הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית

28.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50924

⸱

25 בפברואר 2014

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, NYU Hospital for Joint Diseases, 2Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול ליציבות של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) בעכברים, כלי יעיל למחקר דלקת מפרקים ניוונית (OA). בנוסף, יש לנו הפגנו מחסור זה של פיתוח progranulincan להגזים OA והתקדמות באמצעות מודל זה, המציין כי progranulin משחק תפקיד מגן בפתוגנזה של OA.

תקציר

יציבות של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) הוא כלי חשוב ללימוד תפקידי pathophysiological של מולקולות דלקת פרקים רבות הקשורים בפתוגנזה של דלקת מפרקים ניוונית (OA) in vivo. עם זאת, מפורט, במיוחד הפרוטוקול דמיינו להקמת מודל מסובך זה בעכברים, אינו זמין. במסמך זה אנו ניצלנו wildtype וprogranulin (PGRN) - / - עכברים כדוגמאות להציג את פרוטוקול לגרימת מודל DMM בעכברים, ולעומת תחילתה של OA לאחר הקמת מודל מושרה בניתוח זה. הפעולות שבוצעו על עכברים היו או פעולת דמה, שנפתחה רק כמוסה משותפת, או בהפעלת DMM, אשר חתכה את רצועת menisco-השוקה וגרמה להתערערות של המניסקוס המדיאלי. חומרת דלקת מפרקים ניוונית הוערכה באמצעות assay היסטולוגית (למשל צביעת Safranin O), ביטויים של גנים הקשורים OA, צורת השפלה של מולקולות תאי מטריקס סחוס, וosteophyteation. פעולת DMM מושרה בהצלחה ייזום OA והתקדמות בשני wildtype וPGRN-/ - עכברים, ואובדן של גורם גדילת PGNR הוביל לפנוטיפ OA חמור יותר במודל מושרה בניתוח זה.

מבוא

דלקת מפרקים ניוונית (OA), המכונה גם דלקת פרקים ניוונית, משפיע 15% מאוכלוסיית העולם של ומעל 46 מיליון אנשים בתוך ארצות הברית, ומאופיין בדלקת, ניוון סחוס, והיווצרות osteophyte 1. זה יכול להיות תוצאה של יחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים, מטבולים, ביומכנית וביוכימיים. המנגנון הבסיסי של OA ימשיך להתחמק מהקהילה המדעית. קיימים כיום מודלים של בעלי חיים רבים שיכולים לחקות את הפתוגנזה של OA 2,3. זה חשוב להקים מודלים של בעלי חיים בעכברים בגלל שתי הזמינות של עכברים מהונדסים גנטי שונים ועלות התועלת של ניסויים. בין סוגים שונים של מודלים OA ניסויים השונים, היציבות הנגרמת בניתוח של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) היא מודל OA היטב קיבל בגלל שחזור הטוב שלה והתקדמות איטית יחסית בפיתוח OA. שתי התכונות האלה יש ליהיה מפתח להערכת התקדמות OA בטיפולים שונים או transgenes 3-8. עם זאת, העקביות של מודל OA כירורגית מושפעת מגורמים שונים במהלך הניתוח וכתוצאה מכך, היישום של מודל עכבר כירורגית מוגבל.

Progranulin (PGRN) הוא גורם גדילה רב תפקודי המתבטא בתאים שונים. זה ידוע כי PGRN משחק תפקיד קריטי בתהליכים פיסיולוגיים ומחלות שונים, כגון ריפוי פצעים 9, tumorigenesis 10, ודלקת 11-15. מחקרים גם הראו כי אי ספיקה של PGRN יכולה לגרום למחל ניווניות של מערכת עצבים בבני האדם ועכברים 16-18. זה ידוע כי PGRN בא לידי ביטוי בסחוס במפרק אנושי, ורמתו גבוהה באופן משמעותי בסחוס של חולים עם OA ודלקת מפרקים שגרונית 19. בנוסף, PGRN גם ממלא תפקיד מכריע בהתפשטות הכונדרוציטים 20, בידול וendochondralהתאבנות של צלחת צמיחה במהלך פיתוח 21,22. לאחרונה, דיווח כי PGRN קומם TNF-α באמצעות קשירה לקולטנים TNF והציג פונקציה אנטי דלקתית במודלים של דלקת מפרקים דלקתיים 13,14,23,24. עם זאת, תפקידיו של PGRN בOA, במיוחד in vivo, נותר חידה. בזאת, אנו מציגים את ההליך כדי לגרום למודל DMM כירורגית, ולחקור את התפקיד של PGRN בפיתוח OA באמצעות הקמת מודל DMM ב WT וPGRN-/ - עכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניתוחים הקשורים לבעלי החיים צריכים להיות מאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים ובועדת האתיקה של מוסד המקומי, עם מאמץ שנעשה כדי למזער את כאב ואי נוחות הנגרמת על ידי הניתוח.

1. הכנה

  1. בחר C57BL / 6 עכברי זכרים 8-12 שבועות ישנים עם משקל גוף של כ 25 גרם לניתוח.
  2. להרדים את בעלי החיים באמצעות זריקת intraperitoneal של קוקטייל המכיל גם xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) וקטמין (40 מ"ג / קילוגרם).
  3. לגלח את הברך עם סכיני גילוח, ולאחר מכן בניתוח לעטוף את בעלי החיים ולעקר את האתר כירורגית עם בטאדין ואלכוהול (3x) ולכסות את עיני עכבר עם משחה.

2. תהליך כירורגי

  1. לעשות חתך para-patellar 1 סנטימטר אורך המדיאלי לחשוף את מפרק הברך.
  2. פתח את מפרק הברך בעדינות דרך העקירה רוחב של הפיקה ורצועות פיקה.
    1. חותכים את קופסית מפרק הברך אורכיםדרך חתך para-הפיקה המדיאלי בשלב 2.1.
    2. לנתח קופסית מפרק הברך עם מלקחיים.
    3. תפוס את חלקו האחורי של כף רגל אחורית עם יד שמאל, ולבצע עקירה לרוחב של הפיקה ורצועות פיקה עם מלקחיים. החזק את כף הרגל האחורית בעדינות ולוודא כדי למנוע טראומה בכפה. טוב יותר קופסית המפרק מנותחת, יידרש פחות הכוח כדי להפוך את העקירה.
  3. לטפטף מי מלח סטריליים על פני השטח של סחוס במפרק במהלך פעולה, כדי למנוע התייבשות של משטח סחוס.
  4. לחתוך את רצועות meniscotibial המדיאלי המעגנת את המניסקוס המדיאלי לרמת השוקה. הימנע מפגיעה בסחוס מתחת המניסקוס המדיאלי.
    1. זהה את המניסקוס המדיאלי אשר מאתר בין condyle המדיאלי של עצם ירך ומישור המדיאלי של עצם השוק.
    2. זהה את רצועת meniscotibial שמחברת את הצד הלטרלי של המניסקוס המדיאלי עם רוממות intercondylar של שוקה.
    3. החזק את ההייnd כפה בעדינות עם יד, ולחתוך את רצועות meniscotibial המדיאלי בקפידה על ידי שימוש בלהב כירורגי מס 10. ודא שלא לגרום לפוצעים במפרק סחוס ורצועות אחרות. במקרים רבים, המכסה את כרית השומן צריכה להיות משכה לצד, אבל לא שיש להסירו על מנת לזהות את הרצועה.
  5. סגור את קופסית מפרק הברך עם תפר נספג 6-0.
  6. סגור את העור עם 6-0 תפר משי.

3. טיפול שלאחר ניתוח

  1. תחול ירידה של bupivacaine 0.25% אחד באתר כירורגית של כל עכבר כדי למזער את הכאב שלאחר ניתוח.
  2. השאר את העכברים פעלו בחינם כדי לקבל מים ומזון.

4. ניקוד היסטולוגית של דגם DMM כירורגי

  1. להקריב את העכברים בנקודות שצוינו זמן (למשל 4 שבועות, 8 שבועות, ו12 שבועות. כאן אנו הראו תוצאות של 8 שבועות כנציג) לאחר הניתוח.
  2. מפרקי הברך כולו הם קבועים, decalcified, לפdded ידי פרפין ולאחר מכן נותח באופן סדרתי ב5 מרווח מיקרומטר.
    1. חותכים את הגפיים אחוריות שלמים עם מס '10 להבים.
    2. לנתח את העור ושרירים של הגפיים האחורי בזהירות, ולתקן את הדגימות עם PFA 4% במשך 3 ימים בRT.
    3. הסר את PFA, ולנקות את הדגימות עם מים. לאחר מכן, decalcify הדגימות בEDTA על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות.
    4. מייבשים את הדגימות בשיפוע אתנול. בפירוט, לשמור את הדגימות באתנול 70% עבור שעה 1, ולאחר מכן לשנות את אתנול ולשמור את הדגימות בסט חדש של 70% אתנול לO / נ לאחר מכן, הכניס את הדגימות ב80% ו90% אתנול כתוצאה מכך, ולשמור אותם לשעה 1, בהתאמה, ואחריו אתנול 100% לO / נ
    5. הסר את אתנול. שמור את הדגימות בoxylene עבור שעה 1, ולעבור לקבוצה חדשה של oxylene. חזור 3x שלב זה.
    6. להטביע את הדגימות לתוך תבנית פרפין באמצעות מרכז הטבעה לייקה. לאחר מכן, הדגימות הם מחולק ב5 מיקרומטר באמצעות microtome סיבובי (לייקה RM2255, גרמניה) ולאחר מכן נאסף על גבי שקופיות זכוכית.
    7. סעיפי sagittal סידוריים נחתכים עבור כל דגימה פורש אזור ממרכז condyle לרוחב למרכז של condyle המדיאלי.
  3. מכתים Safranin O מבוצע, ואחריו ניקוד וניתוח סטטיסטי באמצעות שיטת ניקוד OARSI כפי שתואר לעיל 25.
    1. ראשית, deparaffinize השקופיות בoxylene, ומימה בשיפוע אתנול למים מזוקקים. לאחר מכן, הם מוכתמים השקופיות דרך ברזל Hematoxylin הפתרון של וייגרט, פתרון 0.05% ירוקים מהיר (FCF), 1% חומצה אצטית פתרון, ו0.1% O פתרון Safranin. הר השקופיות באמצעות מדיום שרף.
    2. ציון השקופיות המוכתמות Safranin O מבוסס על אובדן proteoglycan (צבע אדום) בסחוס ואחוז ההרס במבנה סחוס, לעשות ניתוח סטטיסטי לציון היסטולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מודל DMM הוקם בהצלחה בעכברים, וחסר של PGRN מוגזם פיתוח OA בניתוח מושרה.

פעולות דמה וDMM (איור 1) בוצעו ב WT וPGRN-/ - עכברים. 8 שבועות לאחר הניתוח, העכברים הוקרבו, ומכתים Safranin O בוצע על החלקים ממפרקי הברך, ואחרי ניתוח סטטיסטי של ציון בדלקת מפרקים המבוסס על היסטולוגיה. כפי שניתן לראות באיור 2 א, לא היה מובן מאליו ניוון של סחוס בשני גנוטיפים בקבוצות פעולת דמה ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הוא דיווח כי הזן של עכברים הוא חשוב מאוד לזירוז מודל DMM, זנים שונים כמו של עכברים דרגות חומרה שונים של OA אחרי DMM, עם הרמה הגבוהה ביותר במתח 129/SvEv, ואחריו C57BL6, 129/SvInJ ולאחר מכן FVB / n 26. חלק גדול מtransgenes הוקם בעכברי C57BL6, כגון PGRN-/ - עכברים ששמשנו במחקר הנוכחי, שהם יחסית רגישים לDMM. עם זאת, אם transgene מבוסס על זן רגיש כגון FVB / n עכברים, יש צורך ההכלאה לאחור עכברים אלה עם זנים רגישים לפני גיוס DMM. המין של עכברים המשמשים לזירוז DMM הוא גם מאוד ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אנחנו בזאת מצהירים כי אין לנו שום ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענקי מחקר R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, ומענק מחקר ממוקד מחלה מקרן ראומטולוגיה מחקר (ליו יי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מס' 10 להבים כירורגייםנוצה25-2976#10
6-0 תפרשיניים יישומיWG-N53133

מקורות

  1. Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
  2. Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
  3. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
  4. Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
  6. Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
  7. Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
  8. Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
  9. He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
  10. Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
  11. Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
  12. Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
  13. Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
  14. Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
  15. Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
  16. Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
  17. Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
  18. Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
  19. Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
  20. Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
  21. Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
  22. Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
  23. Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
  24. Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
  26. Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
  27. Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
  28. Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
  29. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DMMOsteoarthritisSafranin OMANKIN
הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.