הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

20 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

תקציר

Cellulosomes הם קומפלקסי multienzyme בדידים בשימוש על ידי קבוצת משנה של חיידקים אנאירוביים ופטריות לעכל מצעי lignocellulosic. הרכבה של האנזימים על חלבון פיגום noncatalytic בבימויו של אינטראקציות בין בני משפחה של זוגות הקולטן ליגנד נלווים הכוללים מודולים cohesin וdockerin אינטראקציה. חזק מאוד מחייב בין cohesin ותוצאות מודולים dockerin בקבועי דיסוציאציה בpicomolar הנמוכה לטווח nanomolar, שעלולה לעכב מדויקות מדידות מחוץ לשיעור בשיטות בתפזורת קונבנציונלית. כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת (SMFS) עם מיקרוסקופ הכוח האטומי מודדת את התגובה של ביומולקולות פרט לכוח, וזאת בניגוד לשיטות אחרות מולקולה בודדת מניפולציה (כלומר פינצטה אופטית), היא אופטימלי לחקר אינטראקציות רצפטור ליגנד זיקה גבוהה בגלל היכולת שלו לחקור את עתיר כוח המשטר (> 120 PN). כאן אנו מציגים הפרוטוקול המלא שלנו ללימוד Cellulמכלולי חלבון osomal ברמת המולקולה בודדת. באמצעות הטופולוגיה חלבון נגזרת מcellulosome הילידים, שעבדנו עם האנזים-dockerin ופחמימות מחייבים מודול-cohesin (CBM-cohesin) חלבוני היתוך, כל אחד עם קבוצת תיאול החופשית נגישה בשאריות ציסטאין מהונדסות. אנו מציגים פרוטוקול קיבוע משטח ספציפי לאתר שלנו, יחד עם המדידה שלנו והליך ניתוח הנתונים לקבלת פרמטרים המחייבים מפורטים למתחם הזיקה גבוהה. אנו מדגימים כיצד לכמת את הכוחות יחיד משנה התגלגלות, כוחות קרע מורכבים, הקינטית מחוץ לשיעורים, ורוחב פוטנציאלי של כריכה היטב. היישום המוצלח של שיטות אלה באפיון האינטראקציה cohesin-dockerin אחראית על הרכבה של קומפלקסי cellulolytic multidomain מתואר נוסף.

מבוא

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים גדולים המוצגים על פני השטח של חיידקים צלולוליטיים אנאירוביים (למשל C. thermocellum) שהתפתחו כדי לבצע דה-פולימריזציה יעילה של ליגנוצלולוז דופן תא הצמח לאוליגוסכרידים מסיסים1. תכונה מרכזית של צלולוזומים היא אינטראקציה גבוהה של קוהיזין-דוקרין. בפרדיגמה הבולטת ביותר, מודול דוקרין מסוג I של 60-75 חומצות אמינו משומר מאוד מוצג בקצה מסוף C של אנזימי החיידקים השונים. מודול הדוקרין מכוון הרכבה של שילובים סינרגטיים של אנזימים על חלבון הפיגום הלא קטליטי ('פיגום'), המורכב מפולי-חלבון של תחומי קוהסין הספציפיים למודול דוקרין מסוג I. ברמות גבוהות יותר, ארכיטקטורת התאית יכולה להיות מורכבת מאוד, המשלבת זוגות חלופיים של קוהיזין ודוקרין (למשל סוג II, סוג III) המעגנים את המבנים למשטח התא ומאפשרים הרכבה של מבנים מסועפים המכילים פיגומים מרובים2. סוגי הקוהסין-דוקרין השונים, למרות שיש להם מבנים קשורים, מציגים ספציפיות קשירה דיפרנציאלית המדכאת תגובתיות צולבת עם פיגומים לא מכוונים או רכיבים ממיני חיידקים אחרים המייצרים תאית. בעוד שגישות ביואינפורמטיות זיהו בהצלחה אלפי מרכיבים תאיים ייחודיים ברמה הגנטית, ידועים מעט יחסית מבני חלבון, והמנגנונים הפועלים בקביעת ספציפיות קוהזין-דוקרין נותרו תחום פעיל במחקר ביולוגיה מבנית.

מאז המצאת מיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM) על ידי ביניג ואחרים.3, מצבי פעולה שונים של AFM פותחו ושופרו ללא הרף, כולל הדמיה ללא מגע, הדמיית מצב תנודה4 וספקטרוסקופיה של כוח מולקולה בודדת (SMFS)5,6. SMFS התפתח לטכניקה בשימוש נרחב לחקירה ישירה של חלבונים בודדים7-11, חומצות גרעין12-15 ופולימרים סינתטיים16-19. בניסוי SMFS טיפוסי לחקירת קשירת קולטן-ליגנד20,21, קצה שלוחה AFM משתנה עם אחד משותפי הקשירה, בעוד שמשטח זכוכית שטוח משתנה עם שותף הקישור המשלים. השלוחה המותאמת באה במגע עם פני השטח ומאפשרת לשותפים להיקשר. לאחר מכן נמשך בסיס השלוחה במהירות קבועה והכוח נמדד בשיטת הטיית המנוף האופטי. עקבות נתוני מרחק הכוח המתקבלות מציגות פסגות דמויות שן מסור אם נוצרה קשירה. במקרים בהם שותפי הקישור מתמזגים לתחומי חלבון מרובים, כל שיא בעקבות מרחק הכוח יכול להיות מתואם להתפתחות של תחום חלבון בודד או תת-תחום מקופל, בעוד שהשיא האחרון מתאים לקרע בממשק קשירת החלבון. המיקומים הספציפיים של האלמנטים העמידים לכוח יכולים לשמש כטביעת אצבע לזיהוי תחומי החלבון השונים המעניינים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור חומצות אמינו חשובות המעורבות בקיפול וייצוב חלבונים. מודלים רבים דווחו בספרות לטיפול בהתנהגות הארכת הכוח האופיינית שנצפתה בניסויי SMFS. הדגמים הנפוצים ביותר כוללים את השרשרת החופשית (FJC) דגם22, השרשרת דמוית התולעת (WLC) דגם18,23-25, והשרשרת המסתובבת בחופשיות (FRC) דגם25,26.

בעבודה הקודמת שלנו11, השתמשנו בספקטרוסקופיה של כוח של מולקולה אחת כדי לחקור את האינטראקציה של מודולי קוהסין ודוקרין. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ניסיוני לפונקציונליזציה של משטח זכוכית ושלוחה עם מבני אנזים-דוקרין וחלבון CBM-cohesin. אנו מציגים גם פרוטוקול SMFS מבוסס AFM הכולל הליכי איסוף וניתוח נתונים. ניתן להכליל בקלות את הפרוטוקול המתואר למערכות מולקולריות אחרות, והוא אמור להיות שימושי במיוחד לחוקרים המעוניינים בזוגות ליגנד קולטנים בעלי זיקה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

סכמה של גיאומטריית המתיחה ששימשה בעבודה זו לבחינת האינטראקציה בין cohesin ל-dockerin מוצגת ב-איור 1A. פרוטוקול קיבוע החלבונים המדווח כאן עבור פונקציונליזציה של הקנטילבר ושל זכוכית הכיסוי הוא גרסה שונה של הפרוצדורה שפורסמה בעבר27. החלבונים בוטאו מוקטורים פלסמידיים ב-E. coli באמצעות שיטות קונבנציונליות. החלבונים תוכננו עם קבוצת תיול נגישה לממס, ששימשה בשילוב עם כימיית maleimide כדי לקשור את החלבון באמצעות קשר thioether יציב למשטח זכוכית הכיסוי ולקנטילבר. שאריות הציסטאין ההנדסיות הן בחלבון המהולחם CBM-cohesin והן בחלבון המהולחם xylanase-dockerin מוקמו לכיוון הצד ה-N-טרמינלי של החלבונים, הרחק מממשק הקישור של cohesin-dockerin11. סקירה מפורטת של הקשירה הכימית ששימשה בקיבוע החלבונים מוצגת ב-איור 1B.

1. הכנת הדגימה

  1. בופרים
    1. הכן תמיסת סליין עם בופר Tris מועשרת בסידן (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl22, pH 7.2
    2. הכן באפר נתרבוראט: 50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      תרשים זרימת התהליך המציג את שלבי הכנת הדגימה מוצג ב- איור 2.
      בעת טיפול בקנטיליברים ובזכוכית כיסוי, מומלץ להשתמש בפינצטות בעלות מנגנון נעילה עצמית.
  2. אמינוסילניזציה של זכוכית כיסוי (בערך 1.5 שעות)
    1. הנח זכוכית כיסוי (קוטר 24 מ"מ, עובי 0.5 מ"מ) בתוך מחזיק PTFE.
    2. בצע סוניקציה לזכוכית כיסוי בתמיסה של אתנול ומים אולטרה-טהורים ביחס של 1:1 (נפח/נפח) למשך 15 דקות.
    3. שטוף את זכוכית הכיסוי במים אולטרה-טהורים.
    4. הנח זכוכית כיסוי בתמיסת פיראנה (1:1 H2SO4 (מרוכז) : H2O2 (30%) (נפח/נפח)) למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטוף היטב במים אולטרה-טהורים. ייבש את זכוכית הכיסוי תחת זרם עדין של N2זהירות: תמיסת פיראנה (piranha solution) היא קורוזיבית ביותר. נדרשים מיגון לעיניים ולעור.
    5. טבול את זכוכית הכיסוי בתערובת של אתנול : מים אולטרה-טהורים : 3-אמינופרופיל דימתיל אתוקסיסילאן ביחס של 45:5:1 (נפח/נפח). הנח על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות (כ-50 סבב לדקה).
    6. טבול את זכוכית הכיסוי באופן רצופי באתנול ובמים אולטרה-נקיים (פעמיים כל אחד). ייבש את זכוכית הכיסוי תחת זרם עדין של N22.
    7. חממו זכוכית כיסוי בתנור (80 °C למשך 30 דקות).
    8. ניתן לאחסן זכוכיות כיסוי שעברו סילניזציה תחת ארגון למשך עד 6 שבועות.
  3. אמינו-סילנזציה של קנטילברים (כ-1.5 שעות)
    הערה: הפרוטוקול המוצג לפונקציונליזציה של הקצוות מתאים לקצוות של קנטילברים מסיליקון.
    1. הנח את הקנטיבלים (cantilevers) על תגית זכוכית נקייה. טפל בהם באמצעות UV-ozone למשך 15 דקות.
    2. טבול את הקנטילברים למשך 3 דקות בתמיסה של אתנול ו-3-aminopropyl dimethyl ethoxysilane ביחס של 1:1 (נפח/נפח), עם כמות קטליטית (0.25%, נפח/נפח) של מים מזוקקים במיוחד (ultrapure water).
    3. שטפו את הקנטילברים (cantilevers) תוך כדי ערבוב עדין, באופן רצף, למשך 60 שניות בכלי ביקר המכילים טולואן, אתנול ומים אולטרה-טהורים. ייבשו את הקנטילברים בזהירות על נייר סינון בין השטיפות.
    4. הניחו לברים (levers) על תבנית זכוכית נקייה ואפתי (80 °C במשך 30 דקות).
  4. רדוקציית גשרי דיסולפיד בחלבונים (כ-3 שעות)
    יש להכין את כל התמיסות כך שיתקבלו בקירוב 30 µl של חלבון מדולל לכל קנטילבר ו- 20 µl של חלבון מהול לכל זכוכית כיסוי. יש לערבב תמיסות חלבון עם ג'ל להפחתת דיסולפיד מסוג Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ביחס של 1:2 (נפח/נפח).
    1. הכינו מנות (aliquots) של חרוזי TCEP להפחתת גשרי דיסולפיד בתוך מבחנות מיקרו (micro-tubes). בעת פיפוט של תמיסת החרוזים (slurry), מומלץ לחתוך את קצות הטיפים של המיקרופיפט בעזרת מספריים כדי להרחיב את קוטר הפתח.
    2. שטפו את תרחיף חרוזי ה-TCEP ב-1 מ"ל של בופר TBS, וסובבו בצנטריפוגה ב-850 rcf למשך 3 דקות.
    3. הסר בזהירות את העלייה (supernatant) והשלך אותה באמצעות מיקרופיפטה.
    4. חזור על שלבים 1.4.2-1.4.3 פעמיים.
    5. יש להוסיף תמיסת חלבון מרוכזת (1-10 מ"ג/מ"ל) לחרוזי ה-TCEP (יחס של 1:2 בין החלבון לתמיחת חרוזי ה-TCEP (נפח/נפח)) ולערבב בעדינות באמצעות קצה של מיקרופיפטה. יש להימנע מהכנסת בועות אוויר.
    6. הנח את תערובת סלסלת חרוזי החלבון/TCEP על רבטטור למשך 2.5 שעות.
  5. פגילציה (PEGylation) של זכוכית כיסוי וקנטיליברים (כשעה וחצי)
    1. לפני המודיפיקציה באמצעות מקשרי NHS-PEG-maleimide, השרו קנטילברים וזכוכית כיסוי שעברו סילנזציה שלוואמינים בבופר סודיום בוראט (pH 8.5) למשך 45 דקות, כדי להסיר פרוטונים מקבוצות אמין ראשוניות על פני השטח.
    2. יש לוודא שמרקחת ה-NHS-PEG-maleimide תגיע לטמפרטורת החדר לפני פתיחת המכסה ושקילת הכמות המתאימה להכנת תמיסה בריכוז 25 mM. יש לאחסן NHS-PEG-maleimide שאינו בשימוש תחת ארגון בטמפרטורה של -20 °Cבקירוב 30 µl של תמיסת פולימר לכל קנטילבר, ו- 90 µl נדרשות 2 זכוכיות כיסוי (המונחות זו על זו בצורה של סנדוויץ').
    3. לאחר שקילת ה-NHS-PEG-maleimide בריכוז של 5 kDa, יש להוסיף באפר בוראט נתרן ולערבב ב-vortex לקבלת תמיסה בריכוז 25 mM.
      הערה: יש להשתמש בתמיסה במהירות רבה ככל האפשר בשל זמן המחצית הקצר ביותר של NHS ב-pH 8.5. יש להשלים את הערבוב בוורטקס (vortexing) ואת העברת הנוזל אל הקנטילברים/זכוכית הכיסוי תוך 1-2 דקות.
    4. דגרו את הקנטילברים ב- 30 µl טיפות של תמיסת NHS-PEG-maleimide בצלחת פטרי. עבור זכוכית כיסוי, הנח 90 µl של תמיסת NHS-PEG-maleimide על זכוכית כיסוי אחת, והוסף זכוכית כיסוי שנייה מעליה כדי ליצור "סנדוויץ'" של זכוכיות כיסוי עם תמיסת NHS-PEG-maleimide במרכז.
    5. דגרו את הקנטילברים/זכוכית הכיסוי עם תמיסת ה-NHS-PEG-maleimide באטמוספירה רוויית מים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  6. צמידת חלבונים (כ-2 שעות)
    קריטי: יש למזער את חשיפתם של הקנטילברים והזכוכיתים למכסה (cover glasses) שעברו פגילציה (PEGylation) לאוויר.
    1. סנטריפוגו את תמיסות חרוזי ה-TCEP/החלבון המופחת ב-100 rcf למשך דקה אחת ואספו את supernatant (הנוזל העליון).
    2. דללו את תמיסת החלבון באמצעות TBS. שאפו לריכוז חלבון בטווח של 0.5-2 מ"ג/מ"ל במהלך הצמדה לפני השטח. הניחו לתמיסות החלבון המדוללות והמורכזות להמתין מספר דקות בזמן שטיפת הקנטילברים וזכוכית הכיסוי.
    3. שטפו את הקנטילברים ואת זכוכיות הכיסוי בשלוש כוסות כימיות עוקבות של מים אולטרה-טהורים.
    4. הסר בזהירות שאריות נוזל מזכוכיות הכיסוי על ידי נגיעה עדינה של הקצוות בנייר סינון תחת זרימה עדינה של N2הסר בזהירות נוזל שיורי מהקנטילברים (cantilevers) באמצעות נגיעה בנייר סינון. מרח מיד תמיסת חלבון מדוללת.
    5. הצמדו זכוכיות כיסוי למחזיק דגימות מתאים התואם את מכשיר ה-AFM.
    6. דגרו זכוכית כיסוי וקנטילברים שעברו פגילציה (PEGylation) עם תמיסות החלבון המדוללות המתאימות בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות.
    7. שטפו את הקנטילברים (cantilevers) בשלוש כוסות כימיות עוקבות עם TBS כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים. השתמשו בפיפטה כדי לשטוף את זכוכית הכיסוי לפחות 10 פעמים.
    8. יש לאחסן את הזרועות הקניטלבריות (cantilevers) ואת זכוכית המכסה ב-TBS לפני המדידה.

2. רכישת נתונים

בעבודה זו, נעשה שימוש ב-AFM28 שנבנה באופן מותאם אישית ונשלט על ידי בקר MFP-3D AFM מבית Asylum Research באמצעות תוכנת Igor Pro שנכתבה במיוחד. סטיית הקנטילבר נמדדת באמצעות שיטת סטיית קרן אופטית29. פרוטוקולי הכנת הדגימות וניתוח הנתונים המוצגים כאן ישימים ללא קשר לדגם ה-AFM המדויק שבו נעשה שימוש. עם זאת, דגם ה-AFM צריך להיות מתאים למדידות בנוזלים ולתמוך בטווח מהירויות נגיש ב-z-piezo של כ-200-5,000 nm/sec.

  1. התקינו את הקנטיבל הפונקציונלי ואת משטח הזכוכית על ה-AFM. לאורך כל הפרוצדורה, יש לשמור על המשטח מכוסה בתמיסת בופר. בעת התקנת הקנטיבל, מזערו את החשיפה לאוויר. לאחר כיוון נכון של קרן הלייזר, המתינו להשגת שיווי משקל במערכת למשך 30 דקות לפחות כדי להפחית השפעות של סחיפה (drift), ובצעו כיוון מחדש במידת הצורך.
  2. הקליטו ספקטרום רעש תרמי כאשר הקנטילבר רחוק מהפני השטח, כלומר בהעדר השפעות שיכוך.
  3. השתמשו בשיטה זעיר-פולשנית, כגון הגישה האקוסטית, כדי לאתר את הפני השטח מבלי לפגוע בקצה הקנטילבר (cantilever) לפני המדידה. במידת האפשר, התקרבו אל פני השטח עם הקנטילבר באופן ידני והשתמשו באוזניות כדי להאזין לרעש התרמי בפלט הסטייה הגולמי (raw deflection output) של בקר ה-AFM. ברגע שהקנטילבר מתקרב אל פני השטח, ניתן לשמוע שינוי מובחן בצליל.
    הערה: קצה הקנטילבר (cantilever) צריך להימצא כעת במרחק של 2-5 µm של פני השטח. אופי השינוי בצליל תלוי בקנטילבר שנעשה בו שימוש. תדר התהודה של הקנטילבר ששימש בעבודה זו הוא כ-25 kHz במים, מעל טווח השמיעה האנושי. בשל אפקטים של ריסון (damping) בקרבת פני השטח, התהודה מוסטת לעבר תדרים נמוכים יותר, מה שמביא את תהודת הקנטילבר לטווח השמיעה. כתוצאה מכך, נתפסת עלייה לכאורה בתדר ובעוצמת הצליל.
    במקרים שבהם פלט שמע של אות הסטייה אינו זמין, ניתן להתקרב אל פני השטח באמצעות ה-z-piezo בעוד משוב פעיל על אות הסטייה מופעל. ברגע שאות הסטייה עולה בכמות מוגדרת כתוצאה מדחיסת פני השטח, תהליך ההתקרבות ייעצר.
  4. קבע את רגישות המנוף האופטי ההפוכה (InvOLS), המייצגת את מרחק התזוזה של הקצה (ב-nm) לכל וולט של אות סטייה. בצע זאת על ידי דחיסת פני השטח באמצעות קצה הקנטילבר. מומלץ להשתמש במתח נקודת סטייה (set point voltage) התואם לתזוזה של קצה הקנטילבר של כ-3 ננומטר (nm).
  5. קבע את קבוע הקפיץ של הקונסול (cantilever) באמצעות התאמה של פונקציית תגובה של מתנד הרמוני פשוט לספקטרום הרעש התרמי, בהתאם למשפט חלוקת השווה.30,31.
  6. הפעילו שגרת ניסוי. עבור עבודה זו, נעשה שימוש בסט פרמטרי המדידה הבא: מהירות התקרבות: 3,000 ננומטר לשנייה; כוח הזנה: 180 פיקו-ניוטון; זמן שהייה על פני השטח: 10 מילי-שניות; מהירויות נסיגה: 0.2, 0.7, 2.0, 5.0 µm/sec עם קצבי דגימה של 2,000, 5,000, 15,000, 20,000 הרצול (Hz) בהתאמה; מרחק נסיגה: 500 ננומטר (nm).
    הערה: אין להגדיר את קצב הדגימה לגבוה מ-10 נקודות/ננומטר (points/nm), כדי למנוע דגימת יתר ולשמור על גדלי נתונים סבירים.
  7. לאחר כל מדידה של עקומת כוח-מרחק, הפעילו את במות הפיאזו (piezo stages) בצירים x ו-y כדי לחשוף נקודה חדשה על פני השטח לפני הקנילבר (cantilever) בכל עקומת כוח-מרחק. טכניקה זו מאפשרת לדגום שטח רחב יותר של פני השטח של זכוכית הכיסוי במהלך מדידות ארוכות טווח.
  8. בצע איפוס מחזורי של במת ההסטה (כלומר (מיקום הפוטודיודה) וגובה שלד ה-z-piezo במהלך מדידות לטווח ארוך, במקרה שסיגנל העקמומיות (deflection signal) סוטה מחוץ לטווח, או שנגמר המגע עם הפני השטח.
  9. עם סיום סדרת המדידות, בצע מדידת InvOLS נוספת עם כוח דחיסה גבוה משמעותית מזה ששימש לפני המדידות, כדי לקבל ערך InvOLS מדויק יותר.
  10. הקליטו ספקטרום רעש תרמי נוסף במרחק רב מהפני השטח. קבעו את קבוע הקפיץ בסוף הריצה הניסויית.

3. ניתוח נתונים

תרשים הזרימה באיור 3 ממחיש את תהליך ניתוח הנתונים. בצע את כל מניפולציות הנתונים באמצעות חבילת תוכנה מתאימה כגון Igor Pro או MATLAB. ראשית, המר את האות הגולמי מהגלאי ליחידות של כוח, ותקן עבור היסט (offset) וסחיפה (drift). לאחר מכן, השתמש במודלים של אלסטיות של ביו-פולימרים כדי לאתר מחסומי אנרגיה במסלולי הפריסה, ולזהות תתי-דומיינים של חלבונים. לבסוף, מתקבלים הפרמטרים הקינטיים והאנרגטיים של האינטראקציה בין הרצפטור לליגנד.

  1. המרה של יחידות ותיקוני נתונים
    1. הכפילו את אות הסטייה הגולמי (וולטים) ב-InvOLS (ננומטר/וולט) ובקבוע הקפיץ (פיקו-ניוטון/ננומטר) כדי להמיר את מתח הגלאי ליחידות של כוח.
    2. בצעו היסט (offset) לנתונים כך שהקנטילבר שאינו עמוס יציג ערך כוח של 0 pN, וזאת על ידי חישוב הממוצע של ערכי הכוח מ-10% האחרונים של עקומת הכוח-מרחק (שנרכשו במרחק המרבי מהמשטח), ולאחר מכן החסרת הממוצע מכל ערכי הכוח בעקומת הנתונים.
    3. הזיזו כל עקבה בכיוון ציר ה-x כך שהחיתוך הראשון עם ציר המרחק יתרחש במרחק של 0 ננומטר.
    4. ה-InvOLS תלוי במיקום נקודת הלייזר על הקנטילבר. אפילו סטיות קטנות במערכת הקריאה האופטית עלולות לגרום לשינויים ניכרים ב-InvOLS כאשר טביעת הרגל של הקנטילבר דומה לגודל נקודת הלייזר. ניתן לתקן זאת באמצעות ניתוח הרעש באות ההסטה בנקודת אפס-כוח. בהנחה שתנאי הסביבה קבועים, הרעש באות ההסטה נמצא ביחס ישר ל-InvOLS.
      1. מדוד את ערך סטיית השורש הממוצע של הריבוע (RMS) (רמת הרעש תחת כוח אפס) של 10% האחרונים מכל עקבה של כוח-מרחק.
      2. שרטטו את הרעש אל מול מספר העקומה והחילו התאמה מתאימה. בדרך כלל מדובר בהתאמה מעריכית בצורה של Exponential decay formula, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), mathematical representation. יעבוד בצורה הטובה ביותר, כאשר N הוא הרעש, ni הוא מספר העקומה, ו-N0 ו-k הם פרמטרי התאמה. התאמה ליניארית עשויה להיות מתאימה גם עבור מערכי נתונים מסוימים.
      3. קבעו מקדם התאמה (SF) עבור כל עקומה:

        משוואה 1:
        static equilibrium equation; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); mathematical formula
        כאשר ni הוא מספר העקומה, nf הוא מספר העקומה הסופי, ו-C הוא ערך היסט (offset).
      4. כעת חלק את כל ערכי הכוח בכל עקומה בנפרד במקדם הנרמול (scaling factor). הליך זה מנרמל כל עקומה לפי היחס בין ערך רעש ה-RMS של העקומה הנוכחית לבין ערך רעש ה-RMS של העקבה (trace) הסופית שנרכשה מיד לפני מדידת ה-InvOLS.
      5. בצע תיקון סטייה (deflection correction) כדי להמיר את ציר המרחק (z) להארכה מולקולרית (z*). פעולה זו מתקנת את כיפוף הקנטילבר תחת הפעלת כוח, אשר מקצר את המרחק בין קצה הקנטילבר לדגימה ביחס לערך המדווח על ידי מיקום חיישן ה-z-piezo.

        משוואה 2:
        Static equilibrium equation, z* = z - F/k, formula; physics calculations, force analysis
        איפה ז הוא מיקום חיישן ה-z שנמדד, ז' הכוח הפועל על הקור התלויה ו- ק קבוע הקפיץ.
  2. ניתוח אורך קונטור
    אורך הקונטור (contour length) של חלבון הוא האורך המקסימלי של שרשרת הפוליפפטיד במצב מתוח. מצב הקיפול של חלבון מתייחס לגיאומטריה שלו ולמרחק שבין קצותיו, הנקבעים על ידי המבנה השניוני והשלישוני. אורך הקונטור של חלבון קשור באופן ישיר למצב הקיפול שלו.9,25,32מיקום קרעים ספציפיים בעקומות כוח-מתיחה משתנה במידה ניכרת עקב פולידיספרסיה של מקשרי PEG, וכן בשל פרמטרים חיצוניים כגון טמפרטורה, תכונות הבופר וקצבי טעינה. דבר זה מקשה על ניתוח ישיר של הנתונים, אך ניתן להתגבר על כך על ידי התמרת נתוני כוח-מתיחה למרחב אורך קונטור. טכניקה זו מאפשרת ביצוע ממוצע על מאגרי נתונים עצומים, ומאפשרת שימוש בזיהוי תבניות אוטומטי כדי לזהות אירועי פריסה (unfolding) אופייניים. לפיכך, ניתן למיין עקומות כוח בודדות בהתאם לסוג האינטראקציה המוצגת. הפרוצדורה הבאה, שתוארה בעבר,25 משמש להמרת נתוני כוח-מתיחה למרחב אורך קונטור.
    1. פתרון מודל ה-WLC (משוואה 3)23 עבור אורך הקונטור L באורך התמדה קבוע p התוצאות במשוואה 4, המספקת את אורך הקונטור (contour length) L(x,u)כאן, נא ספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. האם המרחק ו- u=F*p/kBT, כאשר קילו-בייט הוא קבוע בולצמן ו-T היא הטמפרטורה. ניתן לשקול פתרונות ממשיים בלבד. אילוצים נוספים הם אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם., פ>0, L>0, x>0;

      משוואה 3:
      Force-extension formula, F(x,L), polymer physics equation, illustrates entropic elasticity.

      משוואה 4:
      Static equilibrium, L(x,u), complex formula, educational diagram, analytical expression interpretation.
      שם,
      Polynomial function \( g(u) \) equation, mathematical analysis, symbolic computation.
    2. שרטטו את נקודות הנתונים שעברו טרנספורמציה בגרף של כוח לעומת אורך קונטור. החילו סף כוח של כ-10 pN כדי להסיר רעשים. ניתן להסיר אינטראקציות לא ספציפיות על ידי החלת מסנן אורך מסוג long-pass. הקימו היסטוגרמה של אורכי קונטור.
    3. בצע מתאם צולב33 את ההיסטוגרמות שהתקבלו עם היסטוגרמה של תבנית (template), וביצוע היסט (offset) לאורך ציר ה-x כדי לתקן עבור הפולידיספרסיות של ה-PEG. השתמשו בערכי המתאם שהתקבלו כדי למדוד את הדמיון בין עקומות נתונים בודדות. באופן זה, ניתן למיין את עקומות הנתונים למחלקות שהוגדרו מראש כדי לפשט את הניתוח המשכי.
    4. השתמש בטכניקה דומה כדי למצוא מאפיינים חוזרים בעקבה בודדת באמצעות אוטו-קורלציה, למשל עבור פריסה של מספר דומייני Ig.
    5. מיינו את העקבות באופן ידני כדי לבחון אירועי פריסה (unfolding) אחרים.
  3. ניתוח קצב טעינה
    חלץ מידע קינטי ואנרגטי על דיסוציאציית רצפטור-ליגנד באמצעות החלת מודלים מתאימים על ספקטרום הכוח, כלומר תרשים כוח הקריעה לעומת ln(קצב הטעינה).
    1. עבור מהירות משיכה נתונה, קבע את כוח הקריעה ואת קצב הטעינה עבור אירועי קריעה הרלוונטיים:
      1. בצע התאמת קו גרפי (line fit) לעקומת כוח-זמן בסביבתו של אירוע הקריעה הרלוונטי. קבע את קצב הטעינה משיפוע הקו שהותאם לשיא. חזור על הליך זה עבור כל עקומה המראה את אירוע הקריעה הרלוונטי.
      2. קבע את כוח הקריעה הסבירי ביותר על ידי התאמה גאוסיאנית להיסטוגרמה של כוחות הקריעה. ניתן להשתמש בפונקציות התאמה חלופיות.
      3. קבע את קצב הטעינה הסביר ביותר.
    2. חזור על שלבים 3.3.3.1 - 3.3.3.3 עבור כל מהירויות המשיכה.
    3. שרטט את כוחות הקריעה הסבירים ביותר אל מול הלוגריתם הטבעי של קצבי ההעמסה הסבירים ביותר כדי לקבל את ספקטרום הכוחות.
    4. יש להחיל מודל תיאורטי מתאים על ספקטרום הכוחות כדי להפיק פרמטרים קינטיים ואנרגטיים (איור 4C). במקרים רבים, מודל Bell-Evans הליניארי20,34 ניתן להשתמש בהם והם יניבו אומדנים טובים עבור koff, קצב הדיסוציאציה בהיעדר כוח, ו-Dx, המרחק למצב המעבר לאורך קואורדינטת התגובה, כפי שמוצג במשוואה 5.

      משוואה 5:
      static force equation ⟨F⟩, k_B T/Δx, formula analysis for thermal fluctuation experiments

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השתמשנו בנוהל המתואר כדי לחקור זוג cohesin-dockerin מסוג I מ-C. thermocellum. לאחר קישור מוצלח של זוג ה-cohesin-dockerin, עקומות הכוח-מרחק שהוקלטו הראו דפוסי שיאים אופייניים. עקומה טיפוסית מוצגת ב-איור 4a. כל שיא בעקומה מייצג פתיחה (unfolding) של תת-דומיין חלבוני אחד, כאשר השיא האחרון תואם להתפרקות של קומפלקס הרספטור-ליגנד.

עבור קומפלקס ה-CBM-cohesin-dockerin-xylanase שנחקר בעבודה זו, העלייה הראשונית בכוח תואמת למתיחה של מולקולות מקשר ה-PEG. סדרת ירידות הכוח העוקבת, ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי להשיג נתונים משמעותיים מניסויי ספקטרוסקופיה של כוח מולקולה בודדת, חיוני להשיג גיאומטריות משיכה מוגדרות היטב וניתנות לשחזור. הפרוטוקול המשמש כאן מביא לקיבוע ספציפי לאתר של קומפלקסים חלבונים בגיאומטריית משיכה מוגדרת.

השלוחים ששימשו במחקר זה נבחרו בשל רגישותם לכוח ותדירות התהודה הגבוהה שלהם במים. יתר על כן, עקמומיות הקצה הקטנה של כ-10 ננומטר מועילה לניסויים במולקולה בודדת בשל סבירות מופחתת לאינטראקציות מרובות. עם זאת, טביעת הרגל הקטנה (38x16 מיקרומטר2) של זרוע השלוחה מסבכת את התאמת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מודים למימון ממענק מתקדם של מועצת המחקר האירופית להרמן גאוב. מייקל א. נאש מודה בהכרת תודה על המימון מהחברה במדע - תוכנית המלגות של ברנקו וייס. המחברים מודים לאדוארד באייר, יואב ברק ודניאל ב' פריד ממכון ויצמן למדע על שסיפקו בנדיבות את החלבונים ששימשו במחקר זה. המחברים מודים להרמן א. גאוב, אליאס מ. פוכנר וסטפן ו. שטאל על דיונים מועילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-אמינופרופיל דימתיל אתוקסילאןABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP ג'ל להפחתת דיסולפידThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
tris(hydroxymethyl)aminomethane
BioLever מיני סיליקון ניטריד cantileversאולימפוסBL-AC40TS-C2קבוצות רכות
XYZ מפעילים פיזואלקטרייםPhysik Instrumente GmbH
אינפרא אדום " ספקטרום רחב" לייזר IRSuperlum
MFP-3D AFM בקרAsylum Research
Igor Pro 6.31Wavemetricsרכישת נתונים וניתוח
נתרן כלורי
סידן כלוריד
מד
נתרן בוראט
פינצטה
כיסוי כוסותThermo Scientific, Menzel-Glä סרקוטר 24 מ"מ, עובי 0.5 מ"מ
מחזיק מדגם PTFE בהתאמהאישית
אמבט
אתנולטוהר אנליטי
חומצה גופרתית (מרוכזת)טוהר אנליטי
מי חמצן (30%)טוהר אנליטי
שייקר אורביטלי
טולואןטוהר אנליטי
נייר סינון זכוכית
שקופיות
מיקרו צינורות
מיקרופיפטות
צנטריפוגהמתאימה למיקרו-צינורות
מסובב
צלחות
פטרי
מיקרוסקופ
pHסוניקטורכוסות אופטי

מקורות

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.