הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50936

⸱

30 בדצמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

כאן אנו מתארים הליך כדי לדמיין מתחמים ויראליים בנוזל ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

תקציר

חוקרים משתמשים באופן קבוע במיקרוסקופים אלקטרונים (TEMs) כדי לבחון ישויות ביולוגיות ולהעריך חומרים חדשים. כאן, אנו מתארים יישום נוסף עבור מכשירים אלה- צפייה במכלולים ויראליים בסביבה נוזלית. שיטה מרגשת וחדשנית זו של הדמיה של מבנים ביולוגיים מנצלת מחזיק דגימה מיקרופלואידית שפותחה לאחרונה. מאמר הווידאו שלנו מדגים כיצד להרכיב ולהשתמש במחזיק מיקרופלואידי כדי לדמות דגימות נוזליות בתוך TEM. בפרט, אנו משתמשים בחלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) כמערכת המודל שלנו. אנו מתארים גם צעדים לציפוי פני השטח של התא הנוזלי בביופילמים של זיקה הקושרים DLPs לחלון הצפייה. זה מאפשר לנו לצלם הרכבות באופן שמתאים לקביעת מבנה תלת מימדי. לכן, אנו מציגים הצצה ראשונה של חלקיקים תת-ויראליים בסביבה נוזלית מקומית.

מבוא

מטרה נפוצה של ביולוגים ומהנדסים היא להבין את הפעילות הפנימית של מכונות מולקולריות. מיקרוסקופי אלקטרוני שידור (TEMs) הם מכשירים אידיאליים כדי לדמיין את הפרטים המורכבים האלה ברזולוציה כמעט אטומית1-2. על מנת לקיים את מערכת ואקום גבוהה של TEM, דגימות ביולוגיות מוטבעות בדרך כלל בסרטים דקים של קרח זגוגי3, סוכרים4, מלחי מתכת כבדה5, או שילוב כלשהו של6. כתוצאה מכך, תמונות של דגימות מוטבעות עשויות לחשוף רק תמונות מוגבלות של תהליכים דינמיים.

ניסיונות מוקדמים לשמור על דגימות ביולוגיות hydrated בתאי נוזלים סביבתיים בוצעו על ידי פרסונס ועמיתיו באמצעות שלבי שאיבה דיפרנציאליים. דפוסי עקיפת אלקטרונים של גבישי קטלאז לא מוכתמים נרשמו בהצלחה לרזולוציה של 3 Å במצב hydrated7-8. בנוסף, תחומי השומנים מופרדים פאזה ניתן לבדוק קרום hydrated של אריתרוציטים אנושיים9-10. עם זאת, תנועה הנגרמת על ידי פיזור נוזל והפרעתו לקרן האלקטרונים, גרמה לאובדן רזולוציה חמור וניסויים נוספים באמצעות דגימות ביולוגיות לא נוסו עד לאחרונה.

לאחרונה פותחו מחזיקי דגימה מיקרופלואידית שמשתמשים בשבבים מוליכים למחצה כדי ליצור תא סביבתי בקנה מידה זעיר. התקנים אלה יכולים לשמור דגימות בנוזל בזמן שהם ממוקמים בעמודה TEM11-12. פריצת דרך טכנית זו בהדמיית TEM אפשרה לחוקרים להציג, לראשונה, אירועים מתקדמים ברמה המולקולרית13. אנו מתייחסים לאופן חדש זה כמו " במיקרוסקופיה מולקולריתsitu " כמו ניסויים יכולים להתבצע כעת "בתוך" עמוד EM14-15. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לדמיין מכלולים ביולוגיים בנוזל כדי להתבונן בהתנהגויות הדינמיות שלהם ברזולוציית ננומטר. הרציונל מאחורי הטכניקה המפותחת הוא לתעד תצפיות בזמן אמת ולבחון תכונות חדשות של מכונות ביולוגיות בתמיסה. מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש ב- TEMs למטרות רחבות יותר בביולוגיה תאית ומולקולרית12-16.

במאמר הווידאו הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להרכבה ושימוש במחזיק דגימה מיקרופלואידית זמינה מסחרית. מחזיקים מיוחדים אלה משתמשים שבבי סיליקון ניטריד המיוצרים עם מרווחים משולבים כדי ליצור תא נוזלי המקיף כמויות זעירות של פתרון. חלונות דקים ושקופים חרוטים בשבבים למטרות הדמיה12. אנו מדגימים את השימוש הנכון של מחזיק microfluidic לבחון חלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) בנוזל באמצעות TEM. כדי להבטיח כי מכלולים ביולוגיים, כגון DLPs, לא להתפזר במהירות על פני מרחקים גדולים בעת הדמיה, אנו משתמשים בגישה לכידת אהדה לקשור אותם אל פני השטח של התא microfluidic16. שלב לכידה מולקולרית זה יש יתרון גדול על פני טכניקות חלופיות להדמיית דגימות ביולוגיות בנוזל מכיוון שהוא מאפשר רכישת תמונות שישמשו לשגרות עיבוד במורד הזרם. שלב לכידה זה המשמש בשילוב עם הדמיה מיקרופלואידית הוא ייחודי להליכים שלנו17. קוראים המשתמשים ביישומים ביולוגיים מבניים באמצעות TEM או תאי הדמיה מיקרופלואידיים עשויים לשקול את השימוש בטכניקות לכידת אהדה כאשר תצפיות דינמיות ברמה המולקולרית הן המטרה הסופית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן התקני לכידת קירבות16

  1. נקו את שבבי הסיליקון nitride E על ידי דגירה שלהם ב 15 מ"ל של אצטון במשך 2 דקות ואחריו 15 מ"ל של מתנול במשך 2 דקות(איור 1A). אפשר לשבבים להתייבש תחת זרימת אוויר למינארית.
  2. דגירה את השבבים המיובשים על צלחת ערבוב מחוממת (ללא ערבוב) במשך 1.5 שעות ב 150 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. השתמש מזרקים המילטון להלחין תערובות שומנים בצינורות זכוכית קטנים כדי להכיל 25% כלורופורם, 55% DLPC (1,2-דילאורויל-פוספוצ'ולן) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) ו-20% שומנים Ni-NTA (1,2-דיאולויל-אימינודיאקטי חומצה-סוציניל-ניקל מלח) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) בנפח כולל של 40 מיקרוגרם.
  4. החל 1 μl aliquot של התערובת על כל טיפה 15 μl של מים מילי-Q על חתיכת Parafilm בצלחת פטרי לחה(איור 1B). דגימות דגירה על קרח לפחות 60 דקות.

2. לכידת מקרומולקולות17

  1. הניחו שבב E עם מרווח משולב של 150 ננומטר מעל דגימת מונולאייר והדגירה למשך דקה(איור 1C).
  2. הרימו בעדינות את השבב מהדגימה והוסיפו אליקאוט של 3 מיקרומטר של חלבון A. דגירה למשך דקה בטמפרטורת החדר(איור 1D).
  3. כתם את הירידה העודפת באמצעות Whatman #1 נייר סינון ומיד להוסיף aliquot 3 μl של פתרון נוגדנים. דגירה במשך דקה בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את הפתרון העודף באמצעות מזרק המילטון ומיד להוסיף 1 μl aliquot של DLPs rotavirus (0.1 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חיץ המכיל 50 מ"מ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 ו 10 mM CaCl2. דגירה לפחות 2 דקות בטמפרטורת החדר. הכנת DLPs תוארה בעבר18.

3. להרכיב את התא המיקרופלואידי ולטעון את מחזיק דגימת in situ

  1. טען את שבב ה-E הרטוב המכיל את הדגימה הנגיפית לקצה מחזיק הדגימה המיקרופלואידית. פריקה זוהרת של שבב E שטוח שני למשך דקה אחת ולאחר מכן נטענת על גבי שבב המרווח(איור 2, לוחות 1.5).
  2. לחלופין, כדי להגדיל את הניגודיות של מקרומולקולות ביולוגיות, ניתן להוסיף כתם מתכת כבדה(למשל 0.2% אורניל) לדגימות רטובות לפני הנחת השבב האלקטרוני השני על הדגימה הרטובה. עם זאת, שבב E המכיל את הדגימה יהיה צורך לשטוף עם מים מילי-Q לפני הוספת ריאגנט ניגודיות.
  3. כריך את ההרכבה כולה יחד כדי ליצור מארז אטום, מוחזק במקום מכני בתוך המחזיק על ידי 3 ברגים פליז(איור 2,לוחות 6-8).
  4. לאחר ההרכבה, קצה המחזיק נשאב ל-10-6 טור באמצעותתחנת שאיבה יבשה עם משאבת טורבו לפני הנחת המחזיק בתוך ה-TEM.

4. הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

  1. טען את מחזיק הדגימה במקום למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (FEI Company) המצויד בסיבי LaB6 ופועל במהירות של 120 kV.
  2. הפעל את חוט ה- TEM והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית הרטט כדי להטות את המדגם מ- -15° ל- +15° הלוך ושוב בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון z כדי לסייע להסביר את העובי הנכון של התא הנוזלי. שלב זה גם מבטיח שנעשה שימוש בהגדלה מדויקת בעת הקלטת תמונות.
  3. הקלט תמונות לאורך הקצוות ובאזורים הפינתיים של התא המיקרופלואידי תחילה. אזורים אלה מכילים בדרך כלל את הפתרון הדק ביותר. הקלט תמונות של דגימות בתנאים במינון נמוך (1-3 אלקטרונים / Å2) באמצעות מצלמת CCD. השתמש בהגדלות נומינליות של 6,000X - 30,000X.
  4. קבע את ערך ההיתוך הנכון על-ידי התמקדות בקצה התא הנוזלי. השתמש בערך של -1.5 מיקרומטר כדי להקליט תמונות בהגדלה של פי 30,000. אם יתקל בתמיסה עבה או אם לא נעשה שימוש בסוכן ניגודיות בהכנת הדגימה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר בטווח של -2 עד -4 מיקרומטר.
  5. כדי להבטיח שהפתרון ייכלל בתא המיקרופלואידי לאורך כל הניסויים, מקד את קרן האלקטרונים עד שהבועות ייווצרו בנוזל שבתוך המכשיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמונות מייצגות של DLPs בנוזל באמצעות שבבי E ששוחררו בזוהר (איור 3A) מציגות פחות DLPs באזור צפייה נתון, ככל הנראה עקב דיפוזיה, בהשוואה ל- DLPs המועשרים במכשירי לכידת קירבה (איור 3B). התוספת של אורניל מתא ההדמיה משפרת את הניגודיות של הדגימה ומכאן את הנראות של DLPs בודדים בתמיסה (איור 3C, הלוח העליון). ניגודיות טובה יותר מאפשרת עיבוד תמונה במורד הזרם כגון ממוצע חלקיקים(איור 3C, לוח תחתון) ושגרות שחזור תלת-ממדיות(איור 3C, inset) כפי שתואר קו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבודה המוצגת שלנו, השתמשנו בגישת לכידת הזיקה לקשור DLPs rotavirus לפלטפורמה מיקרופלואידית. זה איפשר הדמיה situ של קומפלקסים מקרומולקולריים במיקרו-וירוס נוזלי. גישת הלכידה היא משמעותית ביחס לטכניקות הדמיה מיקרופלואידיות אחרות מכיוון שהיא ממקמת דגימות ביולוגיות לחלון ההדמיה כדי לשלול בעיות דיפוזיביות גדולות המתעוררות בעת הקלטת תמונות בנוזל. עם זאת, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול שלנו כרוך בהעברת הביופילם של השומנים למשטח השבב. אם המונולאייר השומנים לא יצליח להתפשט באופן שווה ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברת, מדלין ג'יי דיוקס, היא עובדת של פרוטוצ'יפס בע"מ.

תודות

המחברים מכירים ד"ר מייקל ג 'פרידלנדר, מנהל מכון המחקר וירג'יניה טק Carilion לעידוד מאמצי המחקר שלנו. פרויקט זה נתמך על ידי קרנות פיתוח ל- S.M.M ו- D.F.K. ובחלקו על ידי יוזמת ננו-ביו של המכון לטכנולוגיה קריטית ומדע יישומי בווירג'יניה טק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שבבים אלקטרוניים, שבב מרווחProtochips, Inc.EPB-52TBD400 & m x 50 μ m חלון
E-chip, שבב עליוןProtochips, Inc.EPT-45W400 μ m x 50 μ m חלון
Ni-NTA ליפידיםקוטביים Avanti790404Pצורת אבקה
DLPC (12:0) ליפידAvanti Polar Lipids850335Pצורת אבקה
צלוחיות נפח פישר סיינטיפיק20-812A; 20-812C1 מ"ל; 5 מ"ל 
מזרקי המילטוןהמילטון ושות'80300, 804001-10 μ l; 1-25 μ l
Whatman #1 נייר סינוןWhatman1001 090100 חתיכות, 90 מ"מ
צלחות פטרי זכוכיתקורנינג70165-101100 מ"מ x 15 מ"מ
פיפטות פסטר זכוכיתVWR14673-01014673-010
צינורות תרבית זכוכיתVWR47729-5666 מ"מ x 50 מ"מ
אצטוןפישר מדעיA11-11 ליטר
מתנולפישר סיינטיפיקA412-11 ליטר
כלורופורם Electron Microcopy Sciences12550100 ml 
התיוג שלו חלבון AAbcam, Inc.ab5295310 מ"ג
מערכת מים מילי-QEMD Millipore Corp.Z00QSV001מים טהורים
במיוחד HEPESFisher ScientificBP310-500500 גרם
ציוד 
פוסידון In situ מחזיק דגימהProtochips, Inc.  תואם FEI
Spirit BioTwin TEMFEI Co.120 קילו וולט
נשר 2k HS CCD מצלמהFEI ושות'10  Å/פיקסלים דגימה ב-30,000X
Gatan 655 תחנת משאבה יבשהGatan, Inc.קצה מחזיק משאבה ל-10-6  range
PELCO easiGlow, יחידת פריקת זוהרטד פלה, בע"מ  מצב קוטביות שלילית
צלחת ערבוב מחוממת איזוטמפפישר סיינטיפיקחום ל -150 º C למשך שעה וחצי

מקורות

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/50936

תגיות

סביבה נוזליתמחזיק מיקרופלואידילכידת זיקהחלקיקי דמוי-וירוס (DLPs) של רוטאווירוסדימות TEMויזואליזציה של נגיפיםמעקב אחר ננוחלקיקיםמיקרוסקופיה אלקטרונית
במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.