מאמר שיטה

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50915

⸱

27 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה לאפיון הטופוגרפיה התפקודית והתכונות הסינפטיות של מעגלי המוח הקדמי באמצעות גישה אופטוגנטית לגירוי אוכלוסיות עצביות במבחנה.

תקציר

המוח הקדמי החושי מורכב מסוגי תאים מחוברים זה לזה, שתכונותיהם התפקודיות טרם הובהרו במלואן. הבנת האינטראקציות של מעגלי המוח הקדמי הללו נעזרה לאחרונה על ידי פיתוח שיטות אופטוגנטיות לאפנון פעילות עצבית בתיווך אור. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבחינת הארגון התפקודי של מעגלי המוח הקדמי במבחנה באמצעות גירוי פוטוסטימולציה בסריקת לייזר של channelrhodopsin, המתבטא באופן אופטוגנטי באמצעות טרנספקציה בתיווך ויראלי. גישה זו מנצלת גם את התועלת של רקומבינציה של cre-lox בעכברים טרנסגניים כדי למקד ביטוי בסוגי תאים עצביים ספציפיים. לאחר טרנספקציה, נוירונים נרשמים פיזיולוגית בתכשירי פרוסות באמצעות מהדק טלאי של תא שלם כדי למדוד את תגובותיהם המעוררות לסריקת לייזר של סיבים המבטאים תעלותרודופסין. גישה זו מאפשרת הערכה של טופוגרפיה תפקודית ותכונות סינפטיות. ניתן להשיג מתאמים מורפולוגיים על ידי הדמיית הביטוי הנוירו-אנטומי של סיבים המבטאים תעלה רודופסין באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הפרוסה החיה או הרקמה הפוסט-קבועה. שיטות אלה מאפשרות חקירות פונקציונליות של מעגלי המוח הקדמי המרחיבות גישות קונבנציונליות יותר.

מבוא

המעגלים המשוכללים של המוח הקדמי של היונקים מציבים אתגר ניסיוני לניתוח התפקידים התפקודיים של מרכיביו השזורים זה בזה. התרת קשרים אלה נעזרה לאחרונה על ידי פיתוח שיטות אופטוגנטיות לריגוש ועיכוב ספציפי של אוכלוסיות עצביות ותחזיותיהן1-3. גישות אלו עושות שימוש בביטוי מבוקר גנטית של תעלות ממברנה המגיבות לאור4-6. ראוי לציין במיוחד, channelrhodopsin, תעלת יונים מגודרת באור, מפרקת ממברנות עצביות בעקבות גירוי אופטי, מה שמוביל לעירור של הנוירון המבטא והקרנות שלו4,7. לעומת זאת, הלורודופין, משאבת כלוריד מגודרת באור, היפרפולריזציה של הממברנה, ובכך מעכבת את ההקרנה הממוקדת6,8,9. מספר גרסאות של אופסינים אלה הונדסו, וקטורים מרובים הופקו לטרנספקציה וביטוי באוכלוסיות עצביות מעניינות, וקווי עכברים טרנסגניים מהונדסים המבטאים באופן מכונן את האופסינים הללו או המאפשרים שליטה בתיווך cre-lox על ביטוים1,2,10,11.

התועלת של שיטות וחומרים אופטוגנטיים אלה חוללה מהפכה במדעי המוח הניסויים המודרניים, ואפשרה לנתח את תפקידם של מעגלים עצביים ספציפיים בפיזיולוגיה ובהתנהגות של האורגניזם12-15. בפרט, ניתן ליישם שיטות אלה בעוצמה על דיסקציה תפקודית של מעגלי מוח באמצעות תכשירי פרוסות מבחנה 16-20. בהקשר זה, אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא היכולת לאפיין את הפיזיולוגיה של הקרנות ארוכות טווח שקשה עד בלתי אפשרי לשמר בפרוסה עבה, כמו הקשרים הקומיסוריים בין חצאי קליפת המוח16. יתר על כן, טכנולוגיה זו מאפשרת מניפולציות שאינן אפשריות בשיטות אחרות, כגון עיכוב סלקטיבי של הקרנות בדיוק זמן עדין באמצעות הלורודופסין6,8,9. יתר על כן, הביטוי הספציפי לסוג התא של אופסינים אלה מאפשר גירוי או עיכוב סלקטיבי של רכיבים מבודדים במעגל עצבי1,2,11,15,21. ככאלה, הכלים האופטוגנטיים החדשניים הללו מאפשרים ניתוח חסר תקדים של התרומות העצביות לפיזיולוגיה ולהתנהגות.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לביטוי channelrhodopsin במוח העכבר באמצעות וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו-(AAV)1,2. ניתן לבצע טרנספקציה ספציפית של אוכלוסיות עצביות ממוקדות באמצעות פרוטוקול זה, עם בחירה מתאימה של מבני מקדם או עכברים טרנסגניים המבטאים Cre-recombinase בתאי העצב הממוקדים המעניינים ומבנה ויראלי 'פלוקס'1,11,15,21 (איור 1). כדוגמאות כאן, אנו בוחנים את ההקרנות הקורטיקוקורטיות בין קליפת המוח הראייתית הראשונית (V1) לקליפת המוח הראייתית המשנית (V2) ואנו חוקרים גם את ההקרנה הקורטיקו-תלמיתית של שכבה 6 מקליפת המוח הסומטורית הראשונית (S1) לגרעין המדיאלי הוונטרו-אחורי (VPm). אנו משלבים ביטוי ספציפי זה עם גירוי פוטו במבחנה בסריקת לייזר כדי להעריך את הפיזיולוגיה הסינפטית והטופוגרפיה התפקודית. ההגדרה המוצגת כאן מאפשרת מיקום מרחבי מדויק ושליטה במיקומי הפוטוסטימול. לבסוף, אנו מתארים את ההדמיה של דפוסי הבעה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פרוטוקול

1. ניתוח וזריקות

  1. יש להרדים עכברים באמצעות זריקה תוך-צפקית (מומלץ להשתמש במחט 22-25 גרם) של קטמין (100-120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (7.5-16 מ"ג/ק"ג).
    1. העריכו את ההרגעה באמצעות צביטות חזקות בבוהן עד שלא יתעוררו תגובות. עבור כל ההליכים המתוארים בבעלי חיים, יש לשנות בהתאם להנחיות המקומיות של IACUC לפי הצורך.
  2. הנח עכברים מרדימים במכשיר סטריאוטקסי על ידי אבטחת הראש והאוזניים במחזיקים שלהם.
    1. יש לשמן את העיניים לפני הכנסת החיה למכשיר הסטריאוטקסי עם משחת עיניים סטרילית.
  3. לגלח את הקרקפת בעזרת סכין גילוח ולעקר את האזור בעזרת ספוגיות בטדין.
  4. בעזרת אזמל חותכים חתך בקו האמצע ומשקפים את העור והשרירים שמתחתיו מעל האזור המיועד להזרקה.
  5. סובב להב אזמל כטרפין כדי לבצע קרניוטומיה מעל האזור המיועד להיחשף. לחלופין, השתמש במקדח קטן המחובר לדרמל כדי לבצע את הגולגולת.
    1. כדי לבצע את הגולגולת, הנח להב אזמל או מקדח על פני הגולגולת וסובב לאט עד שנחפרה מספיק עצם כדי לחשוף את ה-pia mater שמתחת.
    2. לאחר ביצוע החפירה הראשונית, הגדל את הגולגולת באמצעות מלקחיים עדינים כדי להסיר בזהירות את העצם מהקצוות.
  6. מלאו מזרק של 1 מיקרוליטר בתמיסה הנגיפית שיש להזריק (UNC Vector Core).
    1. כדי לשפר את יעילות הטרנספקציה, הכינו תמיסה ויראלית עם 4 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן.
  7. הורד את המחט לאזור להזרקה והחדיר בלחץ 200 נ"ל של תמיסה המכילה וירוס עם משאבת מזרק.
    1. הניחו למזרק לשבת 10 דקות לפני הוצאת המחט.
  8. לתפור את העור בניילון מונופילמנט שאינו נספג ולכסות את החתך במשחה אנטיביוטית.
    1. יש להסיר תפרים לאחר 7-10 ימים.
  9. יש להזריק בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
  10. אפשר לבעלי חיים להתאושש לאחר הניתוח במשך 14-21 יום כדי לאפשר ביטוי הולם של רודופסין תעלה.

2. הכנת פרוסות

  1. לאחר תקופת ההחלמה, יש להרדים את בעל החיים לעומק באמצעות הרדמה איזופלורנית, כפי שאומת על ידי היעדר רפלקס נסיגה כאשר כף הרגל האחורית ו/או אצבעות הרגליים נצבטות היטב.
  2. נתח את המוח על ידי עריפת ראש ואחריו חתכים בקו האמצע והחזית של הגולגולת.
  3. קלף את הגולגולת מקו האמצע כדי לחשוף את המוח.
  4. הסר בזהירות את המוח באמצעות מרית כף דקה כדי להפריד את עצבי הגולגולת מבסיס המוח.
  5. הניחו במהירות מוח מנותח בכוס קטנה של 100 מ"ל המכילה נוזל מוחי מלאכותי צונן וקר כקרח (ACSF; במ"מ: 125 NaCl, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 גלוקוז).
  6. הסר את המוח מ-ACSF והניח על שקופית מיקרוסקופ מכוסה בנייר פילטר שהורטב מראש ב-ACSF.
  7. בצע חתך חוסם של המוח בכיוון הרצוי באמצעות סכין גילוח נקי.
  8. הצמד את פני השטח החסומים של המוח לשלב החיתוך באמצעות דבק דבק מיידי.
  9. מעבירים את השלב לתא חיתוך ויברטום (נשמר במקפיא עד שמוכן לחיתוך).
  10. יוצקים ACSF קר כקרח לתא החיתוך.
  11. פורסים קטעי מוח ב-400-500 מיקרומטר באמצעות פורס רקמות רוטט.
  12. העבירו פרוסות מוח לתא החזקה המכיל ACSF מחומצן, ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני הניסוי.

3. הקלטה פיזיולוגית

  1. לאחר תקופת הדגירה, העבירו פרוסה לתא הקלטה בשלב מיקרוסקופ שונה.
  2. אבטח את הפרוסה באמבטיה במהלך הניסוי באמצעות כמה חוטי ניילון המחוברים למחזיק פרוסות חוט פלטינה.
  3. טפטף את הפרוסה עם ACSF ללא הרף.
  4. משוך פיפטות הקלטה להתנגדות קצה של 3-6 MΩ כאשר הן מלאות בתמיסה תוך-תאית המכילה את הדברים הבאים (במ"מ): 127 K-gluconate, 3 KCl, 1 MgCl2, 0.07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0.3 Na-GTP, 0.1 EGTA. התמיסה התוך-תאית צריכה להיות בעלת pH 7.3, מותאמת עם KOH או חומצה גלוקונית ואוסמולליות של 280-290 mOsm.
  5. באמצעות מערך הקלטה סטנדרטי של תא שלם, הנח את פיפטת ההקלטה ליד נוירון להקלטה תוך הפעלת לחץ חיובי22,23.
  6. שחרר לחץ חיובי תוך הפעלת יניקה ליצירת אטם Gigaohm.
  7. הפעל יניקה קצרה כדי לשבור את הממברנה וליצור הקלטת תצורת תא שלם.
  8. רשום את תגובות הנוירונים במתח או במהדק זרם.

4. גירוי פוטוסטימולציה בסריקת לייזר

  1. התחל תוכנה וחומרה לאיסוף נתונים, שתוארו בדוחות קודמים23-29.
    הערה: השתמשנו הן בתוכניות הרכישה של Tidelwave25 והן לאחרונה ב-Ephus26, שנכתבו ב-Matlab ופותחו על ידי המעבדה של קארל סבודה ב-Janelia Farms30. לתיאור מלא של גירוי פוטוסטימולציה בסריקת לייזר באפוס, ראה Suter et al.26 והמדריך שלבאחר שלב 30.
    הערה: ההגדרה המתוארת במאמר זה נגזרת מזו שתוארה על ידי Shepherd (2012)23. קרן הלייזר מונחית באמצעות מערכת אלומה פתוחה של מראות ליציאה העליונה של המיקרוסקופ דרך עדשת האובייקט על הפרוסה (איור 2).
  2. הפנה חלק קטן מהלייזר לפוטו-דיודה עם כיסוי מיקרוסקופ הממוקם בנתיב הלייזר והשתמש בפלט הזרם מפוטודיודה זו כדי לנטר את עוצמת הלייזר במהלך הניסויים.
    1. כייל את פלט זרם הפוטו-דיודה שנקלט בתוכנה לעוצמת הלייזר הנמדדת במישור המוקד האחורי של המטרה באמצעות מד כוח במהלך הגדרת הציוד23.
  3. שלוט בכוח הלייזר על ידי סיבוב גלגל בצפיפות ניטרלית משתנה. עוצמת הלייזר ששימשה נעה בין 25-70 מגוואט (במישור המוקד האחורי) בניסויים שלנו.
  4. הגדר את האורך והתזמון של גירוי הלייזר על ידי שינוי פרמטרי הדופק עבור הלייזר והתריס. גירוי לייזר הוא בדרך כלל באורך של 2 מילי-שניות.
  5. צלם תמונה של האזור שיש לגרות באמצעות הפונקציה 'תפוס וידאו'.
  6. בחר את רשת הגירוי בהתאם למידות הרצויות. בדרך כלל אנו משתמשים במערך גירוי של 16 x 16 עם מרווח של 80 מיקרומטר בין שורות ועמודות סמוכות.
  7. שכב על רשת המיפוי עם התמונה שנרכשה והתאם את היסט x, y ומעלה למיקום ולכיוון הרצויים.
  8. הפעל את פונקציית 'מפה' כדי להתחיל בגירוי ואיסוף נתונים.
  9. לאחר רכישת תגובות מעוררות פוטוסטימולציה, בצע ניתוח של נתונים ממופים באמצעות תוכנית ניתוח המפות הלא מקוונת ב-Tidelwave25 או בתוכנית 'MapAnalysis' באפוס26.

5. הדמיית פרוסה קבועה

  1. לאחר ההקלטות, העבירו את פרוסת המוח ל-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-0.01 M PBS (pH7.4) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. מעבירים את הפרוסה ב-30% סוכרוז ב-4% PFA/0.01 M PBS למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. חותכים קטעים של 50 מיקרומטר באמצעות קריוסטט ואוספים ב-0.01 M PBS.
  4. יש לשטוף חלקים ב-0.01 M PBS פעמיים בטמפרטורת החדר.
  5. הרכיב חלקים והחלקה במדיום נוגד דהייה מתאים.
  6. העבר קטעים למיקרוסקופ הקונפוקלי.
  7. התמקד בהחזר על ההשקעה באמצעות אור לבן.
  8. בחר את אורך הגל, גודל ההדמיה והחזרה לרכישת תמונה. עבור YFP, אנו משתמשים ב-514 ננומטר (Ex)/527 ננומטר (Em).

תוצאות

בוצעה פוטוסטימולציה באמצעות סריקת לייזר של השליחותים שבין האזור החזותי הראשוני (V1) לבין האזור החזותי המשני (V2) בעכבר, לאחר הזרקות של pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP לתוך V1 של עכבר Balb/C (איור 3).הפרומוטור CaMKIIa בקונסטרוקט ויראלי זה מניע ביטוי ספציפי של channelrhodopsin-EYFP בנוירונים גלוטמטארגיים מעוררים1,15לאחר הכנת פרוסות להקלטה פיזיולוגית, ביטוי של סיבי channelrhodopsin-EYFP, כלומר נצפתה פלואורסצנציה אפיפלואורסצנטית של EYFP המשולב, בעודו נע מ-V1 ל-V2 (איור 3A). בנוסף, נצפו גם הסיבים הקורטיקו-תלמיים בגרעין הברכיים הצדי (LGN) (איור 3Aהקלטות patch clamp של תא שלם מנוירון ב-V2 חשפו EPSCs שהתעוררו בעקבות פוטו-סטימולציה בסריקת לייזר של סיבים המבטאים channelrhodopsin-EYFP בשכבות התחתונות של V2 (איור 3ב).

בדוגמה אחרת, פוטוסטימולציה בסריקת לייזר של השליחות קורטיקו-תלמיות משכבה 6 של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1) אל הגרעין הוונטרופוסטריורי (VP) בוצעה באמצעות פרוטוקול זה. כאן, השתמשנו בגישת Cre-Lox כדי לכוון באופן ספציפי את ביטוי ה-channelrhodopsin בנוירונים של שכבה 6 ובשליחות הקורטיקו-תלמיות הרלוונטיות. באופן מפורש, הזרקנו pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA לתוך S1 של עכברי B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (איור 1 ו 4). זן עכברים טרנסגני זה מבטא Cre-recombinase באופן ספציפי בנוירונים קורטיקו-תלמיים של שכבה 621, ולכן גורם לביטוי ChR-YFP רק בנוירונים אלו לאחר טרנספקציה של מבנה ה-AAV ה- 'floxed'. לאחר הכנת הפרוסות, נצפו סיבי channelrhodopsin-EYFP בנוירונים של שכבה 6 ובסיבים המקרינים לשכבה 4 ול-VP (איורים 4A ו 4B). הקלטה פיזיולוגית מנוירון VPm באמצעות whole-cell patch clamp גילתה כי ניתן היה לעורר EPSCs בעקבות פוטוסטימולציה בסריקת לייזר בקרבת הנוירון המוקלט (איורים 4C ו 4D).

את המורפולוגיה של הסיבים המסומנים ניתן היה להעריך בצורה קלה יותר לאחר ההקלטות הפיזיולוגיות. כאן, ביצענו חיתוך חוזר (50 μm) של תכשירי החתכים עם ביטוי של channelrhodopsin-EYFP בנוירונים קורטיקוטלמיים בשכבה 6 (איור 5). הדבר חשף תבנית עדינה של סיבים מסומנים העוברים משכבה 6 לשכבה 4, שם הם הסתיימו והתפשרו בצורה נרחבת (איור 5A). בנוסף, נצפו סיבים קורטיקוטלמיים הנכנסים לחומר הלבן ועוברים לכיוון התלמוס (איורים 5A ו- 5B).

דיאגרמת עריכת גנים באמצעות Cre-loxP עבור ביטוי ממוקד של ChR-YFP במודל עכבר.
איור 1. איור סכמטי של ביטוי ממוקד של channelrhodopsin באמצעות גישת Cre-Lox. לעכברים טרנסגניים המבטאים Cre-recombinase באוכלוסיות הנוירונים הרלוונטיות מוזרק נגיף 'floxed' המקודד ל-channelrhodopsin המחובר לחלבון פלואורסצנטי, כגון YFP. לאחר הטרנספקציה, רק נוירונים עם Cre-recombinase יבטאו channelrhodopsin-EYFP. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

תרשים מיקרוסקופיית לייזר עם אופטיקת לייזר, מראה דיכרואית, מצלמת CCD ומערך סריקה.
איור 2. איור סכמטי של מערך הפוטוסטימולציה. (A) תרשים של מערך פוטוסטימולציה בסריקת לייזר. קרן הלייזר מודרכת בזה אחר זה דרך מערכת קרן פתוחה אל תריס ומסנן צפיפות ניטרלית (N.D.). כיסוי זכוכית (coverslip) מחזיר חלק מהקרן אל פוטודיודה המחוברת למגבר למדידות הספק הלייזר. גלונומטרים-מראות משמשים למיקום קרן הלייזר דרך עדשת סריקה, המנחה את הקרן דרך פתח צדי בחלקו העליון של המיקרוסקופ. לאחר מכן הקרן מוחזרת למטה דרך עדשת העדפה אל דגימת הפרוסה באמצעות מראה דיכרואית. לפרטים נוספים ראו את Lam and Sherman23 ואת Shepherd29. (B) דוגמה לתבנית רשת הפוטוסטימולציה עבור הניסוי המייצג המוצג באיור 3. רשת הגירוי של 16 x 16 מוטלית על פני תמונת מיקרוסקופ של דגימת הפרוסה. כוכב אדום מציין את מיקומו של נוירון שנרשם באמצעות whole-cell patch clamp. מיקומה של קרן הלייזר מודרך לכל אחת מ-256 העמדות ברשת הגירוי באמצעות מיקום ממוחשב של הגלונומטרים-מראות. מיקומי הלייזר של 5 אתרי הגירוי הראשונים מוצגים באיור. התגובות מהנוירון הרשום לפוטוסטימולציה בכל אחד מהאתרים מוצגות באיור 3. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דיאגרמת מפת הדמיה עצבית; ניתוח של LGN, V1, וקליפת המוח החזותית V2; מחקר קשרים עצביים.
איור 3. פוטוסטמולציה באמצעות סריקת לייזר של הקרנות קורטיקו-קורטיקליות מקליפת המוח החזותית הראשונית (V1) לקליפת המוח החזותית המשנית (V2) בעכבר. (A) תמונת אפי-פלואורסצנציה של הכנה של פרוסות המראה סיבי channelrhodopsin-EYFP מ-V1 ל-V2 ובגרעין הגניקולט הלטרלי (LGN). ביטוי ספציפי של channelrhodopsin-EYFP בנוירונים גלוטמטריים מעוררים מונחה על ידי מבנה ויראלי המכיל את מקדם ה-CaMKIIa. (B) זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSCs) שגורמו בנוירון ב-V2 בעקבות פוטוסטמולציה באמצעות סריקת לייזר. כוכב אדום מציין את אתר ההקלטה. פסי קנה מידה: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. לחצו כאן לצפייה בתמונה מורחבת.

דיאגרמה של שכבות קליפת המוח עם ניתוח של אזור ה-VP; ממפה פעילות מיקרו-חשמלית; נתוני אלקטרופיזיולוגיה.
איור 4. פוטוסטמולציה באמצעות סריקת לייזר של הקרנות קורטיקו-תלמיות מקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1) אל הגרעין הוונטרו-פוסטריורי (VP) בעכבר. (A) תמונה אפיפלורסצנטית של הכנת הפרוסה המראה סיבי channelrhodopsin-EYFP ב-S1. (B) תמונה אפיפלורסצנטית של סיבים מסומנים ב-VP. (C) זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSCs) שהופעלו מנוירון ב-VP בעקבות פוטוסטמולציה באמצעות סריקת לייזר. (D) גרף של ממוצע ה-EPSCs. כוכב אדום מציין את אתר ההקלטה. העקבות במסגרת ב-(C) תואמות לערכים במסגרת ב-(D). סרגי קנה מידה: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המראה מבנים עצביים, המסומנים במסמנים ירוקים; תרשים השוואה.
איור 5. דימוי של נוירונים בשכבה 6 המבטאים channelrhodopsin-EYFP בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1) של עכבר. (A-B) נוירונים מסומנים בשכבה 6 וסיבים המקרינים לשכבה 4 ולחומר הלבן. סרגי קנה מידה: (A) 250 µm, (B) 250 µm. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

דיון

הפרוטוקול המתואר מפרט גישה להערכה חוץ גופית של טופוגרפיה תפקודית ופיזיולוגיה של מעגלים עצביים, שאינה מוגבלת לחקירת מעגלי המוח הקדמי, כלומר אלה של התלמוס וקליפת המוח. מספר מבנים נגיפיים לטרנספקציה אופטוגנטית הועמדו לרשות הקהילה המדעית וניתן להשיג אותם בקלות מליבת הווקטור של UNC. לתיאור של מבנים נגיפיים זמינים, ראה UNC Vector Core31, דף משאבי האופטוגנטיקה במעבדת Deisseroth באוניברסיטת סטנפורד32 ומעבדת הנוירוביולוגיה הסינתטית Boyden ב-MIT33. גרסאות של אופסינים אלה פותחו על ידי מעבדות אלה ומאפשרות מצבים רחבים לשליטה בריגוש עצבי1,2. השגת וקטורים אלה מליבת וקטור UNC דורשת הסכם העברת חומרים ממעבדות המקור. בפרוטוקול זה, נציין כי תוספת של פוליברן משפרת את יעילות הטרנספקציה. בנוסף, משתנה נוסף המשפיע על הביטוי הוא תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח, בה נציין כי תקופה של לפחות 14 יום מספיקה בכדי להשיג ביטוי חזק במסלולי המוח הקדמי של עכברים.

לצורך טרנספקציה ממוקדת של קבוצות עצביות ספציפיות, פותחו מספר קווי עכברים טרנסגניים, שניתן להשתמש בהם בשילוב עם מבנים ויראליים של מסגרת קריאה פתוחה 'פלוקסית' שפותחו11. מספר זנים הרלוונטיים למחקר במדעי המוח זמינים דרך מרכזי המשאבים האזוריים של עכבר מוטנטי34. אטלסים של דפוסי ביטוי Cre-recombinase בקווים טרנסגניים אלה מוצעים באמצעות מסד הנתונים GENSAT35. בנוסף, מעבדות ג'קסון מציעה מספר זנים טרנסגניים של Cre, כמו גם אחרים המבטאים אופסינים בקבוצות עצביות ספציפיות. צעד קריטי לניצול קווי עכברים אלה הוא לקחת בחשבון את הזמן הדרוש להשגת והקמת מושבת רבייה, שעשוי להשתנות בהתאם לזן הספציפי המעניין.

לצורך פוטוסטימולציה השתמשנו והתאמנו את ההתקנה שפותחה על ידי מעבדת שפרד באוניברסיטת נורת'ווסטרן, שתוארה בפרוטוקול29 שפורסם לאחרונה. למרות שהוא מותאם לפירוק גלוטמט, הגדרה זו ניתנת גם לגירוי פוטו של channelrhodopsin ללא שינוי. מערך זה מאפשר שליטה מרחבית מדויקת ומיקום של מיקומי הפוטוסטימולציה המאפשרת הערכה של הטופוגרפיה התפקודית של עצבוב תעלה רודופסין של נוירונים מוקלטים. למרות שהשליטה המרחבית משופרת בשיטה זו של גירוי פוטו, היא יקרה יותר משיטות המשתמשות בתאורת שדה מבוססת LED20. בנוסף, חוסר האחידות של רקמת המוח הוא מגבלה של אופטוגנטיקה, או כל טכניקה הכרוכה במניפולציה של אור. עם זאת, בפועל, זה רק לעתים רחוקות גורם מכיוון שהתוצאות מתפרשות בעיקר בצורה איכותית. במקרה שיש צורך בהשוואה כמותית יותר בין אזורי המוח, תמיד ניתן להשתמש בעוצמת אור מקסימלית כדי להשיג תגובות "רוויות".

בנוסף, השתמשנו בתוכנות Tidelwave ו-Ephus שנכתבו ב-Matlab לשליטה בגירוי האור בסריקת לייזר ורכישת נתונים25,26. עם זאת, מומלץ למי שמקים מערכת דומה להשתמש בתוכנת Ephus26 החדשה יותר, שיש לה תמיכה זמינה דרך אתר הפיתוח של Janelia Farms30. שלב מפתח הוא בחירה באיזו מחבילות התוכנה הללו להשתמש, מכיוון שדרישות החומרה שלהן שונות במקצת. בנוסף, תוכניות ניתוח המפות מותאמות לתוכניות איסוף הנתונים שלהן.

ניתן לשנות כמה מהשלבים הללו כך שיתאימו להגדרה הספציפית של המתרגל. ניתן לבצע הזרקות של תמיסות נגיפיות עם מנגנוני אספקה מלבד מזרק, למשל פיפטות זכוכית נימיות הנמשכות לקוטר קצה של ~40 מיקרומטר גם עובדות היטב. לניתוחים, ניתן להחליף מחזיק ראש לא סטריאוטקסי אם קואורדינטות כאלה אינן נדרשות להנחיית זריקות. בנוסף, הרכבי ACSF ותמיסה תוך-תאית עשויים להשתנות בהתאם לדרישות הניסוי הספציפיות, למשל החלפת תמיסה תוך-תאית של צזיום או כלוריד גבוה לבידוד זרמים מעכבים. כמו כן, חלופה להדמיה של דפוסי ביטוי בפרוסות קבועות עשויה להיעשות גם בפרוסה החיה על מתקן הדמיה מתאים עם מערכת זלוף אמבטיה.

לסיכום, פרוטוקול זה יאפשר למטפל לאפיין את הטופוגרפיה התפקודית והפיזיולוגיה הסינפטית של הקרנות במבחנה, מה שאולי לא אפשרי בשיטות סטנדרטיות, למשל. אפיון הקרנות ארוכות טווח שלא ניתן לשמר אותן בפרוסה. ניתן ליישם את פרוטוקול הטרנספקציה המתואר על ניסויים אופטוגנטיים in vivo 1-3,12,14, מכיוון שמנגנון המסירה זהה. לבסוף, למרות שפרוטוקול זה מתאר טרנספקציה של עכברים, ניתן להשתמש ברבים מהווקטורים הוויראליים הזמינים כדי להעביר ולבטא באופן תיאורטי את האופסינים הללו במגוון רחב של מיני יונקים, ובכך לאפשר מספר עצום של מחקרים השוואתיים וספציפיים למינים1-3.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים. המחבר (CCL) קיבל מענק פרסום מ-Leica Microsystems, המייצרת מכשיר ששימש לצילום זה של פרוטוקול זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH/NIDCD R03 DC 011361, LAV3202 מענק SVM CORP, PFUND86 מענק NSF-LA EPSCoR ומענק פרסום מ-Leica Microsystems (CCL) ומענק NIH/NIDCD R01 DC 008794 (SMS).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PolybreneSanta Cruz BiotechSC134220
Paraformaldehyde 32% פתרוןEMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV מבנים ויראלייםUNC Vector CoreNA
Mouse מחזיק ראש סטריאוטקטיStoelting51730
Nanocool מזרקהרווארד מכשיר703040
לייזר UV: 355 ננומטר, Nd:YVO4; 1 W;DPSS לייזרים, בע"מ3500
גלבונומטריםקיימברידג' סריקת6210
מראותקיימברידג' סריקה6m2003S-A
תושבתקיימברידג' סריקה6102103L
כבלקיימברידג' סריקת6010-19-120
דרייבר/בקרקיימברידג' סריקה67121-1
תריס - מצופה ZM (תואם UV)UniblitzL23-ZM2
בקר תריסUniblitzVMM-D1
מגבר זרםסטנפורד מערכות מחקרSR570
6713 לוחNational Instruments777741-01
2110 תיבת פריצהNational Instruments777643-01
PCI-MIO-16E-4מכשירים לאומיים777383-01
BNC-2090מכשירים לאומיים777270-01
כבליםמכשירים לאומיים184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems

מקורות

  1. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  2. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).
  3. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons. Neuron. 33, 15-22 (2001).
  6. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).
  7. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  8. Lanyi, J. K. Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).
  9. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (2007).
  10. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).
  11. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  12. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  13. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit. Science. 324, 354-359 (2009).
  14. Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. Gain control by layer six in cortical circuits of vision. Nature. 483, 47-52 (2012).
  15. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  16. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, 230-245 (2010).
  18. Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. Intracortical convergence of layer 6 neurons. Neuroreport. 23, 736-740 (2012).
  19. Mancuso, J. J., et al. Optogenetic probing of functional brain circuitry. Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).
  20. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  21. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).
  22. Cox, C. L., Sherman, S. M. Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus. Neuron. 27, 597-610 (2000).
  23. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat. J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).
  24. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus. Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).
  25. Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
  26. Suter, B. A., et al. Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments. Front Neural Circuits. 4, (2010).
  27. Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).
  28. Lee, C. C., Sherman, S. M. Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission. Hear Res. , 287-2843 (2012).
  29. Shepherd, G. M. Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate. , Cold Spring. 998-1004 (2012).
  30. ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: http://www.ephus.org (2003).
  31. UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: http://genetherapy.unc.edu/services.htm (2003).
  32. Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics (2003).
  33. Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: http://syntheticneurobiology.org (2003).
  34. Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.mmrrc.org (2003).
  35. GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.gensat.org/cre.jsp (2003).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ChannelrhodopsinWhole cell Patch ClampCre lox
Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.