צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Cellulosomes הם קומפלקסי multienzyme בדידים בשימוש על ידי קבוצת משנה של חיידקים אנאירוביים ופטריות לעכל מצעי lignocellulosic. הרכבה של האנזימים על חלבון פיגום noncatalytic בבימויו של אינטראקציות בין בני משפחה של זוגות הקולטן ליגנד נלווים הכוללים מודולים cohesin וdockerin אינטראקציה. חזק מאוד מחייב בין cohesin ותוצאות מודולים dockerin בקבועי דיסוציאציה בpicomolar הנמוכה לטווח nanomolar, שעלולה לעכב מדויקות מדידות מחוץ לשיעור בשיטות בתפזורת קונבנציונלית. כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת (SMFS) עם מיקרוסקופ הכוח האטומי מודדת את התגובה של ביומולקולות פרט לכוח, וזאת בניגוד לשיטות אחרות מולקולה בודדת מניפולציה (כלומר פינצטה אופטית), היא אופטימלי לחקר אינטראקציות רצפטור ליגנד זיקה גבוהה בגלל היכולת שלו לחקור את עתיר כוח המשטר (> 120 PN). כאן אנו מציגים הפרוטוקול המלא שלנו ללימוד Cellulמכלולי חלבון osomal ברמת המולקולה בודדת. באמצעות הטופולוגיה חלבון נגזרת מcellulosome הילידים, שעבדנו עם האנזים-dockerin ופחמימות מחייבים מודול-cohesin (CBM-cohesin) חלבוני היתוך, כל אחד עם קבוצת תיאול החופשית נגישה בשאריות ציסטאין מהונדסות. אנו מציגים פרוטוקול קיבוע משטח ספציפי לאתר שלנו, יחד עם המדידה שלנו והליך ניתוח הנתונים לקבלת פרמטרים המחייבים מפורטים למתחם הזיקה גבוהה. אנו מדגימים כיצד לכמת את הכוחות יחיד משנה התגלגלות, כוחות קרע מורכבים, הקינטית מחוץ לשיעורים, ורוחב פוטנציאלי של כריכה היטב. היישום המוצלח של שיטות אלה באפיון האינטראקציה cohesin-dockerin אחראית על הרכבה של קומפלקסי cellulolytic multidomain מתואר נוסף.
מבוא
צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים גדולים המוצגים על פני השטח של חיידקים צלולוליטיים אנאירוביים (למשל C. thermocellum) שהתפתחו כדי לבצע דה-פולימריזציה יעילה של ליגנוצלולוז דופן תא הצמח לאוליגוסכרידים מסיסים1. תכונה מרכזית של צלולוזומים היא אינטראקציה גבוהה של קוהיזין-דוקרין. בפרדיגמה הבולטת ביותר, מודול דוקרין מסוג I של 60-75 חומצות אמינו משומר מאוד מוצג בקצה מסוף C של אנזימי החיידקים השונים. מודול הדוקרין מכוון הרכבה של שילובים סינרגטיים של אנזימים על חלבון הפיגום הלא קטליטי ('פיגום'), המורכב מפולי-חלבון של תחומי קוהסין הספציפיים למודול דוקרין מסוג I. ברמות גבוהות יותר, ארכיטקטורת התאית יכולה להיות מורכבת מאוד, המשלבת זוגות חלופיים של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
סכמה של גיאומטריית המתיחה ששימשה בעבודה זו לבחינת האינטראקציה בין cohesin ל-dockerin מוצגת ב-איור 1A. פרוטוקול קיבוע החלבונים המדווח כאן עבור פונקציונליזציה של הקנטילבר ושל זכוכית הכיסוי הוא גרסה שונה של הפרוצדורה שפורסמה בעבר27. החלבונים בוטאו מוקטורים פלסמידיים ב-E. coli באמצעות שיטות קונבנציונליות. החלבונים תוכננו עם קבוצת תיול נגישה לממס, ששימשה בשילוב עם כימיית maleimide כדי לקשור את החלבון באמצעות קשר thioether יציב למשטח זכוכית הכיסוי ולקנטילבר. שאריות הציסטאין ההנדסיות הן בחלבון המהולחם CBM-cohesin והן בחלבון המהולחם xylanase-dockerin מוקמו לכיוון הצד ה-N-טרמינלי של החלבונים, הרחק מממשק הקישור של cohesin-dockerin11
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השתמשנו בנוהל המתואר כדי לחקור זוג cohesin-dockerin מסוג I מ-C. thermocellum. לאחר קישור מוצלח של זוג ה-cohesin-dockerin, עקומות הכוח-מרחק שהוקלטו הראו דפוסי שיאים אופייניים. עקומה טיפוסית מוצגת ב-איור 4a. כל שיא בעקומה מייצג פתיחה (unfolding) של תת-דומיין חלבוני אחד, כאשר השיא האחרון תואם להתפרקות של קומפלקס הרספטור-ליגנד.
עבור קומפלקס ה-CBM-cohesin-dockerin-xylanase שנחקר בעבודה זו, העלייה הראשונית בכוח תואמת למתיחה של מולקולות מקשר ה-PEG. סדרת ירידות הכוח העוקבת, ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי להשיג נתונים משמעותיים מניסויי ספקטרוסקופיה של כוח מולקולה בודדת, חיוני להשיג גיאומטריות משיכה מוגדרות היטב וניתנות לשחזור. הפרוטוקול המשמש כאן מביא לקיבוע ספציפי לאתר של קומפלקסים חלבונים בגיאומטריית משיכה מוגדרת.
השלוחים ששימשו במחקר זה נבחרו בשל רגישותם לכוח ותדירות התהודה הגבוהה שלהם במים. יתר על כן, עקמומיות הקצה הקטנה של כ-10 ננומטר מועילה לניסויים במולקולה בודדת בשל סבירות מופחתת לאינטראקציות מרובות. עם זאת, טביעת הרגל הקטנה (38x16 מיקרומטר2) של זרוע השלוחה מסבכת את התאמת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים מודים למימון ממענק מתקדם של מועצת המחקר האירופית להרמן גאוב. מייקל א. נאש מודה בהכרת תודה על המימון מהחברה במדע - תוכנית המלגות של ברנקו וייס. המחברים מודים לאדוארד באייר, יואב ברק ודניאל ב' פריד ממכון ויצמן למדע על שסיפקו בנדיבות את החלבונים ששימשו במחקר זה. המחברים מודים להרמן א. גאוב, אליאס מ. פוכנר וסטפן ו. שטאל על דיונים מועילים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3-אמינופרופיל דימתיל אתוקסילאן | ABCR GmbH | AB110423 | |
| 5 kDa NHS-PEG-maleimide | Rapp Polymer | 13 5000-65-35 | |
| TCEP ג'ל להפחתת דיסולפיד | Thermo Scientific, Pierce | 77712 | www.thermoscientific.com/pierce |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | |||
| BioLever מיני סיליקון ניטריד cantilevers | אולימפוס | BL-AC40TS-C2 | קבוצות רכות |
| XYZ מפעילים פיזואלקטריים | Physik Instrumente GmbH | ||
| אינפרא אדום " ספקטרום רחב" לייזר IR | Superlum | ||
| MFP-3D AFM בקר | Asylum Research | ||
| Igor Pro 6.31 | Wavemetrics | רכישת נתונים וניתוח | |
| נתרן כלורי | |||
| סידן כלוריד | |||
| מד | |||
| נתרן בוראט | |||
| פינצטה | |||
| כיסוי כוסות | Thermo Scientific, Menzel-Glä סר | קוטר 24 מ"מ, עובי 0.5 מ"מ | |
| מחזיק מדגם PTFE בהתאמה | אישית | ||
| אמבט | |||
| אתנול | טוהר אנליטי | ||
| חומצה גופרתית (מרוכזת) | טוהר אנליטי | ||
| מי חמצן (30%) | טוהר אנליטי | ||
| שייקר אורביטלי | |||
| טולואן | טוהר אנליטי | ||
| נייר סינון זכוכית | |||
| שקופיות | |||
| מיקרו צינורות | |||
| מיקרופיפטות | |||
| צנטריפוגה | מתאימה למיקרו-צינורות | ||
| מסובב | |||
| צלחות | |||
| פטרי | |||
| מיקרוסקופ |
מקורות
- Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
- Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
