יצירת כימרות של כריות שומן בלוטות לימפה לחקר מקור תאי סטרומה של בלוטות הלימפה

Summary

מתואר יצירת כימרות של בלוטות לימפה/כריות שומן לחקר מקור תאי סטרומה של בלוטות הלימפה. השיטה כוללת בידוד של בלוטות לימפה מעכברים שזה עתה נולדו וכריות שומן עובריות, יצירת רפידות שומן של בלוטות לימפה כימריות, והעברתן מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח.

Abstract

הסטרומה היא מרכיב מרכזי במבנה ותפקוד בלוטות הלימפה. עם זאת, מעט ידוע על מקורו, ההרכב הסלולרי המדויק והמנגנונים השולטים בהיווצרותו. בלוטות הלימפה תמיד עטופות ברקמת שומן ולאחרונה הדגמנו את חשיבות הקשר הזה להיווצרות סטרומה של בלוטות הלימפה. תאי מבשר אדיפוציטים נודדים לבלוטת הלימפה במהלך התפתחותה, ועם התקשרות קולטן הלימפוטוקסין-b מכבים את האדיפוגנזה ומתמיינים לתאי סטרומה לימפואידים (Bénézech et al.¹⁴). בהתבסס על פוטנציאל הסטרומה הלימפואידית של רקמת השומן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בכימרה של בלוטות לימפה/כרית שומן המאפשרת מעקב אחר שושלת של מבשרי תאי סטרומה של בלוטות הלימפה. אנו מראים כיצד לבודד בלוטות לימפה שזה עתה נולדו ורקמת שומן עוברית EYFP⁺ וליצור כימרה של כרית שומן LN/EYFP⁺. לאחר העברה מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח, בלוטת הלימפה משלבת תאי מבשר רקמת שומן מקומית ומסיימת את היווצרותה. ניתוח צאצאים של תאי כרית שומן EYFP⁺ בבלוטות הלימפה המתקבלות יכול להתבצע על ידי ניתוח זרימה-ציטומטרי של בלוטות לימפה מעוכלות אנזימטית או על ידי ניתוח אימונופלואורסצנטי של הקפאות בלוטות לימפה. על ידי שימוש ברפידות שומן מדגמי עכברי נוקאאוט שונים, שיטה זו תספק דרך יעילה לנתח את מקורן של אוכלוסיות תאי הסטרומה השונות של בלוטות הלימפה.

Introduction

בלוטות לימפה (LNs) הן איברי מפתח של מערכת החיסון הממוקמים באתרים אסטרטגיים בגוף, לאורך רשת כלי הדם הלימפטיים. הם מאפשרים סינון של אנטיגנים ופתוגנים ומספקים אתר להצגת אנטיגן ללימפוציטים ואינדוקציה של תגובות חיסוניות נרכשות. הסטרומה, היוצרת את המבנה הבסיסי של ה-LN ומתזמרת את התנועה של המשתתפים ההמטופויאטיים השונים של התגובה החיסונית הנרכשת, היא מרכזית לתפקוד האיברים הללו. אוכלוסיות שונות של תאי סטרומה מספקות רמזים חיוניים וספציפיים לתנועות, לוקליזציה, הישרדות, התפשטות והתבגרות של המרכיב ההמטופויאטי של מערכת החיסון^1-3. תאי סטרומה LN בוגרים מתחלקים לשלוש קטגוריות: תאי האנדותל של הדם, תאי האנדותל הלימפטי והפיברובלסטים. שלוש הקטגוריות הללו מקיפות אוכלוסיות הטרוגניות. האוכלוסיות הפיברובלסטיות מכילות תאים רשתיים פיברובלסטיים (FRC), תאים דנדריטיים זקיקים (FDC), תאים רשתיים שוליים (MRC), בעוד שהפיברובלסטים היוצרים את הקפסולה, המדולה ותאים אחרים שעדיין לא זוהו^1-5. המקורות והמנגנונים השולטים בהתבגרות של אוכלוסיות תאי הסטרומה השונות של LN אינם ברורים והיעדר סמנים ספציפיים המאפשרים מיפוי גורל של אוכלוסיות ספציפיות של תאי סטרומה LN מקשה במיוחד על מחקרם. עם זאת, הבנה מלאה של האונטוגניה של תאי סטרומה LN נחוצה להבנת התגובות החיסוניות הנרכשות, המנגנונים התורמים לסבילות והיא הבסיס להתפתחות LNs מלאכותיים.

עד כה, חקר המקור וההתפתחות של תאי סטרומה LN הוגבל בעיקר להערכה ישירה של התפתחות LN בעוברים ויילודים בעכברים מסוג בר וזני עכברים שונים^6-9. גישות אלה מוגבלות על ידי הקטלניות העוברית וסביב הלידה של חלק מזני העכברים הנושאים מחיקות בגנים החשובים להתפתחות LN. יתר על כן, חלק מהגנים החיוניים להתפתחות רקמת הלימפה מעורבים גם במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כפי שקורה בדרגה^10-11 או NF-κB2¹². כדי לטפל בבעיות אלה, בוצעו בידוד והשתלה של LNs עובריים מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח^12-13. טכניקה זו מאפשרת, למשל, העברה של LNs עובריים מהונדסים גנטית בסביבה מסוג בר כדי להעריך את התפתחות האיברים ואת הגיוס והארגון של תאים מארחים. עם זאת, הצמיחה של LN עוברי המושתל מתחת לקפסולת הכליה של מארח בוגר נפגעת, ובכך מגבילה את השימוש בטכניקה זו.

LNs ומרבצי שומן קשורים קשר הדוק מבחינה אנטומית והם מתפתחים בו זמנית במהלך האמבריוגנזה. לאחרונה הראינו כי הקשר LN/רקמת שומן ממלא תפקיד מכריע באספקת אבות תאי סטרומה עבור ה-LNs. בפרט, איתות דרך ה-LTβR שולט בגורלם של תאי מבשר שומן על ידי חסימת אדיפוגנזה ובמקום זאת קידום התבגרות לקראת פנוטיפ תאי סטרומה LN¹⁴. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על יצירת כימרות של כריות LN-שומן המאפשרות מעקב אחר תאים שמקורם ברקמת השומן ב-LN המתפתח. שיטה זו תהיה שימושית לקביעת התרומה של רקמות שומן לאוכלוסיות שונות של תאי סטרומה LN ובשילוב עם שימוש ברקמות מזני עכברים מהונדסים גנטית, תאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים השולטים בהתמיינות של תת-קבוצות תאי הסטרומה השונות של LN.

Protocol

עכברים גודלו והוחזקו בתנאי SPF ביחידת השירותים הביו-רפואיים באוניברסיטת ברמינגהם על פי תקנות משרד הפנים הבריטי וועדת האתיקה המקומית. כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה מכוסים תחת רישיון פרויקט שאושר הן על ידי ועדת האתיקה המקומית והן על ידי משרד הפנים.

1. בידוד של LNs שזה עתה נולדו

1. הקריבו את העכברים שזה עתה נולדו על ידי פריקת צוואר הרחם.
2. חתכו את הראש, ופתחו את הגוף במספריים מהחלק העליון של אזור בית החזה לתחתית אזור הבטן והוציאו בזהירות את כל הקרביים (לב, ריאות, כבד, מעיים, כליות, שלפוחית השתן) מחלל הבטן.
3. העבירו את הגופה לצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ המכילה חומר RF10 (חומר RPMI1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין). משלב זה ואילך, הרקמות יישמרו בתנאים סטריליים ויטופלו במכסה המנוע של תרבית רקמות.
4. העבירו את הגוף לצלחת פטרי חדשה בקוטר 90 מ"מ המכילה RF10.
5. תחת המיקרוסקופ המנתח, נתק בזהירות את הצפק מהעור באזור המפשעה. ה-LN המפשעתי ממוקם בצומת של שלושה כלי דם בכרית השומן.
6. הסר בזהירות את ה-LN. ודא שכל רקמת השומן מוסרת. העבר את ה-LN לצלחת פטרי בגודל 50 מ"מ המכילה מדיית RF10. שמור את הרקמות על קרח תוך כדי המשך ההליך.

2. בידוד של רפידות שומן E18.5

1. כדי לייצר עוברי עכברים ביום ה-18.5 להריון (E18.5), הגדירו הריונות מתוזמנים על ידי הצבת נקבה ועכבר זכר לכל כלוב למשך הלילה. הפרד את העכברים בבוקר ובדוק אם יש פקקים בנרתיק (יום ההריון E0.5).
   1. המתת חסד של הנקבות הסתומות ביום ה-18.5 להריון על ידי פריקת צוואר הרחם.
   2. הוציאו את העוברים והניחו אותם בצלחת פטרי 90 מ"מ המכילה RF10.
2. משלב זה ואילך, יש לטפל ברקמות בטכניקה סטרילית במכסה המנוע. מתחת למיקרוסקופ הניתוח, חתכו את הראש, פתחו את העוברים במספריים מאזור בית החזה לתחתית אזור הבטן והוציאו בזהירות את כל הקרביים (לב, ריאות, כבד, מעיים, כליות, שלפוחית השתן) מחלל הגוף.
3. נקו את הגוף מכל הרקמות הקרביות שנותרו ושטפו אותו ב-PBS כדי לחסל את כל עקבות הדם שעלולים להקשות על הדיסקציה.
4. העבירו את הגופות הנקיות לצלחת פטרי טרייה בקוטר 90 מ"מ המכילה RF10.
5. נתק בזהירות את הצפק מהעור באזור המפשעה. ה-LN המפשעתי ממוקם בצומת של שלושה כלי דם בכרית השומן.
6. הסר בזהירות את ה-LN והשליך אותו. חשוב מאוד להסיר לחלוטין את ה-LN כדי להבטיח שכרית השומן המשמשת לכימרות אינה מזוהמת על ידי תאי סטרומה לימפואידים.
7. הסר את כרית השומן המפשעתי והעביר אותה לצלחת פטרי 50 מ"מ המכילה מדיה RF10. שמור את הרקמות על קרח תוך כדי המשך ההליך.

3. יצירת הכימרה של LN-fat Pad

1. הכן את מערכת תרבית האיברים במבחנה ¹⁵.
   1. הכנת ספוג ומסננים: ניתן לעשות זאת מראש וספוגים ומסננים מאוחסנים סטריליים בצלחת פטרי במכסה המנוע.
      1. חותכים את עטיפת הוולקן ל 1-1.5 ס"מ² חלקים
      2. מרתיחים את הספוגים במשך שעתיים במים מזוקקים.
      3. הניחו לספוגים להתייבש מספר שעות במכסה המנוע של תרבית התאים.
      4. מרתיחים את המסננים למשך 20 דקות.
      5. תן למסננים להתייבש מספר שעות במכסה המנוע של תרבית התאים.
   2. הכן מדיה DMEM משלימה עם 10% סרום בקר עוברי, 10 מ"מ HEPES, תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 1x MEM, 50 מ"מ 2-מרקפטואתנול, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין.
   3. מוסיפים 2 מ"ל מדיה בצלחת פטרי 50 מ"מ.
   4. מסדרים ספוג אחד בתחתית צלחת הפטרי. הרטיבו את שני צידי הספוג על ידי טבילתם במדיה.
   5. הניחו פילטר אחד על גבי הספוג. המסנן ממוקם בממשק נוזל-אוויר.
2. תחת המיקרוסקופ המנתח, קשר בזהירות LN יילוד אחד עם כרית שומן עוברית אחת.
3. הנח את הכימרה של כרית LN-fat על גבי המסנן.
4. מעבירים את צלחת הפטרי בקופסת פלסטיק מלבנית עם כמה חורים על המכסה ומכילה מים בתחתית כדי להבטיח לחות.
5. אטום את המכסה לקופסה בעזרת סרט. השאירו את שני החורים במכסה פתוחים.
6. העבירו את הקופסה לחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. הניחו לקופסה להתייצב למשך שעתיים, לפני שאטמו את החורים במכסה בעזרת סרט.
7. דגרו על הרקמות למשך יומיים לפחות כדי לאפשר ל-LN להיצמד לכרית השומן ולהיות ניתנת להעברה מתחת לקפסולת הכליה.

4. העברת כימרה של כרית LN-שומן מתחת לקפסולת הכליה של עכברים מארחים

1. אספו את כימרות כריות השומן LN מהפילטר והעבירו אותן מתחת לקפסולת הכליה של עכברים מארחים. שיטת העברת קפסולת הכליה כבר תוארה ¹⁶.

5. בידוד ה-LNs המועברים

1. לאחר 3-4 שבועות מתחת לכמוסת הכליה, הכימרות של רפידות השומן LN מוכנות לקציר. המתת חסד של העכברים המארחים באמצעות הדרכה מאושרת.
2. הסר את הכליה מהעכברים המארחים.
3. תחת מיקרוסקופ הניתוח, בודדו את כימרה של כרית LN-שומן ונתחו את ה-LN.

6. עיכול אנזימטי של ה-LNs המועברים לניתוח זרימה-ציטומטרי

1. בצע חתך אחד ב-LN עם מספריים קטנים כדי לאפשר לאנזימים לחדור לאיבר ולהקל על העיכול.
2. יש להניח LN אחד ב-1.5 מ"ל Eppendorf המכיל 600 מיקרוליטר של מאגר עיכול (RPMI 1% FCS, 2.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז D, 100 מיקרוגרם/מ"ל DNase I).
3. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על בלוק תרמי מתסיס. פיפטה למעלה ולמטה כדי לסייע בדיסוציאציה של רקמות כל 10 דקות.
4. הוסף 6 מיקרוליטר EDTA 0.5 M לצינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לסיים את הדיסוציאציה של הרקמות.
5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-490 x גרם.
6. השהה מחדש את כדורית התא בתמיסת הצביעה (PBS, 0.1% BSA, 5% סרום חולדות ו-5% סרום עכבר) המכילה שילוב של נוגדנים ראשוניים.
7. דגירה למשך 30 דקות על קרח.
8. שטפו פעמיים ב-PBS
9. דגירה עם נוגדנים משניים למשך 20 דקות במידת הצורך.
10. שטפו פעמיים ב-PBS.
11. לנתח על ציטומטר זרימה.

7. ניתוח ה-LNs המועברים על ידי אימונופלואורסצנציה

1. קיבוע לשימור EYFP בתהליך ההקפאה והקריוסקציה: מניחים את ה-LN בתמיסה של PBS, 4% PFA ו-10% סוכרוז ומשאירים למשך 3-4 שעות.
2. שים טיפה אחת קטנה של תרכובת O.C.T. קרה על חתיכה קטנה של נייר אלומיניום. הימנע מבועות אוויר. הנח בזהירות את ה- LN ללא נוזלים באמצע הטיפה.
3. הקפיאו את האיבר על ידי הנחת נייר האלומיניום על קרח יבש.
4. חותכים קטעים של 8-10 מיקרומטר על שקופיות זכוכית דביקות נוספות באמצעות קריוסטט. הניחו לשקופיות להתייבש במשך שעתיים לפני שמאחסנים אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
5. הליכי הצביעה יכולים להשתנות בהתאם לנוגדנים העיקריים בהם נעשה שימוש וניתן לייעל אותם מהפרוטוקול הבא. צבעו את החלקים בתמיסת צביעה (PBS, 1% BSA) המכילה שילוב של נוגדנים ראשוניים.
6. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
7. יש לשטוף פעמיים ב-PBS למשך 5 דקות
8. דגירה עם נוגדנים משניים למשך שעה.
9. יש לשטוף פעמיים ב-PBS למשך 5 דקות.
10. הרכיב שקופיות במדיית הרכבה המכילה DAPI.
11. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי.

Results

שלושה שבועות לאחר ההשתלה, כימרה של LN/כרית שומן מתאוששת מהכליה. כיום הכימרה דומה מאוד ל-LN רגיל בכרית השומן שלה, וה-LN נראה במרכז רקמת השומן (איור 1). אם לא ניתן לזהות את ה-LN, ייתכן שהוא אבד במהלך ההשתלה בכליה. כאשר מעריכים את תפקידם של גנים בעלי פוטנציאל חשוב בהתפתחות LN, ה-LNs ששוחזרו עשויים להישאר קטנים מאוד וקשה יותר למצוא. זה המקרה כאשר רקמת שומן מעכברי LTβR^-/- קשורה מחדש ל-LNs¹⁴ שזה עתה נולדו.

בידוד זהיר של ה-LN מאפשר ניתוח נוסף של הצאצאים של תאים ...

Discussion

במאמר זה הצגנו שיטה לבדיקה וכימות של תרומתם של תאי אב של רקמת שומן ל-LNs המתפתחים ושתי טכניקות המאפשרות ניתוח צאצאיהם. דיסקציה של רפידות שומן עובריות ו-LNs של יילודים הם עדינים ודורשים מיומנויות ידניות שנרכשו על ידי תרגול רב לפני יצירת הכימרה של כרית LN-שומן בפועל. כדי לשלוט באיכות הדיסקציות, ניתן לבצע ניתוח זרימה-ציטומטרי על רפידות השומן וה-LNs. הכנת כרית שומן עוברית צריכה להיות נטולת בלוטות לימפה ולא להכיל תאים משרה רקמת לימפה CD45⁺CD4⁺IL-7Ra⁺. תכשירי LN לתינוקות צריכים להיות נקיים לחל...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M3148
50 מ"מ צלחת פטרי סטרילין	אפלטון	וודס SC265
90 מ"מ צלחת פטרי סטרילין	אפלטון וודס	SC260
שקופיות דבק	Surgipath	00202
נגד עכבר CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
נגד עכבר CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
נגד עכבר CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
נגד עכבר IgM רודמין אדום	Stratech	715-296-020-JIR
נגד עכבר פודופלנין PE/Cy7	Biolegend	127411
נגד עכבר פודופלנין מטוהר	eBioscience	14-5381
קולגנאז D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 מלקחיים Inox Biologie	FST	11252-20	מלקחיים עדינים במיוחד לדיסקציה עוברית ויילודים
תמיסת EDTA 0.5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
סרום בקר עוברי	Sigma	F9665
מספריים קשתית עדינה מוקשחת ישר 11 ס"מ	FST	14090-11	מספריים קטנים לדיסקציה
תמיסת HEPES	Sigma	H0887
מסנני ממברנה איזופור 0.8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
תמיסת L-גלוטמין	Sigma	G7513
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. תרכובת	רקמה-טק	4583
פניצילין-סטרפטומיצין	Sigma	P4458
קופסת פלסטיק עם מכסה	ווטקינס ודונקסטר	E6052	קופסת סנדוויץ' לתרבית איברים in vitro. קדחו שני חורים במכסה כדי לאפשר חילופי גזים בחממת CO2.
RPMI 1640 בינוני	סיגמא	R0883
ספוגים וולקן עטיפה תחתונה	פטרסון	004383
רפואי סטריאומיקרוסקופ	Leica	LEICA MZ95	מיקרוסקופ ניתוח עם זום
תרמומיקסר	Eppendorf	5436
Vectashield הרכבה בינונית עם DAPI	Vector Laboratories	H-1200