מיקרוסקופ
פוטו	מיקרוסקופ	Hamamatsu
מצלמת USB ללא מסנן IR	הדמיה מקור	DMK22BUC03	מעקב אחר
אישוניםמטרה 50 mm	הדמיה מקור	M5018-MP	מעקב אישונים
טבעות מתאם מאקרו	הדמיה מקור	LAexSet	מעקב אחר אישונים
עכבר מחשב אופטי	Logitech	G500	מעקב תנועה
כדור קלקר 20 ס"מ	למשל idee-shop.de	08797.00.15	סביבה וירטואלית
מקרן LED	סמסונג	SP-F10M	וירטואלי סביבה
כרטיס רכישה	National Instruments	NI 6009	סביבה וירטואלית
Panda3D game engine		www.panda3d.org	סביבה וירטואלית
ספריית Numpy עבור Python		www.scipy.org	סביבה וירטואלית
Scipy ספרייה עבור Python		www.scipy.org	סביבה וירטואלית
NI-DAQmx דרייבר	מכשירים לאומיים	www.ni.com	סביבה וירטואלית
ג'ל אולטרסאונד	הדמיה	Dahlhausen	5701.0342.10